谷氨酰胺(glutamine,Gln)是动物体内含量最丰富的一种条件性必需氨基酸，是机体一些快速分裂细胞的主要能量来源，参与合成多种必需物质代谢，具有维持肠道黏膜屏障、改善机体营养状况、增强机体免疫能力等多种功能^[1]。研究表明，适量Gln的添加可以增加大鼠肠绒毛高度，降低肠黏膜通透性，增强肠免疫功能，并防止细菌及毒素的移位，维持肠黏膜屏障^[2]。Gln在动物饲料领域的应用已有所研究，例如：添加1%的Gln可以增加断奶仔猪的空肠绒毛高度，降低肌层厚度，防止断奶仔猪的肠黏膜萎缩，对维持肠道的结构和功能具有重要作用^[3]；Gln可以提高猪肠黏膜中抗菌肽mRNA的表达量，提高仔猪的抗病能力^[4]，且可以减少断奶仔猪应激时自由基的产生，从而减少应激对机体的损伤^[5]。

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)属鲶形目(Siluriformes)，鲿科(Bagridae)，黄颡鱼属(Pelteobagrus)，其肉味鲜美、含肉率高、营养价值高，深受中国、韩国、日本等东亚国家消费者青睐^[6]。随着黄颡鱼养殖业的兴起和发展，对病害防治途径的探索不断加深。然而，Gln对动物免疫及营养作用的研究主要集中在畜禽方面，关于水生动物方面的研究只有零星报道^[7]，而在黄颡鱼饲料中的应用效果还未有报道。因此，本研究通过在饲料中添加Gln，探讨其对黄颡鱼幼鱼生长性能、肠道形态和非特异性免疫相关基因表达的影响，并确定其适宜添加量，为Gln在水产饲料生产中的应用提供参考。

设定试验饲料中Gln(纯度99%，郑州新威营 养技术有限公司提供)添加量分别为0(对照)、 0.10%、0.20%、0.40%。饲料原料粉碎后过60目筛，按照配方要求准确称量，混匀，微量成分采取逐级扩大法预混合，再与大宗原料混合均匀，液体原料加入后过60目筛，使其混合均匀，混匀后加入30%的水，再次混匀后用双螺杆制粒机(华南理工大学科技实业总厂，G-250)挤压成粒径分别为2.5和4.0 mm的2种颗粒饲料，制粒后于90 ℃烘箱中熟化0.5 h，干燥后于-20 ℃保存备用。饲料成分分析参照AOAC(1995)^[8]的方法，即水分含量采用105 ℃常压干燥法测定，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法测定。试验饲料组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) % 项目 Items 谷氨酰胺添加量 Gln addition/% 0 0.10 0.20 0.40 原料Ingredients 鱼粉 Fish meal 18.00 18.00 18.00 18.00 菜籽粕 Rapeseed meal 12.00 12.00 12.00 12.00 豆粕 Soybean meal 26.00 26.00 26.00 26.00 面粉 Wheat flour 27.30 27.30 27.30 27.30 玉米蛋白粉 Corn gluten meal 7.50 7.50 7.50 7.50 豆油 Soybean oil 2.10 2.10 2.10 2.10 鱼油 Fish oil 2.10 2.10 2.10 2.10 大豆卵磷脂 Soybean lecithin 0.50 0.50 0.50 0.50 矿物质预混料 Mineral premix1) 1.50 1.50 1.50 1.50 维生素预混料 Vitamin premix2) 0.20 0.20 0.20 0.20 氯化胆碱 Choline chloride 0.30 0.30 0.30 0.30 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 2.00 2.00 2.00 2.00 纤维素 Cellulose 0.50 0.40 0.30 0.10 谷氨酰胺 Gln 0.10 0.20 0.40 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels 粗蛋白质 CP 39.82 39.56 40.32 40.54 粗脂肪 EE 7.73 7.65 7.69 7.23 水分 Moisture 10.57 10.21 10.93 10.30 1)矿物质预混料为每千克饲粮提供The mineral premix provided the following per kg of diets：Fe (as ferric citrate) 12 mg，Zn (as zinc sulfate) 32 mg，Mn (as manganese sulfate) 20 mg，Cu (as copper sulfate) 25 mg，I (as potassium iodide) 0.10 mg，Mg (as magnesium sulphate) 350 mg，K (as monopotassium phosphate) 1 000 mg，Na (as monosodium phosphate) 300 mg，Ca (as calcium lactate) 65 mg，Co (as cobalt dichloride) 5 mg，Se (as sodium selenite) 0.3 mg。 2)维生素预混料为每千克饲粮提供The vitamin premix provided the following per kg of diets：VA 2 mg，VB1 100 mg，VB2 60 mg，VB6 120 mg，VB12 0.2 mg，VC 105 mg，VD3 0.15 mg，VE 100 mg，VK3 40 mg，生物素 biotin 2.5 mg，叶酸 folic acid 4.0 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 150 mg，烟酸 nicotinic acid 400 mg，肌醇 inositol 2 000 mg。

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis)

试验用黄颡鱼幼鱼购自浙江湖州渔场，在试验条件下饲养2周后开始试验。试验前，禁食24 h后取健康、体重相近的黄颡鱼幼鱼进行分组，将240尾平均体重为(2.49±0.04) g的黄颡鱼幼鱼随机分为4组，每组3个重复，每个重复20尾，饲养于300 L蓝色玻璃钢桶中，试验期为10周。每2周测量1次体重，每天投喂2次，投喂时间分别为07:00和17:00，日投喂量为其体重的6%～8%，投喂后1 h观察其摄食情况，根据鱼的进食情况调整投喂量。试验用水为经过曝气处理的自来水，整个养殖过程中连续充气(1 L/min)，溶氧浓度保持或接近饱和，每天除污1次，前2周隔天换水1次，之后视水质情况每天换水40%～60%。试验期间，水温为19～29 ℃，pH 7.5～7.8，氨氮浓度不高于0.05 mg/L。

试验结束后，禁食24 h，擦干鱼体表水分和黏液，称重，统计存活率。每桶随机取3尾鱼测定其体重。按下列公式计算生长性能指标：

增重率(weight gain rate，WGR，%)=100×(W_t-W₀)/W₀；

特定生长率(specific growth rate，SGR，%/d)=100×(lnW_t-lnW₀)/t；

饲料效率(feed efficiency，FE)=(W_t-W₀)/F；

存活率(survival rate,SR,%)=100×(N_t-N₀)/N₀。

式中：W_t为终末体重(g)；W₀为初始体重(g)；t为试验天数(d)；F为摄食量(g)；N_t为终末尾数；N₀为初始尾数。

每个重复再随机选取3尾鱼，在冰浴条件下进行解剖，剥取肝脏、肌肉与肠道组织置于含RNA later的离心管中，立即置于液氮中备用。取出前肠1 cm左右，用生理盐水冲洗干净，放入10%中性甲醛中固定，石蜡包埋，连续横断切片，厚7 μm，进行常规苏木精-伊红(HE)染色。利用NIS-Elements D照相处理软件，每个肠管取2张切片，每张切片选取3个绒毛高度、皱褶深度和肌层厚度进行测量。

采用Omega R6934-01 Total RNA Kit Ⅱ试剂盒分别抽提肝脏、肌肉与肠道组织中总RNA，微量紫外可见分光光度计测定RNA溶液浓度和纯度。取1 μg总RNA按照TaKaRa PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒操作说明反转录得到cDNA。

根据GenBank中黄颡鱼的金属硫蛋白(MT)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、抗菌肽(Hepc)、组成型热休克蛋白70(Hsc70)和β-肌动蛋白(β-actin，内参基因)的cDNA序列，用Primer 5.0软件设计引物，见表2，引物由上海英潍捷基公司合成。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 内参和目的基因的引物序列 Table 2 Primer sequences of internal reference and target genes 基因 Genes 引物序列 Primer sequences 金属硫蛋白 MT F：5’-TTGCGAGTGCTCCAAGAC-3’ R:5’-CAGAAGGGCAGCAAGAGC-3’ 组成型热休克蛋白70 Hsc70 F：5’-CCTCTGTCCCTGGGTATT-3’ R:5’-GGCTCGTTCACCCTCATA-3’ 抗菌肽 Hepc F：5’-CTGGAGAAGCCTGTGGAAAC-3’ R:5’-GCAGAACCCACAGCCTTTAT-3’ 谷胱甘肽-S-转移酶 GST F：5’-GGCTGTTGCTGGTGTTGAGT-3’ R:5’-ATTCCCATCCATTCAACCAG-3’ β-肌动蛋白 β-actin F：5’-GTCCGTGACATCAAGGAGAAGC-3’ R:5’-CAGGACTCCATACCCAGGAAAGA-3’

表2 内参和目的基因的引物序列 Table 2 Primer sequences of internal reference and target genes

用实时荧光定量PCR仪(Roche)采用SYBR GreenⅠ方法对目的基因的mRNA相对表达量进行检测。以稀释的cDNA作为标准品模板，反应体系为：SYBR Primix Ex Taq Ⅱ(TliRNase Plus)(2×)10.0 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，DNA模板2.0 μL，ddH₂O 6.4 μL。MT、Hsc70与Hepc反应程序：95 ℃持续180 s；94 ℃持续45 s，退火温度55 ℃,持续45 s，72 ℃持续60 s，共计45个循环。GST反应程序：95 ℃持续30 s 1个循环；95 ℃持续5 s，退火温度60 ℃,持续30 s，共计45个循环，应用LightCycler 96软件，采用2^-△△Ct法测定目的基因的mRNA相对表达量。

通过统计软件SPSS 20.0，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重检验法进行统计分析，P<0.05为差异显著。

表3显示，随着饲料中Gln添加量的增加，黄颡鱼幼鱼的存活率出现增高的趋势，但组间差异不显著(P>0.05)。黄颡鱼幼鱼的终末体重、增重率、特定生长率、饲料效率各组间亦差异不显著(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 Gln对黄颡鱼幼鱼生长性能的影响 Table 3 Effects of Gln on growth performance of juvenile yellow catfish 项目 Items Gln添加量 Gln addition/% 0 0.10 0.20 0.40 终末体重 FBW/g 16.73±2.67 17.69±0.54 14.40±1.33 18.28±0.02 增重率 WGR/% 565.34±101.23 601.47±20.36 479.81±50.32 651.34±7.31 特定生长率 SGR/% 2.67±0.22 2.78±0.04 2.50±0.12 2.88±0.01 饲料效率 FE 0.38±0.02 0.36±0.01 0.35±0.02 0.42±0.01 存活率 SR/% 83.33±5.85 85.00±2.89 87.50±1.77 91.67±3.47 同行数据肩标相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 In the same row,values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 Gln对黄颡鱼幼鱼生长性能的影响 Table 3 Effects of Gln on growth performance of juvenile yellow catfish

图1显示，相比对照组，饲料中添加Gln后促进了肠道绒毛的发育，绒毛高度与皱褶深度有所增加，但肌层厚度有所下降。

图 1(Figure 1)

Fig. 1

A:对照组;B:0.10%组;C:0.20%组;D:0.40%组。MH:绒毛高度;MF:皱褶深度;MC:肌层厚度。 A:control group;B:0.10% group;C:0.20% group;D:0.40% group.MH:villus height;MF:folds depth;MC:muscle thickness. 图1 摄食含不同添加量Gln饲料后黄颡鱼幼鱼的肠道组织学变化 Fig. 1 Histological changes of intestine of juvenile yellow catfish after fed with different additions of Gln

表4显示，随着饲料中Gln添加量的增加，黄颡鱼幼鱼肠道绒毛高度呈现增加的趋势，其中0.10%组与对照组差异不显著(P>0.05)，而0.20%和0.40%组与对照组差异显著(P<0.05)。对于皱褶深度，0.20%和0.40%组较对照组显著增加(P<0.05)，而0.10%组与对照组差异不显著(P>0.05)。饲料中添加0.10%Gln对肠道肌层厚度未产生显著影响(P>0.05)，但添加0.20%和0.40%Gln则显著降低了肠道肌层厚度(P<0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 Gln对黄颡鱼幼鱼肠道形态的影响 Table 4 Effects of Gln on intestinal morphology of juvenile yellow catfish μm 项目 Items Gln添加量 Gln addition/% 0 0.10 0.20 0.40 绒毛高度 Villus height 545.52±31.66a 582.25±42.11ab 611.35±40.69b 745.77±40.37c 皱褶深度 Folds depth 528.18±53.94a 442.37±86.64a 594.92±53.82b 626.48±40.87b 肌层厚度 Muscle thickness 269.89±23.94a 289.22±49.12a 181.48±36.20b 206.63±41.30b

表4 Gln对黄颡鱼幼鱼肠道形态的影响 Table 4 Effects of Gln on intestinal morphology of juvenile yellow catfish

图2显示，饲料中添加Gln后，肌肉中MT mRNA相对表达量变化最明显，各添加组均较对照组显著升高(P<0.05)，其中0.40%组达到了对照组的3倍之多，但没有剂量效应，以0.20%组的升高量较低。与对照组相比，肠道中MT mRNA相对表达量在0.20%组显著升高(P<0.05)，升高了28.42%，但在0.10%和0.40%组则显著下降(P<0.05)。肝脏中MT mRNA相对表达量随着饲料中Gln添加量的增加先显著降低(P<0.05)，而后虽然有所升高，但各添加组仍均显著低于对照组(P<0.05)。

图 2(Figure 2)

Fig. 2

数据柱标注不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下 Value columns with different letters mean signi cant difference (P<0.05).The same as below. 图2 Gln对黄颡鱼幼鱼不同组织 MT mRNA相对表达量的影响 Fig. 2 Effects of Gln on MT mRNA relative expression level in different tissues of juvenile yellow catfish

图3显示，与对照组相比，肠道中GST mRNA相对表达量在0.10%和0.20%组有所升高，0.20%组升高了32.42%(P<0.05)，在0.40%组又有所下降，但差异未达显著水平(P>0.05)。与对照组相比，肝脏中GST mRNA相对表达量在0.20%组略有下降(P>0.05)，而在0.10%和0.40%组则下降显著(P<0.05)。饲料中添加Gln后肌肉中GST mRNA相对表达量出现了显著下降(P<0.05)。

图 3(Figure 3)

Fig. 3

图3 Gln对黄颡鱼幼鱼不同组织GST mRNA相对表达量的影响 Fig. 3 Effects of Gln on GST mRNA relative expression level in different tissues of juvenile yellow catfish

图4显示，饲料中添加Gln后肝脏中Hepc mRNA相对表达量受影响最明显，在添加量为0.10%时较对照组升高达73倍之多(P<0.05)，而添加量增加到0.20%和0.40%时虽然较对照组有所增加，但差异不显著(P<0.05)。与对照组相比，肌肉中Hepc mRNA相对表达量只有0.20%组出现了2倍的升高(P<0.05)，另外2个组都略有下降(P>0.05)。饲料中添加Gln后肠道中Hepc mRNA相对表达量出现了显著下降(P<0.05)。

图 4(Figure 4)

Fig. 4

图4 Gln对黄颡鱼幼鱼不同组织 Hepc mRNA相对表达量的影响 Fig. 4 Effects of Gln on Hepc mRNA relative expression level in different tissues of juvenile yellow catfish

图5显示，肌肉中Hsc70 mRNA相对表达量随饲料中Gln添加量的增加而升高，其中0.20%和0.40%组较对照组显著升高(P<0.05)。与对照组相比，肝脏中Hsc70 mRNA相对表达量在0.20%组升高显著(P<0.05)，达到3倍之多；而0.10%和0.40%组未产生显著变化(P>0.05)。与对照组相比，肠道中Hsc70 mRNA相对表达量在0.20%组略有升高，在0.10%和0.40%组则略有降低，但差异均不显著(P>0.05)。

图 5(Figure 5)

Fig. 5

图5 Gln对黄颡鱼幼鱼不同组织 Hsc70 mRNA相对表达量的影响 Fig. 5 Effects of Gln on Hsc70 mRNA relative expression level in different tissues of juvenile yellow catfish

肠黏膜和其他迅速增生的细胞(如免疫细胞)的主要能量来源是Gln，而非葡萄糖^[9]。肠道是Gln最主要的消耗器官^[10]。同时，肠道将体内环境和外源性物质隔离开来，肠黏膜作为第1道防线，与机体的非特异性免疫有着密切关系。饲料中添加适量的Gln可维持肠黏膜形态结构的完整性，能防止肠腔内的有害物质如细菌和毒素穿过肠黏膜进入体内其他组织器官和血液循环^{[11, 12]}。乔云芳^[13]研究发现，饲料中添加0.5%Gln可显著提高肉仔鸡的绒毛高度。林燕^[14]研究发现，饲料中添加1.2%Gln后建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)肠道的皱褶深度显著提高。邹晓庭^[15]研究发现，饲料中添加0.5%Gln可降低断奶仔猪的肌层厚度。本试验中，饲料中适量添加Gln提高了黄颡鱼幼鱼的增重率、特定生长率和存活率，说明Gln对其健康生长是有积极作用的。尽管Gln对增重率、特定生长率的影响不显著，但考虑到Gln在增强免疫功能方面发挥主要作用，可能对生长速度的影响不是其主要作用。本研究发现，饲料中添加0.20%Gln提高了黄颡鱼幼鱼肠道的绒毛高度、皱褶深度，且降低了肌层厚度。因此，该Gln添加量能有效防止黄颡鱼幼鱼的肠道黏膜萎缩，维持肠道的结构和功能，不同程度地提高机体非特异性免疫能力。

Hepc和Hsc70与机体的非特异性免疫作用有着密切关系。Hepc对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌、螺旋体和病毒等病原微生物均具有很强的杀伤活性^{[16, 17]}，是鱼体非特异性免疫系统的重要组成成分^[18]。沈文英等^[19]发现，正常状态下，Hepc mRNA相对表达量在肝脏中最高；用嗜水单胞菌(Aeromonas hydrophila)和腊样芽孢杆菌(Bacillus cereus)感染黄颡鱼后，Hepc mRNA相对表达量在肝脏中变化最显著。Hsc70是热休克蛋白家族的成员，近来有研究表明，病原感染细胞后，细胞表面的Hsc70可以呈递抗原，增强细胞的内摄作用^[20]。贾爱荣^[21]发现，正常状态下，Hsc70 mRNA相对表达量在肝脏中最高，用哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染大菱鲆(Scophthalmus maximus)后，Hsc70 mRNA相对表达量在肝脏中变化最显著。本试验结果显示，在饲料中添加Gln能提高机体的非特异性免疫能力，而且在0.10%~0.20%添加范围内，Hepc和Hsc70 mRNA相对表达量在肝脏中变化最明显。

MT和GST主要与机体的非特异性免疫作用中的抗氧化机制有关。MT富含还原态巯基且具有亲核性，其中的金属具有动力学不稳定性，这使得MT对自由基有较强的清除作用^[22]，对金属^[23]、化学物质^[24]及辐射^[25]导致的氧化损伤可起到一定的保护作用，同时还对巨噬细胞有保护和增强作用^[26]。GST是生物机体内重要的氧化还原代谢酶之一^[27]，同时具有解毒的功能^[28]，可提高机体的防御能力。本试验结果显示，在饲料中添加Gln在提高机体抗氧化能力的同时也提高了机体的非特异性免疫能力，且在0.10%~0.20%添加范围内，MT mRNA相对表达量在肌肉中变化最明显，GST mRNA相对表达量在肠道中变化最明显。

在基础饲料中添加一定量的Gln能增强黄颡鱼幼鱼的非特异性免疫和抗氧化能力，从而促进其健康生长。