2. 中国农业科学院饲料研究所, 农业部饲料生物技术重点实验室, 北京 100081
2. Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China
温室气体累积造成的全球变暖引起了人们越来越多的关注，甲烷(CH4)作为一种重要的温室气体，是大气中含量最为丰富的有机碳气体，占温室气体的16%[1]，对当前全球变暖的综合贡献率达到19%，仅次于二氧化碳(CO2)[2]。反刍动物因其瘤胃内微生物的发酵而产生大量的CH4，每年排放量约8×107 t，占人为CH4排放总量的33%[3]，不仅对环境造成严重的污染，还使饲料中的能量大量损失。在奶牛生产中，通常有6%~10%的总能转变为甲烷能[4]。但反刍动物瘤胃CH4的产生是必需的过程，对维持瘤胃氢分压具有重要作用。因此，通过何种方式调控反刍动物瘤胃CH4的产生，使其在保证动物机体健康和安全性的基础上减少CH4的排放，具有极其重要的现实意义。抗生素所带来的菌群失调、耐药、药物残留等弊端已经被人们所熟识。微生态制剂作为一种新型的绿色添加剂，近年来在动物生产上的应用越来越广泛，且生产效益显著。地衣芽孢杆菌具有抗逆特性，是芽孢杆菌中具有应用潜力的菌种之一，能够调节动物胃肠道菌群平衡，促进有益菌的生长，降低病原菌的数量，增强机体的免疫力[5]，同时提高饲料利用率。不少报道表明，地衣芽孢杆菌对动物生长、繁殖及抗病、提高饲料报酬等方面具有正效应，但对反刍动物CH4调控，特别是通过体内试验调控瘤胃CH4的评价鲜少。微生态制剂对反刍动物CH4调控的作用机制还有待进一步研究。本试验给成年肉用绵羊直接饲喂地衣芽孢杆菌，通过Sable开路式循环呼吸测热系统对肉羊CH4排放量进行实测，同时开展消化代谢试验，探讨了地衣芽孢杆菌对肉羊CH4排放量及消化代谢的影响，为微生态制剂减少反刍动物CH4排放，提高饲料能量利用率提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验时间和地点本试验于2014年12月至2015年1月在中国农业科学院南口中试基地开展。
1.2 试验材料与仪器地衣芽孢杆菌：活菌数量1×1010 CFU/g，由北京华农生物工程有限公司提供。
CH4测定装置：Sable开路式循环测热系统，LGR气体分析仪，购于美国Sable公司。整套试验装置由Sable系统的测定装置、密闭式气体代谢室和配套的计算机软件组成。
1.3 试验动物与饲粮试验选取24只体重为(45.00±1.96) kg、年龄相近、体况良好的杜泊( )×小尾寒羊(♀)杂交F1代成年羯羊。试验前打好耳号，免疫注射三联四防疫苗并进行驱虫，每只羊单独圈养于羊栏中，可自由饮水和采食。基础饲粮为全混合颗粒料(饲料颗粒直径8 mm，长10 mm)，由北京中农兴饲料科技有限公司提供。基础饲粮组成及营养水平见表1。
1.4 试验设计试验采用单因素随机区组设计，将24只羊分为4组，即1个对照组和3个试验组，每组6只羊，每只羊为1个重复，对照组饲喂基础饲粮，3个试验组在基础饲粮的基础上添加地衣芽孢杆菌，添加水平分别为2.4×108、2.4×109和2.4×1010 CFU/(只·d)，即低、中、高3个剂量组。试验期20 d，其中预试期8 d，正试期12 d，正试期内开展消化代谢试验和气体代谢试验。
采用Sable开路式循环测热系统、LGR气体分析仪测定CH4排放量，该系统连接6个呼吸测热箱，可以同时测定6只羊的CH4排放量。在正试期的第1、4、7、10天分4批(每批6只羊)将羊只移入呼吸测热箱，适应1 d后，随后测定2 d的CH4排放量，并计算甲烷能。每只羊进入和离开呼吸测热箱时均称重，平均体重作为羊只测热体重。消化代谢试验采用全收粪尿法进行样品的收集。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
每天晨饲前进行试验羊前1天粪样与尿样的收集，将粪袋取下称重，记录试验羊的排粪量，粪样混合均匀，按排粪量的10%取样。收集尿样时，用盛有100 mL 10%的H2SO4尿桶进行收集，记录尿液体积，混合均匀后用4层纱布过滤，按排尿量的10%取样。每天收集的粪样和尿样均保存于-20 ℃冰箱。此过程连续进行6 d，并将每只羊所有收集到的样品混合均匀后备用。消化代谢试验结束时，将每只羊的粪样置于65 ℃烘箱内烘干48 h，回潮48 h后称重，得出初水分含量，随后经粉碎过40目网筛制成分析样品，以备分析检测。
1.6 试验羊管理按照NRC(2007)绵羊的维持需要，试验羊采用限饲的方法，每天限饲基础饲粮1 200 g，08:00和18:00各饲喂1次，将不同剂量的地衣芽孢杆菌分别饲喂对应的试验羊只。具体操作步骤：将颗粒料倒入料槽中，在颗粒料表面喷洒少量的水，然后将地衣芽孢杆菌撒在颗粒料表面，以使羊只优先采食菌粉。喷洒少量水，目的是使菌粉可以黏附在颗粒料上，以免羊只在采食过程中因菌粉掉落到料槽底部而影响菌粉的摄入量，每只羊每天中午补饲羊草200 g，自由饮水。
1.7 数据处理与分析数据采用SAS 9.2统计软件中的ANOVA程序进行分析，差异显著时用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05作为差异显著的判断标准。
2 结果与分析 2.1 地衣芽孢杆菌对肉羊CH4排放的影响由表2可知，在肉羊饲粮中添加地衣芽孢杆菌，低、中剂量组的CH4排放日总量(L/d)、干物质采食量基础的CH4排放量(L/kg DMI)、代谢体重基础的CH4排放量(L/kgW0.75)及干物质采食量和代谢体重基础的CH4排放量[L/(kg W0.75·kg DMI)]均显著低于对照组(P<0.05)，其中中剂量组降幅较大。与对照组相比，高剂量组的以上指标差异均不显著(P>0.05)。
| 表2 地衣芽孢杆菌对肉羊甲烷排放的影响 Table 2 Effects of Baclicus lincheniformis on CH4 emission of mutton sheep |
由表3可知，在相同采食水平下，与对照组相比，试验组干物质的粪排出量均显著降低(P<0.05)，干物质消化量、表观消化率均显著提高(P<0.05)，以低剂量组效果最好；试验组有机物的粪排出量显著降低，有机物消化量、表观消化率均显著提高(P<0.05)，但试验组之间差异不显著(P>0.05)。
2.2.2 NDF和ADF的表观消化率由表4可知，与对照组相比，试验组NDF的粪排出量显著降低(P<0.05)，NDF的消化量、表观消化率显著提高(P<0.05)。与对照组相比，中、高剂量组ADF粪排出量显著降低(P<0.05)，ADF的消化量、表观消化率显著提高(P<0.05)。随着添加水平的提高，试验组间NDF、ADF的表观消化率无显著变化(P>0.05)。
2.2.3 氮的消化代谢由表5可知，食入氮水平相同时，与对照组相比，在相同采食量基础上，试验组均可显著降低粪氮、提高氮的表观消化率(P<0.05)，中、高剂量组可显著降低尿氮(P<0.05)。在饲粮中添加不同水平的地衣芽孢杆菌，沉积氮、沉积氮/食入氮均显著高于对照组(P<0.05)，但试验组之间无显著差异(P>0.05)。
| 表3 地衣芽孢杆菌对肉羊DM和OM表观消化率的影响 Table 3 Effects of Baclicus lincheniformis on DM and OM apparent digestibility of mutton sheep |
| 表4 地衣芽孢杆菌对肉羊NDF和ADF表观消化率的影响 Table 4 Effects of Baclicus lincheniformis on NDF and ADF apparent digestibility of mutton sheep |
| 表5 地衣芽孢杆菌对肉羊氮的消化代谢的影响 Table 5 Effects of Baclicus lincheniformis on nitrogen digestion and metabolism of mutton sheep |
由表6可知，与对照组相比，试验组的粪能均显著降低(P<0.05)，低剂量组显著低于高剂量组(P<0.05)，但与中剂量组差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，高剂量组的尿能显著降低(P<0.05)，与低、中剂量组的尿能差异不显著(P>0.05)。低、中剂量组的甲烷能、甲烷能/食入总能均显著低于对照组(P<0.05)。与对照组相比，试验组的消化能、代谢能、总能消化率、总能代谢率均显著提高(P<0.05)。
| 表6 地衣芽孢杆菌对肉羊能量消化代谢的影响 Table 6 Effects of Baclicus lincheniformis on energy digestion and metabolism of mutton sheep |
反刍动物瘤胃是个复杂、动态的微生态系统，当饲料被摄入后首先在瘤胃中进行厌氧发酵，瘤胃中的微生物把碳水化合物和纤维素发酵成可继续消化利用的物质，此过程中伴随CH4的产生。瘤胃CH4很难被畜体消化利用，通过嗳气排出体外[6]。有研究表明，反刍动物CH4的产生主要受饲料的类型、组成及食糜外流速度等因素的影响。此外，瘤胃环境、瘤胃发酵类型及其微生物区系也是影响CH4产生的重要因素。
芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧菌，在生长过程中消耗大量的氧气，使得肠道内氧气浓度降低，为肠道内的生理性厌氧菌的生长繁殖创造有利条件，同时使需氧的有害病原菌的生长由于缺氧受到抑制[5]。反刍动物瘤胃类似一个厌氧发酵罐，地衣芽孢杆菌的这种生物夺氧作用有利于瘤胃厌氧菌的生长和繁殖，通过改变菌群平衡，使得动物机体对饲料利用率得以提高，间接影响CH4产量。乔国华等[7]采用短期人工瘤胃的方法研究了地衣芽孢杆菌培养物对奶牛瘤胃发酵产CH4的影响，结果表明，地衣芽孢杆菌降低了37.91%的CH4排放量。本试验在肉羊饲粮中添加地衣芽孢杆菌，并对活体动物直接进行CH4产量的测定，结果表明，当添加水平为2.4×108和2.4×109 CFU/(只·d)时，降低了肉羊CH4的排放量，降幅分别为5.18%和9.33%。CH4排放量的降低程度与乔国华等[7]体外法的研究结果差异较大。这可能是因为采用体外法难以模拟瘤胃内真实、复杂的消化过程，试验过程中产物的积累也会影响CH4的产量，而体内法直接对活体动物进行测定，因而使得两者结果有所差异。
当前对瘤胃CH4调控的机理主要有3种模式：1)直接减少甲烷菌的数目，从而减少CH4生成量；2)通过减少CH4的合成底物氢气(H2)而抑制CH4的生成；3)通过特异性抑制CH4合成过程中的酶活性而减少CH4排放量[8]。芽孢杆菌在生长代谢过程中能产生多种抗菌物质，与瘤胃中的微生物之间相互作用，从而影响瘤胃内环境。于萍等[9]研究表明，在断奶后犊牛饲粮中添加纳豆芽孢杆菌，促进了琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌和脂解厌氧弧杆菌在消化道中的定植和生长。符运勤[10]以地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌饲喂0~8周龄哺乳期犊牛，提高了8周龄犊牛瘤胃液细菌种类数目，促进了瘤胃纤维分解菌的定植和繁衍。陈家祥等[11]在饲粮中添加地衣芽孢杆菌，考察其对肉鸡肠道发育和盲肠微生物区系平衡的影响，结果显示，饲养前期添加水平为50 mg/kg，饲养后期添加水平为200 mg/kg，显著优化了肉鸡的肠道组织结构，并使盲肠中的有害菌生长繁殖受到抑制。有报道认为，CH4的生成量与乙酸含量呈负相关，与丙酸含量呈正相关。当乙酸/丙酸为0.5时，瘤胃中底物发酵产生CH4的能量损失为0；当碳水化合物发酵只产生乙酸而不产生丙酸时，CH4产生时损失的能量达33%[12]。本试验后期，通过实时定量PCR对试验羊瘤胃液中的甲烷菌进行绝对定量，发现低、中剂量组的甲烷菌和原虫的数目减少，这与低、中剂量组CH4产量的减少相一致。因此，本试验中低、中剂量组降低了CH4的排放量，可能是因为直接减少了甲烷菌和原虫的数目，从而减少了CH4产量。随着添加水平的增加，地衣芽孢杆菌对肉羊CH4的抑制效果先增强后减弱，其中低、中剂量组显著降低了CH4产量，并以中剂量组效果较好，而高剂量组对CH4的产生没有明显的抑制效果，造成这种差异的可能的原因有：1)地衣芽孢杆菌进入瘤胃后与瘤胃微生物之间相互作用，在适量的添加量范围内可以抑制甲烷菌及原虫的数量，而当添加量过高时，瘤胃微生态中的优势种群发生变化，微生物之间复杂的互作效应使得其对甲烷菌的抑制作用减弱；2)从能量代谢的结果可看出，地衣芽孢杆菌及其代谢产物可以促进动物机体对营养物质的吸收和利用，但不同剂量组对这种促进作用的影响途径不同，低、中剂量组更利于减少甲烷能，而高剂量组更利于减少尿能，从而造成对瘤胃CH4抑制效果的差异。本试验中地衣芽孢杆菌降低CH4排放量的具体机制，还有待进一步的研究。
3.2 地衣芽孢杆菌对肉羊营养物质消化代谢的影响营养物质消化率标志着动物机体胃肠道功能的强弱。DM和OM的消化率是动物对饲粮消化特性的综合反映[13]。反刍动物因具有特殊的瘤胃结构，能够利用单胃动物难以利用的纤维素、半纤维素等难降解的结构性碳水化合物。NDF和ADF的消化率反映了反刍动物对饲粮的消化利用程度，瘤胃中纤维素的有效降解，不仅为反刍动物和瘤胃微生物提供了能量，更是唾液分泌、反刍、瘤胃液缓冲和瘤胃壁健康的有利保障。
微生态制剂中的芽孢杆菌活性细胞在动物消化道内能够产生淀粉酶[14]、蛋白酶[15]、脂肪酶[16]、木聚糖酶[17]、几丁质酶[18]等代谢产物，可降解某些抗营养因子，对动物机体进行辅助消化，从而提高饲料转化率[19]。周盟[20]以植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌及其组合菌饲喂犊牛，提高了营养物质表观消化率和肝脏器官指数，并降低了料重比。戴求仲等[21]以枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的芽孢杆菌制剂饲喂黄羽肉鸡，结果发现，连续饲喂6周后，提高了黄羽肉鸡的平均日增重，降低了料重比。周振峰[22]以地衣芽孢杆菌饲喂80头荷斯坦泌乳期奶牛，饲粮中添加量分别为1×109、2×109和3×109 CFU/kg，提高了奶牛泌乳期的产奶量，并以2×109 CFU/kg的效果最好。李卓佳等[23]研究发现，以地衣芽孢杆菌饲喂尖吻鲈，提高了尖吻鲈的增重率、特定生长率、肥满度，并且提高了前肠蛋白酶的活性。以上结果与本试验结果一致。本试验中，3个地衣芽孢杆菌添加组，即地衣芽孢杆菌添加水平分别为2.4×108、2.4×109和2.4×1010 CFU/(只·d)时，均提高了肉羊对DM、OM、NDF和ADF的表观消化率。这可能与微生态制剂具有营养功能有关，地衣芽孢杆菌在代谢过程中能够为动物机体补充蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶纤维素酶等具有较强活性的酶类，降解动物体内的蛋白质、甘油三酯、非淀粉多糖、结构性碳水化物等，促进反刍动物对营养物质的消化和吸收，从而提高饲料利用率。此外，沉积氮是反映肉羊对氮的利用效率的直接指标。本试验中，在肉羊饲粮中添加地衣芽孢杆菌提高了氮的表观消化率以及沉积氮，说明地衣芽孢杆菌利于瘤胃微生物对氮的利用，有利用微生物蛋白的合成。这可能是因为芽孢杆菌在胃肠道中定植后，具有一定的固氮能力，增加了含氮类物质的吸收和利用，减少了营养物质从粪尿中的排出[24]。
3.3 地衣芽孢杆菌对肉羊能量消化代谢的影响反刍动物消化过程中的能量损失较非反刍动物大，这与瘤胃发酵中的能量损失有直接的关系，其中CH4的产生是能量损失的主要途径[25]。有研究报道，在能量代谢中，反刍动物因CH4形式损失的能量占饲料总能的2%~15%[26]。本试验采用Sable开放式呼吸测热系统测得，对照组的甲烷能/食入总能为7.25%，低、中、高3个地衣芽孢杆菌添加组的甲烷能/食入总能分别为6.96%、6.76%和7.16%，其中以中剂量组，即添加水平为2.4×109 CFU/(只·d)降低效果最显著。本试验中，添加地衣芽孢杆菌降低了甲烷能、粪能，提高了代谢能、总能代谢率，说明添加地衣芽孢杆菌提高了肉羊的能量利用效率。地衣芽孢杆菌在一定条件下能产生抗逆性内生孢子，可以产生脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类和氨基酸类等多种抗生素，对病原菌能够起到很好的抑制作用[5]。此外地衣芽孢杆菌还能够产生维生素、氨基酸、有机酸、促生长因子等营养物质，促进动物机体的新陈代谢[27]。地衣芽孢杆菌提高肉羊能量利用率的原因可能有：1)减少了甲烷菌的数量，降低了CH4产量，提高了总能代谢率；2)减少了产氢菌的数量，减少CH4生成所需的底物氢，从而减少CH4合成量，提高能量利用率；3)改变了瘤胃发酵类型，降低乙酸/丙酸比例，使瘤胃趋于丙酸型发酵，促进能量的消化代谢；4)改变瘤胃微生物菌群，增加了优势种群所占比例，为营养物质的消化提供了良好的发酵环境，提高饲料利用率；5)提高了动物机体的抵抗力和免疫功能，减少了动物机体对环境的应激，从而提高了总能的利用率。
4 结 论在本试验条件下，得出如下结论：
① 在肉羊饲粮中添加地衣芽孢杆菌，当添加水平为2.4×108和2.4×109 CFU/(只·d)时，降低了肉羊CH4排放量，降幅分别为5.18%和9.33%。
② 在肉羊饲粮中添加地衣芽孢杆菌，提高了肉羊DM、OM、NDF、ADF、氮的表观消化率及沉积氮，并提高了饲粮消化能和代谢能，进而提高了能量利用率。
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