谷氨酰胺(glutamine,Gln)是动物血液中最丰富的氨基酸，是合成蛋白质、嘧啶和嘌呤核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸以及氨基糖的重要前体，并且是淋巴细胞等快速分裂细胞的主要能源物质，在其代谢过程中具有转氨和提供氮源的作用^{[1, 2, 3]}。一般情况下，机体内Gln可以由外源添加以及内源合成，当机体受到应激或者处于病理状态时，内源合成量远不能满足机体所需，从而导致机体内Gln相对缺乏^[4]。研究证实，饲料中添加Gln可以促进建鲤肠道发育，改善肠道结构及功能，并可有效防止过氧化氢对肠上皮细胞促发的氧化应激^{[5, 6]}。但是，外源添加的Gln极不稳定，受热易分解成有毒的焦谷氨酸和氨。徐奇友等^[7]在饲料中添加1.0%或2.0% Gln饲喂虹鳟，结果显示其绒毛直径、绒毛高度和黏膜厚度以及肠腺深度显著降低，可能因为Gln在外源添加过程中受到各种环境因子的影响，促使其产生焦谷氨酸和氨，从而对机体产生了不利的影响。基于Gln的缺陷，大量学者对其替代物做了深入的研究，主要以谷氨酰胺二肽为主，如Brito等^[8]研究表明丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)可抑制艰难梭菌毒素对肠上皮凋亡和损伤的诱导，Kim等^[9]利用Ala-Gln替代Gln促进猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育。从代谢角度看，Gln存在许多前体物，如α-酮戊二酸(AKG)、谷氨酸(Glu)、L-鸟氨酸-α-酮戊二酸(OKG)、L-精氨酸-α-酮戊二酸(AAKG)、α-酮戊二酸钠(2Na-AKG)等。AKG在生物体内三羧酸循环中是谷氨酸羧化脱氨的产物，可作为Gln的前体物合成Gln，同时也具有载氮和储存氮的功能，并且在肠道生长发育方面与Gln具有同等重要的作用；Glu是动物黏膜主要的能源物质之一，可作为Gln合成的前体，是与肠黏膜生长和代谢相关的重要氨基酸之一；OKG可抑制细菌易位、促进小肠上皮细胞增殖和受损黏膜的修复，对维持蛋白质稳定有重要作用；AAKG是一种精氨酸复盐，能够促进肝细胞对营养和能量的吸收，具有维护肝功能正常等作用；2Na-AKG是一种能够为生物体提供AKG的有机中间体，在一定程度上可降低AKG的吸收速度，从而使得AKG有更多的时间向其他形式转化。李晋南等^{[10, 11]}研究表明，Gln及其前体物(AKG、OKG、Glu)可以显著改善松浦镜鲤前肠淀粉酶和脂肪酶活性，与对照组相比，AKG显著降低饵料系数且使增重率提高了5.96%，其在肠道发育方面的影响也略优于其他替代物。魏玉强等^[12]研究发现，饲料中添加AKG能够提高松浦镜鲤肌肉中粗蛋白质含量，促进其对饲料中蛋白质的吸收及利用，提高鱼体蛋白质代谢水平。松浦镜鲤是利用德国镜鲤第4代选育系(F4)与散鳞镜鲤杂交后成功选育出的一个镜鲤新品种，相比于常规鲤鱼品种，其具有体形完好、含肉率高、生长速度快、养殖经济效益高等诸多优点。本试验从Gln前体物出发，甄选具有代表性的数种前体物，如Glu、AKG、OKG、AAKG和2Na-AKG，探究Gln前体物对松浦镜鲤组织抗氧化能力以及血清生化指标的影响。

L-Glu、L-Gln、OKG(L-鸟氨酸与AKG质量比为1 : 1)、2Na-AKG、AAKG(L-精氨酸与AKG质量比为2 : 1)均购自上海鼓臣生物技术有限公司，AKG购自Sigma公司，纯度均≥98.0%；松浦镜鲤选自中国水产科学院黑龙江水产研究所。

根据《鲤鱼配合饲料》(SC/T 1026—2002)以及NRC(2011)要求，以鱼粉、豆粕为蛋白质源，以豆油、鱼油、磷脂为脂肪源，配制基础饲料。分别用Gln、Glu、AKG、OKG、AAKG及2Na-AKG替代基础饲料中的葡萄糖(添加量为1.5%)，配制成6种等氮等能的试验饲料。基础饲料组成及营养水平见表1。饲料原料粉碎过80目筛，称重后将各原料逐级混合均匀，再加入一定量的水充分混匀后用小型颗粒机加工成粒径为2 mm的颗粒饲料，常温风干后于4 ℃冰箱保存备用。

挑选体格健壮、规格整齐的松浦镜鲤3 000尾，暂养并驯化1周，暂养期间饲喂基础饲料，1周后从中再挑取1 050尾平均体重(40.27±3.96) g的松浦镜鲤，随机分成7组，每组5个重复，每个重复30尾。对照组饲喂基础饲料，6个试验组随机饲喂1种试验饲料。试验鱼养殖于呼兰试验站车间的模块化组合式循环水养殖系统中，圆桶规格为直径1.2 m、高0.6 m，生物滤床水处理系统每小时处理水量8~12 t，养殖水体30 t，每日投喂3次(时间分别在07:30、12:30、16:30)，饱食投喂。养殖期为8周，定期清洗箱体，并保持每天换水20%，维持水温在(25.0±2.0) ℃，溶氧浓度不低于5.0 mg/L，氨氮浓度不高于1.0 mg/L。

养殖试验结束后将试验鱼饥饿24 h后采样。每缸随机取出2尾鱼用丁香油麻醉。待麻醉完全后，尾静脉采血，离心分离血清(3 500 r/min，15 min)，取血清样品并立即置于-20 ℃冰箱保存待测。将采血后的鱼置于冰盘上解剖，分别取肝脏、肠道，用预冷的0.86%生理盐水清洗肠道并用滤纸吸干。准确称取各组织样品，与预冷的0.86%生理盐水按1 : 9的比例(质量体积比)稀释，匀浆，按不同检测指标所需条件及试剂盒要求的速度和时间进行离心，离心后取组织上清液样品-20 ℃保存待测。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 鱼粉 Fish meal 5.00 豆粕 Soybean meal 38.10 玉米淀粉 Corn starch 2.00 次粉 Wheat middling 43.40 鱼油 Fish oil 1.00 豆油 Soybean oil 3.30 磷脂 Phospholipid 1.00 维生素预混料 Vitamin premix1) 0.30 矿物质预混料 Mineral Premix2) 0.20 L-赖氨酸 L-Lys 0.54 L-蛋氨酸 L-Met 0.56 L-苏氨酸 L-Thr 0.43 氯化胆碱 Choline chloride 0.20 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 2.47 葡萄糖 Glucose 1.50 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels3) 粗蛋白质 CP 29.22 粗脂肪 EE 6.75 赖氨酸 Lys 2.20 蛋氨酸 Met 1.00 苏氨酸 Thr 1.50 总磷 TP 1.21 1)维生素预混料为每千克饲料提供The vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 8 000 IU，VC 500 mg，VD3 3 000 IU，VE 60 mg，VK3 5 mg，VB2 30 mg，VB6 15 mg，VB12 0.5 mg，氯化胆碱 choline chloride 5 000 mg，烟酸 nicotinic acid 175 mg，D-生物素 D-biotin 2.5 mg，肌醇 inositol 1 000 mg，叶酸 folic acid 5 mg，泛酸 pantothenic acid 50 mg。 2)矿物质预混料为每千克饲料提供The mineral premix provided the following per kg of the diet：Zn 25 mg，Cu 3 mg，Fe 25 mg，Mn 15 mg，I 0.6 mg，Co 0.1 mg，Se 0.4 mg。 3)粗蛋白质和粗脂肪为实测值，其余为计算值。CP and EE were measured values,while the others were calculated values.

表1 基础饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)

血清、肝脏、肠道中丙二醛(MDA)含量、超氧 化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)含量均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定；血清生化指标采用全自动生化分析仪(贝克曼ProCX4，德国)测定，包括总蛋白(TB)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、葡萄糖、尿素氮(UN)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCHO)含量及谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性。

试验数据采用平均值±标准误表示，采用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)对数据进行方差分析，并用Duncan氏法对数据进行显著性检验，差异显著性水平设为P＜0.05。

Gln及其前体物对松浦镜鲤肠道抗氧化指标的影响见表2，结果显示：Gln与Glu组肠道SOD活性显著高于对照、OKG和2Na-AKG组(P＜0.05)，其他各组间无显著差异(P＞0.05)；Gln组肠道GSH含量显著高于对照、AAKG和2Na-AKG组(P＜0.05)，其他各组差异不显著(P＞0.05)；OKG和2Na-AKG组肠道MDA含量显著低于对照、Gln、AKG和AAKG组(P＜0.05)，同时AKG、Glu组肠道MDA含量显著低于对照组(P＜0.05)。

Gln及其前体物对松浦镜鲤肝脏抗氧化指标的影响见表3，结果显示：Gln和Glu组肝脏SOD活性显著高于其他各组(P＜0.05)，其他各组间差异不显著(P＞0.05)；Glu组肝脏GSH含量显著高于AKG、OKG、AAKG和2Na-AKG组(P＜0.05)，其他各组间差异不显著(P＞0.05)；Gln、Glu、AKG、OKG和2Na-AKG组肝脏MDA含量显著低于对照组(P＜0.05)，AAKG组与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 Gln及其前体物对松浦镜鲤肠道抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of Gln and its precursors on antioxidant indices in intestine of Songpu mirror carp (n=8) 组别 Groups 超氧化物歧化酶 SOD/(U/mg prot) 谷胱甘肽 GSH/(mg/g prot) 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 对照 Control 62.24±4.67b 17.76±2.06b 0.97±0.17a 谷氨酰胺Gln 123.18±11.81a 54.85±6.81a 0.76±0.13ab 谷氨酸 Glu 113.61±16.91a 38.48±6.54ab 0.55±0.12bc α-酮戊二酸 AKG 87.07±11.03ab 37.17±4.48ab 0.74±0.10b L-鸟氨酸-α-酮戊二酸 OKG 53.34±8.80b 38.06±4.59ab 0.35±0.05c L-精氨酸-α-酮戊二酸 AAKG 90.04±12.59ab 18.26±3.61b 0.76±0.10ab α-酮戊二酸钠 2Na-AKG 64.76±7.67b 22.65±4.08b 0.23±0.04c 同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。表3和表4同。 In the same column,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05). The same as Table 3 and Table 4.

表2 Gln及其前体物对松浦镜鲤肠道抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of Gln and its precursors on antioxidant indices in intestine of Songpu mirror carp (n=8)

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 Gln及其前体物对松浦镜鲤肝脏抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of Gln and its precursors on antioxidant indices in liver of Songpu mirror carp (n=8) 组别 Groups 超氧化物歧化酶SOD/(U/mg prot) 谷胱甘肽 GSH/(mg/g prot) 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 对照 Control 564.24±23.73b 20.18±1.71ab 1.86±0.12a 谷氨酰胺Gln 769.03±44.59a 17.91±2.76ab 1.27±0.13bc 谷氨酸 Glu 825.37±112.86a 30.96±3.46a 0.77±0.25c α-酮戊二酸 AKG 518.05±41.23b 10.54±2.31b 1.24±0.15bc L-鸟氨酸-α-酮戊二酸 OKG 455.72±36.86b 6.56±0.99b 0.75±0.09c L-精氨酸-α-酮戊二酸 AAKG 583.32±37.14b 9.78±1.64b 1.65±0.24ab α-酮戊二酸钠 2Na-AKG 498.30±22.82b 10.51±2.25b 1.00±0.25c

表3 Gln及其前体物对松浦镜鲤肝脏抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of Gln and its precursors on antioxidant indices in liver of Songpu mirror carp (n=8)

Gln及其前体物对松浦镜鲤血清抗氧化指标的影响见表4，结果显示：OKG和2Na-AKG组血清SOD活性显著高于对照组(P＜0.05)，其他各组 间差异不显著(P＞0.05)；2Na-AKG组血清GSH 含量显著低于对照、Gln、Glu、AKG和OKG组(P＜0.05)，Gln组血清GSH含量显著高于AAKG和2Na-AKG组(P＜0.05)，其他各组间差异不显著(P＞0.05)；血清中MDA含量各组间无显著差异(P＞0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 Gln及其前体物对松浦镜鲤血清抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of Gln and its precursors on antioxidant indices in serum of Songpu mirror carp (n=8) 组别 Groups 超氧化物歧化酶SOD/(U/mL) 谷胱甘肽 GSH/(mg/L) 丙二醛 MDA/(nmol/mL) 对照 Control 239.95±17.90c 1.77±0.11ab 15.31±0.80 谷氨酰胺Gln 277.72±7.75abc 2.28±0.14a 14.20±2.50 谷氨酸 Glu 258.44±13.38abc 1.92±0.18ab 14.83±1.14 α-酮戊二酸 AKG 265.99±9.58abc 1.75±0.20ab 11.94±1.59 L-鸟氨酸-α-酮戊二酸 OKG 313.31±32.71ab 2.04±0.32ab 13.03±0.71 L-精氨酸-α-酮戊二酸 AAKG 249.29±16.73bc 1.49±0.19bc 13.46±1.25 α-酮戊二酸钠 2Na-AKG 323.45±33.60a 1.04±0.06c 11.52±2.63

表4 Gln及其前体物对松浦镜鲤血清抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of Gln and its precursors on antioxidant indices in serum of Songpu mirror carp (n=8)

Gln及其前体物对松浦镜鲤血清生化指标的影响见表5，结果显示：Gln、Glu和AKG组血清TP含量显著高于其他各组(P＜0.05)，以2Na-AKG组最低；Glu组血清ALB含量显著高于对照、AAKG、AKG和2Na-AKG组(P＜0.05)，其他各组间无显著差异(P＞0.05)；Gln、Glu和AKG组血清GLB含量显著高于其他各组(P＜0.05)，以2Na-AKG组最低；AAKG组血清ALT活性显著高于其 他各组(P＜0.05)，其余各组间无显著差异(P＞0.05)；OKG和2Na-AKG组血清AST活性显著高于其他各组(P＜0.05)，以AKG组最低且显著低于其他各组(P＜0.05)；血清TG和UN含量各组间差异不显著(P＞0.05)；AAKG组血清TCHO含量显著低于对照、Gln、Glu和2Na-AKG组(P＜0.05)，其他各组间差异不显著(P＞0.05)；血清葡萄糖含量以对照组最高，并显著高于AKG组(P＜0.05)，其他各组间无显著差异(P＞0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 Gln及其前体物对松浦镜鲤血清生化指标的影响 Table 5 Effects of Gln and its precursors on serum biochemical indices of Songpu mirror carp (n=3) 项目 Items 组别 Groups 对照 Control 谷氨酰胺 Gln 谷氨酸 Glu α-酮戊二酸 AKG L-鸟氨酸- α-酮戊二酸 OKG L-精氨酸- α-酮戊二酸 AAKG α-酮戊二酸钠 2Na-AKG 总蛋白 TP/(g/L) 31.03±0.46b 34.60±0.35a 34.43±1.21a 34.00±0.38a 30.90±1.17b 30.10±1.15b 26.73±0.54c 白蛋白 ALB/(g/L) 3.03±0.12b 3.20±0.05ab 3.43±0.03a 2.97±0.14b 3.10±0.06ab 3.00±0.20b 2.97±0.12b 球蛋白 GLB/(g/L) 28.00±0.46b 31.53±0.46a 31.00±1.20a 31.00±0.41a 27.80±1.20b 27.43±1.30b 23.77±0.62c 谷丙转氨酶 ALT/(U/L) 4.00±0.58b 3.67±0.33b 2.33±0.33b 3.00±0.58b 4.00±0.58b 6.00±0.58a 4.00±0.58b 谷草转氨酶 AST/(U/L) 139.00±4.73b 122.67±7.22bc 136.67±11.62b 100.67±8.09c 192.00±7.00a 146.67±2.91b 186.33±13.97a 甘油三酯 TG/(mmol/L) 2.56±0.19 3.58±0.53 3.25±0.29 3.10±0.27 3.52±0.12 2.55±0.48 2.88±0.18 总胆固醇 TCHO/ (mmol/L) 4.08±0.36a 3.97±0.26a 4.09±0.22a 3.39±0.14ab 3.57±0.12ab 2.81±0.32b 3.80±0.20a 尿素氮 UN/(mmol/L) 1.57±0.22 1.23±0.12 1.27±0.15 1.37±0.27 1.17±0.22 1.23±0.22 1.20±0.06 葡萄糖 GLU/ (mmol/L) 4.10±1.09a 2.15±0.42ab 2.24±0.28ab 1.71±0.24b 2.12±0.42ab 3.53±0.94ab 2.19±0.56ab 同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。 In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05).

表5 Gln及其前体物对松浦镜鲤血清生化指标的影响 Table 5 Effects of Gln and its precursors on serum biochemical indices of Songpu mirror carp (n=3)

机体中氧化剂和抗氧化剂之间的平衡对维持生物大分子和细胞的功能是十分重要的^[13]。Gln对肠上皮抗氧化能力的影响主要是通过抗氧化酶系统和非酶系统来调节的^[14]。本试验通过抗氧化酶SOD和非酶抗氧化物质GSH和MDA途径分别对松浦镜鲤的肠道、肝脏和血清抗氧化能力进行了测定。刘坚等^[15]研究表明，机体SOD活性与机体脂质过氧化产物含量存在负相关关系。脂质过氧化终产物为MDA，其对机体生物膜的结构可造成严重损伤，从而影响其正常功能，甚至会导致细胞凋亡^[16]。GSH由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成，是机体内最主要且最丰富的含巯基低分子肽，其可与相关酶共同组成一道重要的抗自由基防线以保护机体蛋白质和脂质等的结构成分不被氧化，而Gln可参与机体内GSH的合成，从而提高机体抗氧化能力^{[13, 14, 15, 16, 17]}。陈瑾^[14]研究表明，Gln可抑制鲤鱼肠上皮细胞的脂质过氧化，并且可以提高机体对脂质过氧化产物的清除能力。李华涛^[18]研究表明，饲料中添加Gln可以提高幼建鲤肠道、血清和肝脏的抗氧化能力。夏晶^[19]在中华鳖感染嗜水气单胞菌的试验中得出，Gln可显著降低血浆MDA含量。

本试验中，AKG、OKG、2Na-AKG组肝脏和肠道MDA含量显著低于对照组，这与刘坚等^[15]在断奶仔猪上的研究结果相似，但这3种添加物对肝脏和肠道SOD活性、GSH含量影响不显著，说明AKG可能不是通过调控SOD活性和GSH含量来影响机体抗氧化能力，还存在其他调控机制。AKG参与其他非酶系统氧化脱羧作用促进过氧化氢的分解，并且在三羧酸循环途径中作为中间物质，可利用和转化氨，降低氨中毒程度，为机体提供额外的ATP，提高机体代谢能力，抑制氧自由基的生成，从而阻止脂质过氧化^{[20, 21]}。另外，Gln和Glu组肝脏SOD活性显著高于对照组，MDA含量显著低于对照组，而GSH含量则与对照组无显著差异；肠道中，Gln组SOD活性和GSH含量均显著高于对照组，且Glu组只有SOD活性与对照组存在显著差异，这与陈瑾^[14]在建鲤肠上皮细胞上的试验结果相似，但这2组的肝脏MDA含量与对照组相比差异均不显著。在血清抗氧化能力方面，虽然OKG组以及2Na-AKG组SOD活性和GSH含量均显著高于对照组，但各组间MDA含量差异均不显著。这与张军民等^[21]在早期断奶仔猪上的研究结果存在差异，可能鱼类和哺乳动物抗氧化调控机制有所差异，在机体抗氧化系统中可能存在某种平衡机制，用以维持机体正常功能。这种平衡机制还有待于进一步研究。

血液中的蛋白质具有维持胶体渗透压、免疫、运输、修补组织和缓冲等作用，能够反映机体代谢水平、免疫能力、蛋白质合成以及氮沉积等情况^[22]，血清中TP、ALB和GLB含量能够反映机体蛋白质代谢和吸收情况，GLB含量在一定程度上还可以反映机体免疫水平，而血清UN含量在一定程度上可以反映机体蛋白质代谢状况^{[23, 24, 25]}。本试验结果表明，Gln、Glu、AKG组的血清TP和GLB含量显著高于其他各组，各组血清UN含量虽无显著差异，但各试验组相较于对照组都有所下降。上述结果说明Gln、Glu、AKG的添加提高了机体对蛋白质的利用率以及免疫能力，这与朱青等^[26]在鲟鱼和魏玉强等^[12]在松浦镜鲤上的研究结果一致。

ALT和AST作为动物体内重要的转氨酶，广泛存在于动物的线粒体中，在机体蛋白质代谢中起重要作用，而其活性变化也是反映肝脏受损伤的最敏感指标，正常情况下，动物血清中转氨酶活性较低，当肝细胞受损时，ALT和AST便进入血液，导致ALT和AST活性升高^{[27, 28]}。本试验结果表明，AAKG组血清ALT活性以及OKG和2Na-AKG组血清AST活性显著高于对照组，而Gln、Glu和AKG组血清ALT活性则较对照组有所降低，且AKG组血清AST活性显著低于其他各组。这说明AKG的添加可有效地保护肝细胞。血清TCHO和TG含量可一定程度反映体内脂肪酸代谢水平。本试验结果表明，血清TCHO含量各组间无显著差异，AAKG组TG含量显著低于对照组，说明AAKG有助于机体脂肪酸的利用。血清葡萄糖含量升高会引起机体一系列不良反应，其含量一般随着饲料糖水平的升高而升高，而鱼类缺乏对血清葡萄糖含量的调控能力，被认为是先天性的糖尿病患者^{[29, 30]}。本试验结果表明，AKG组血清葡萄糖含量显著低于对照组，且其他组相较于对照组也有所降低，这种结果可能与几种添加物在机体内供能有关，而AKG效果更明显更直接。

① Gln及其前体物均对松浦镜鲤的组织抗氧化能力产生了一定的影响，从对机体脂质过氧化物质的清除能力看，Glu、AKG、OKG、2Na-AKG的效果较好。

② Gln及其前体物均对松浦镜鲤的血清生化指标均产生了一定影响，从蛋白质利用和机体免疫方面看，Gln、Glu和AKG表现较佳，同时AKG还可显著降低血清葡萄糖含量。