我国是世界养羊大国，然而不是强国，随着肉羊的舍饲设施规模化进程，饲粮配方是关键技术之一，营养水平需要量和饲料的营养价值是动物饲粮配制不可缺少的基础数据^[1]。粗饲料是反刍动物重要的营养源，合理、高效利用粗饲料也是促使我国畜牧业可持续发展的科学之路。评定饲料营养价值的基础在于对其代谢能(ME)的测定和计算。因此，有必要寻找一种能够准确、客观评定单一的粗饲料原料ME的方法，这对准确建立反刍动物饲料营养水平数据库、优化饲粮配方、降低饲养成本具有重要意义。世界各国关于反刍动物饲料有效能值评定方法的研究报道各有特点，尤其是测定方法的可操作性、重复性等难以满足饲料原料有效能值准确评定的要求。体内法中的直接法与替代法是原料能值评定的经典的方法^[2]。已有报道，兔饲料原料的能值采用替代法测定值精确度更高^[3]；仔鸡、成年鸡、产蛋鸡单一饲料ME适合用替代法来测定^{[4, 5, 6]}；猪饲料原料的净能^[7]、消化能(DE)^[8]也采用了替代法来测定。目前，对于反刍动物粗饲料原料营养水平评定上，大多采用体外法、半体内法对其营养物质含量、各营养物质降解率等进行评定，对粗饲料原料营养物质可利用性的研究较少，已有的对单一的粗饲料原料的有效能值评定的报道中多是采用数学公式推算或是体外法估测所得。而评定一种饲料的营养水平最准确、最直观的方法就是动物试验，体内法和半体内法均需要试验动物，半体内法由于自身的局限性，不适用于单一粗饲料原料ME的评定。而采用体内法对单一的粗饲料原料ME进行评定，在反刍动物方面鲜有报道，鉴于肉羊复杂的瘤胃结构、粗饲料自身的特点，因此有必要探究直接法与替代法在反刍动物单一粗饲料能值评定上的应用。本试验以羊草为试验原料，以体重为45.0 kg的杂交肉用羯羊为试验动物，分别通过直接法和替代法测定羊草在成年肉用羯羊上的DE、ME以及各种营养成分的表观消化率，研究这2种方法对羊草ME测定结果的影响，为评定肉羊单一粗饲料能值提供方法学上的科学数据。

消化代谢试验和气体代谢试验于中国农业科学院南口中试基地进行，样品分析试验在中国农业科学院饲料研究所家畜营养与饲料研究室进行。试验选用初始重为(45.00±1.96) kg的体况良好的杜泊×小尾寒羊F1代杂交肉用羯羊30只，分为5个处理，每个处理6个重复，每个重复1只羊，单独圈养于不锈钢羊栏(3.2 m×0.8 m)中。

直接法和替代法所使用的饲粮，参照NRC(2007)^[9]40～50 kg成年肉用公羊1.3倍维持需要配制。直接法为全羊草饲粮；替代法分别为基础饲粮和3个试验饲粮，试验饲粮分别以60%、40%、20%羊草替代基础饲粮，分别记为60%组、40%组和20%组。试验所用饲粮全部制成颗粒状饲料(饲料颗粒直径4.5 mm，长10 mm)，饲粮组成及营养水平见表1。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (DM basis) % 项目 Items 全羊草饲粮 Full Leymus chinensis diet 替代比例 Substitution proportion/% 0 60 40 20 原料 Ingredients 玉米 Corn 28.54 11.42 17.12 22.83 豆粕 Soybean meal 18.24 7.30 10.94 14.59 羊草 Leymus chinensis 97.81 50.68 78.74 69.40 60.04 磷酸氢钙 CaHPO4 1.45 1.00 1.00 1.00 1.00 石粉 CaCO3 0.80 0.80 0.80 0.80 食盐 NaCl 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 预混料 Premix1) 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 有机物 OM 88.72 90.51 89.84 90.45 90.16 粗蛋白质 CP 7.66 15.52 10.87 12.54 14.05 粗脂肪 EE 1.99 1.92 2.05 2.13 2.18 中性洗涤纤维 NDF 65.88 43.22 57.15 51.23 47.34 酸性洗涤纤维 ADF 39.39 22.89 37.20 28.02 24.68 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets：Cu 16.0 mg，Fe 60.0 mg，Mn 40.0 mg，Zn 70.0 mg，I 0.80 mg，Se 0.30 mg，Co 0.30mg，VA 12 000 IU，VD 5 000 IU，VE 50.0 mg。 2)实测值 Measured values。

表1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (DM basis)

试验期19 d，分为预试期10 d，正试期9 d，正试期中气体代谢试验3 d，消化代谢试验6 d。在预试前通过饲喂基础饲粮确定日增重为0 g/d的维持需要采食量，试验羊采用限饲的方法(每种饲粮1 200 g/d)，每天08：00、18:00各喂600 g饲粮，全天自由饮水。消化代谢试验采用由中国农业科学院饲料研究所设计并制作的代谢笼，含有能将粪便与尿液自动分离的装置，采用全收粪尿法收集粪、尿，每天称取并记录每只羊排粪量，按10%取样，将每只羊6 d的粪样混合冷冻保存，用盛有100 mL10% H₂SO₄的塑料桶收集尿液，稀释至5 L(防止贮存中有尿酸沉淀)，对稀释尿液充分混合，用纱布过滤后每天取样20 mL，将每只羊6 d的尿样混合后于-20 ℃冰箱保存，在此期间，气体代谢试验采用Sable开路式循环气体代谢系统、LGR气体分析仪测定甲烷产量，此系统连接6个气体代谢箱，可同时测定6只试验羊甲烷产量，将试验羊分5批次移入气体代谢箱，每批次测定同一处理的6只试验羊，进入代谢箱后适应24 h，测定随后48 h的甲烷排放量(包括呼吸道和消化道及体表排出的甲烷)，用于计算饲粮ME。在消化试验结束时，将收集的每只羊粪混合后置于65 ℃烘箱中48 h，回潮48 h后称重用于计算初水分含量，在将粪样粉碎过40目网筛制成分析样品，以备分析检测。

饲粮、原料和粪样中的干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗灰分(ash)和总能(GE)，以及原料中钙(Ca)和磷(P)含量测定依据《饲料分析及饲料质量检测技术》^[10]。

采用Sable开路式呼吸测热系统测定甲烷产量。将试验羊称重后移入气体代谢箱，待试验羊适应后测定48 h甲烷产量(L)。

尿能：取5块定量滤纸分别测定能值，计算出滤纸的平均能值。将10 mL尿液分多次滴在滤纸上，65 ℃烘干后于IKA C2 000氧弹式热量测定仪中测定，得到滤纸和尿液的能值。

尿能=滴加尿液后滤纸能值-滤纸能值；

甲烷能(CH₄-E,kJ)=甲烷产量(L)×

39.54(kJ/L)^[11]；

ME=GE-粪能-尿能-CH₄-E。

饲粮及原料营养物质全肠道表观消化率计算方法参照Adeola^[12]的公式：

饲粮营养物质全肠道表观消化率(%)=

100×(食入的营养物质量-

粪中该营养物质含量)/食入的营养物质量；

原料营养物质全肠道表观消化率(%)=

100×[试验饲粮营养物质全肠道表观消化率-

(1-X)×基础饲粮中

该营养物质全肠道表观消化率]/X。

式中：X为待测原料替代基础饲粮比例(%)。

替代法测定原料能值的计算公式参照刘德稳^[7]、陶春卫^[13]的公式：

待测原料能值(MJ/kg DM)=100×[试验饲粮

能值-(1-X)×基础饲粮能值]/X。

式中：X为待测原料替代基础饲粮比例；待测原料能值可为DE、ME。

试验数据采用SAS 9.2统计软件中ANOVA过程进行方差分析，并进行Duncan氏法多重比较检验，P＜0.05 为差异显著。

羊草营养水平见表2。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 羊草营养水平(干物质基础) Table 2 Nutrient levels of Leymus chinensis (DM basis) % 项目 Items 含量 Content 干物质 DM 91.13 有机物 OM 87.62 粗蛋白质 CP 7.64 粗脂肪 EE 1.94 中性洗涤纤维 NDF 64.87 酸性洗涤纤维 ADF 40.24 磷 P 0.19 钙 Ca 0.46 总能 GE/(MJ/kg) 16.29

表2 羊草营养水平(干物质基础) Table 2 Nutrient levels of Leymus chinensis (DM basis)

由表3可知，DM、OM、CP、GE的全肠道表观消化率：基础饲粮组>20%组>40%组>60%组>全羊草饲粮组,组间差异显著(P<0.05)，但各组饲粮NDF全肠道表观消化率差异不显著(P>0.05)。

表 3

Table 3

表 3(Table 3)

表 3 直接法与替代法测定的肉羊饲粮营养物质表观消化率 Table 3 Nutrient apparent digestibility of diets of mutton sheep determined by direct and substitution methods % 项目 Items 全羊草饲粮 Full Leymus chinensis diet 替代比例 Substitution proportion/% 标准误 SEM P值 P-value 0 60 40 20 干物质 DM 45.92e 60.64a 48.82d 53.90c 57.46b 1.06 <0.001 有机物 OM 49.91e 63.14a 52.90d 56.46c 60.05b 1.00 <0.001 粗蛋白质 CP 47.15e 71.97a 58.42d 63.24c 67.86b 1.83 <0.001 总能 GE 49.11e 65.25a 52.59d 57.42c 61.99b 1.18 <0.001 中性洗涤纤维 NDF 44.55 43.40 43.33 42.84 44.06 0.39 0.691 同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，无字母或字母相同表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 Values in the same row with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05),while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 直接法与替代法测定的肉羊饲粮营养物质表观消化率 Table 3 Nutrient apparent digestibility of diets of mutton sheep determined by direct and substitution methods

由表4可知，各饲粮粪能、CH₄-E、DE、ME出现显著差异(P<0.05)，而尿能无显著差异(P>0.05)。粪能：全羊草饲粮组(10.11 MJ/d)>60%组(9.53 MJ/d)>40%组(8.63 MJ/d)>20%组(7.64 MJ/d)>基础饲粮组(7.05 MJ/d)，组间差异显著(P<0.05)。CH₄-E：基础饲粮组(1.58 MJ/d) 与40%组CH₄-E(1.57 MJ/d)显著高于20%组 (1.40 MJ/d)、60%组(1.35 MJ/d)、全羊草饲粮组(1.29 MJ/d)(P<0.05)。DE与ME：基础饲粮组(12.27与9.66 MJ/kg DM)> 20%组(11.54与9.13 MJ/kg DM)>40%组(10.78与8.44 MJ/kg DM)>60%组(9.70与7.65 MJ/kg DM)>全羊草饲粮组(8.76与6.81 MJ/kg DM),组间差异显著(P<0.05)。

表 4

Table 4

表 4(Table 4)

表 4 直接法与替代法测定的肉羊饲粮能值 Table 4 Energy values of diets of mutton sheep determined by direct and substitution methods 项目 Items 全羊草饲粮 Full Leymus chinensis diet 替代比例 Substitution proportion/% 标准误 SEM P值 P-value 0 60 40 20 粪能 FE/(MJ/d) 10.11a 7.05e 9.53b 8.63c 7.64d 0.21 <0.001 尿能 UE/(MJ/d) 0.88 1.05 0.88 0.95 1.20 0.04 0.650 甲烷能 CH4-E/(MJ/d) 1.29c 1.58a 1.35bc 1.57a 1.40b 0.04 <0.001 消化能 DE/(MJ/d) 9.76e 13.24a 10.57d 11.64c 12.46b 0.24 <0.001 代谢能 ME/(MJ/d) 7.59e 10.61a 8.34d 9.12c 9.86b 0.20 <0.001 消化能 DE/(MJ/kg DM) 8.76e 12.27a 9.70d 10.78c 11.54b 0.25 <0.001 代谢能 ME/(MJ/kg DM) 6.81e 9.66a 7.65d 8.44c 9.13b 0.21 <0.001 代谢能与消化能比 DE ∶ ME/% 77.73 78.73 78.87 78.29 79.12 0.52 0.351

表4 直接法与替代法测定的肉羊饲粮能值 Table 4 Energy values of diets of mutton sheep determined by direct and substitution methods

由表5可知，各组羊草CP、NDF全肠道表观消化率差异不显著(P>0.05)。直接法中全羊草饲粮组的DM、OM、GE表观消化率显著高于替代法的60%组(P<0.05)，而与40%组、20%组之间差异不显著(P>0.05)，其中20%组更接近全羊草饲粮组。全羊草饲粮组DE(8.95 MJ/kg DM)显著高于60%组(7.98 MJ/kg DM)(P<0.05)，与40%组(8.56 MJ/kg DM)、20%组(8.62 MJ/kg DM)之间差异不显著(P>0.05)，其中20%组更接近全羊草饲粮组；直接法中全羊草饲粮组ME(6.96 MJ/kg DM)与60%组ME(6.31 MJ/kg DM)差异显著(P<0.05)，与40%组(6.61 MJ/kg DM)和20%组(7.01 MJ/kg DM)之间无显著差异(P>0.05)，其中20%组最接近全羊草饲粮组。同时代谢能与消化能比(ME ∶ DE)2种方法的各组之间亦无显著差异(P>0.05)。这就提示我们，在采用替代法计算羊草的ME时，羊草替代比例以20%为宜。

表 5

Table 5

表 5(Table 5)

表 5 直接法与替代法测定的肉羊羊草营养物质表观消化率及能值 Table 5 Nutrient apparent digestibility and energy values of Leymus chinensis of mutton sheep determined by direct and substitution methods 项目 Items 全羊草饲粮 Full Leymus chinensis diet 替代比例 Substitution proportion/% 标准误 SEM P值 P-value 60 40 20 表观消化率 Apparent digestibility 干物质 DM/% 48.95a 40.46b 45.80ab 46.74ab 0.57 0.041 有机物 OM/% 50.03a 45.77b 46.54ab 47.68ab 0.52 0.034 粗蛋白质 CP/% 48.20 49.39 50.15 51.42 0.90 0.053 总能 GE/% 45.06a 39.19b 42.31ab 43.26ab 0.81 0.047 中性洗涤纤维 NDF/% 45.53 42.65 42.01 46.72 1.30 0.551 能值 Energy value 消化能 DE/(MJ/kg DM) 8.95a 7.98b 8.56ab 8.62a 0.43 0.032 代谢能 ME/(MJ/kg DM) 6.96a 6.31b 6.61ab 7.01a 0.35 0.027 代谢能与消化能比 DE ∶ ME/% 77.76 79.87 77.21 81.32 0.76 0.415

表5 直接法与替代法测定的肉羊羊草营养物质表观消化率及能值 Table 5 Nutrient apparent digestibility and energy values of Leymus chinensis of mutton sheep determined by direct and substitution methods

饲料中的能量是畜禽所需营养物质的来源，营养物质在被动物采食、消化、吸收、代谢过程中伴随一部分能量的损失。粪能是饲料能量损失的最大部分，5组饲粮全羊草饲粮组粪能最大，其次是60%组、40%组、20%组、基础饲粮组。基础饲粮的DE和ME分别高于全羊草饲粮组、60%组、40%组、20%组，究其原因在于其饲料原料组成的差异。由于各种饲料所含营养物质消化率的差异，导致其有效能不同。饲料原料组成是影响饲料能值的主要因素，易消化的蛋白质和难消化的纤维素都可以产生较大的影响^[13]。饲料中纤维含量与ME呈高度的负相关。本试验5组饲粮中全羊草饲粮组NDF含量最高，其次是60%组、40%组、20%组、基础饲粮组，而它们的DE、ME逐渐变大。本试验的结果与刘洁^[14]的研究结论吻合。5组饲粮中CH₄-E差异显著，影响CH₄-E的因素很多^{[15, 16]}，本研究中CH₄-E从大到小依次是基础饲粮组、40%组、20%组、60%组、全羊草饲粮组。CH₄-E占DE的比例为11.23%～13.38%，Tamminga^[17]研究表明通常情况下奶牛瘤胃中有8%～12%的DE转变成甲烷而损失掉。而赵一广^[18]在肉用绵羊的研究中其CH₄-E占DE的比例是10.76%～12.27%，本研究在与其饲粮组成成分一致、精粗比接近的情况下，所得结果与上述研究存在差异。究其原因除了所用原料营养价值不一外，还可能由于赵一广^[18]在研究中甲烷测定采用的是呼吸测热头箱，仅测定了羊只通过嗳气由口鼻中排出甲烷，未能实时测定由直肠排出的甲烷。而本试验甲烷测定采用的是呼吸代谢箱实时监测48 h。

饲粮营养物质表观消化率是反映羊对饲粮营养物质利用及机体生理状态的重要指标。饲粮组成及配制、饲喂量、生理时期、试验动物及环境的不同都会引起消化率的变化。就5组饲粮的DM、OM、GE、CP表观消化率而言，各饲粮之间差异显著，主要原因有以下2个方面：一是NDF的含量对DM、OM、CP、NDF全肠道表观消化率存在极显著影响^[19]，试验中饲粮NDF含量以全羊草饲粮组最多，其次是60%组、40%组、20%组。Valdés等^[20]研究证实，DM表观消化率随饲粮中粗饲料比例的增加而降低。本试验中随着羊草替代比例的增加，饲粮粗饲料比例加大，基础饲粮DM表观消化率逐次显著大于60%组、40%组、20%组、全羊草饲粮组。二是饲粮的DM、OM、GE和CP的表观消化率与它们在饲料中的含量均呈极显著正相关^[14]，化学成分以CP对表观消化率影响最大，本试验条件下所得的各饲粮营养物质表观消化率变化趋势也与此规律是一致的。刘洁^[14]在绵羊ME预测模型的研究中，营养水平与本试验接近的饲粮消化率略高。因此，本试验中基础饲粮以及采用替代法后所得到的各饲粮的DE、ME均是试验羊只处于正常的生理消化代谢下测定所得。因而，试验所得各饲粮DE、ME客观，真实能够用于替代法的计算。

本试验表明，2种方法测定的羊草的CP、NDF全肠道表观消化率差异不显著；而直接法中羊草的DM、OM、GE消化率显著高于60%组，与40%组、20%组之间差异不显著，其中20%组更接近全羊草饲粮；全羊草饲粮组的羊草DE显著高于60%组，与40%组、20%组之间差异不显著，其中20%组更接近全羊草饲粮组；直接法中全羊草饲粮组的羊草ME与60%组ME差异显著，与40%组、20%组之间无显著差异，其中20%组最接近全羊草饲粮；同时DE用于ME的能量转化效率，即ME ∶ DE，2种方法之间亦无显著差异。这提示我们，在采用替代法计算羊草的ME时，羊草替代比例为20%为宜。直接法和替代法是测量单一饲料常用的经典方法，对于羊来说，粗饲料可以单独饲喂，能够有效地避免原料间营养互作，以待测原料作为唯一能量来源饲喂动物，可以较直接地计算出食入GE和消化代谢损失的能量的差值，但此方法使用范围狭窄，常受限于原料的适口性，营养成分这些因素^[21]。本研究所用羊草中水分含量为8.87%，OM含量为87.62%，CP含量为7.64%，EE含量为1.94%，NDF含量为64.87%，ADF含量为40.24%，P含量为0.19%，Ca含量为0.46%，GE为16.29 MJ/kg。将此羊草制作成颗粒饲料，提高了饲粮适口性，保证动物采食量。目前关于不同方法研究饲料原料能值的报道不多，而在单胃动物家禽，猪上的研究相对较多，近年来，Bolarinwa等^[22]利用直接法和回归法测定猪小麦的能值，其结果表明2种方法之间亦无显著差异；刘德稳^[7]采用直接法与替代法探究对测定生长猪玉米净能的影响，该报道中直接法的玉米饲粮CP含量为8.38%、替代法中基础饲粮的CP含量为17.19%、而替代后组成的新饲粮CP含量为13.76%，DE、ME、净能和沉积净能差异均不显著；聂大娃^[23]应用插值法探讨了替代法测定28日龄肉仔鸡单个饲料(玉米)ME中被测饲料的适宜替代比例问题，在替代比例对被测玉米的表观代谢能(AME)计算值的影响上，除80%替代组外，所测得玉米AME无显著差异，说明替代比例(20%～70%)的变化对于被测玉米的AME测定无显著性影响；本研究中羊草替代比例为60%、40%、20%，所得羊草的ME除60%组外，其他3组亦无显著差异。说明替代法测定羊草ME的替代比例可以为20%或40%。替代法的要求就是要配制一个营养水平满足动物需求的基础饲粮，目前对关于替代比例没有确定的固定值，很难控制试验饲粮蛋白质和纤维的一致性，因此本研究的目的是确定羊草的最佳替代比例，本研究使用的替代法将羊草以不同的比例替代后构成的新试验饲粮营养水平存在一定的差异，得到结果是40%组、20%组所得羊草ME与全羊草组相比无显著差异，而60%组差异显著，且ME降低，说明替代比例过高对ME造成了影响，这种影响可能由于蛋白质和纤维比例的变化造成的。此外，Villamide^[3]对测定家兔原料能值的直接法、替代法、多元回归构建模型这3种方法及其精确度分别做了综述，表明替代法测定家兔饲料能值最佳的替代比例为20%～30%，此时测定值的精确度最高；在肉羊方面的研究中，前人则是采用半体内法，体外法对原料营养物质含量或者营养物质可利用性进行评定^{[24, 25, 26, 27]}。在采用体内法对肉羊粗饲料原料能值的评定中，陶春卫^[13]在精粗比近似8 ∶ 2的基础饲粮中用待测饲料(羊草、玉米秸秆、苜蓿、青贮)替代饲粮供能的部分，替代量为基础饲粮的65%，组成的新饲粮CP含量分别为9.18%、8.21%、6.19%、15.29%，采用替代法得出羊草的DE、ME与体外测定值差异不显著，其研究所得羊草的DE与ME分别为(9.56±0.14)MJ/kg、(7.63±0.51) MJ/kg。而本试验实测得到羊草DE与ME分别为8.95、6.96 MJ/kg DM。鉴于直接法与替代法对测定羊草ME的差异，本研究中羊草分别以60%、40％、20%的比例替代基础饲粮中的供能成分(羊草、玉米、豆粕)，直接法实测羊草ME与40%组、20%组间无显著差异。直接法测定数据更接近于20%组所得羊草的能值。直接法与替代法对测定羊草的各营养物质表观消化率的影响中，具有一定的差异性，其中直接法实测的羊草的DM、OM、GE消化率与40%组、20%组无显著差异，而20%组最接近直接法所得羊草ME。因此在采用替代法测定羊草的ME时，替代比例选择20%为宜。

直接法与替代法在测定羊草的ME时，替代比例不同会对结果产生显著影响，在采用替代法测定羊草的代谢能时，最佳的替代比例为20%。