谷氨酰胺(glutamine，Gln)因其独特的生理作用，逐渐成为营养学、生理学、免疫学的研究重点和热点，大量证据证明，谷氨酰胺是一种条件性必需氨基酸，在动物体内合成不足时，需从外界摄取以维持体内谷氨酰胺含量的稳定^[1]。作为条件性必需氨基酸,谷氨酰胺具有改善免疫功能、增强抵抗力、促进蛋白质合成、保护肠道功能等作用^[2]。谷氨酰胺除作为肠黏膜细胞的主要能源外，还参与体内谷胱甘肽(GSH)的合成，而GSH可清除各种自由基以降低过氧化物对细胞的损害，在维持机体内环境处于自稳态方面起着关键性作用。路静等^[3]研究表明，饲粮中添加0.8%的谷氨酰胺可以显著提高热应激肉鸡血清总蛋白含量；黄冠庆等^[4]研究表明,高温条件下饲粮中添加谷氨酰胺可显著提高黄羽肉鸡血液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，显著降低血液中丙二醛(MDA)含量,提高机体的抗氧化能力。在水生动物上的研究表明，在饲料中添加谷氨酰胺可以显著提高石斑鱼^[5]、泥鳅^[6]和幼建鲤^[7]等的白细胞吞噬能力、呼吸爆发活性和非特异性免疫力。

黄颡鱼俗称黄辣丁、嘎鱼，是一种高档淡水品种，广泛地分布在亚洲东南部，在水产养殖中具有重要的商业价值^[8]。近年来，黄颡鱼因其蛋白质含量高、脂肪含量少、营养丰富、肉质细嫩、经济价值较高而越来越受欢迎^[9]。本试验拟通过在饲料中添加谷氨酰胺，探讨其对黄颡鱼幼鱼抗氧化能力和非特性免疫力的影响，并确定其适宜添加量，为谷氨酰胺在水产养殖中的实践运用提供参考。

按照谷氨酰胺添加量分别为0(对照)、0.1%、0.2%、0.4%，配制4种等氮等能的试验饲料，其组成及营养水平见表1。饲料原料粉碎后过60目筛，按照配方要求准确称量，混匀，微量成分采取逐级扩大法预混合，再与大宗原料混合均匀，液体原料加入后过60目筛，使其混合均匀，混均后，加入30%的水，再次混匀后用双螺杆制粒机挤压成粒径分别为2.5和4.0 mm的2种颗粒饲料，制粒后于90 ℃烘箱中熟化0.5 h，干燥后于-20 ℃保存备用。饲料营养成分分析参照AOAC(1995)^[10]的方法，即水分含量采用105 ℃常压干燥法测定，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法测定。

表 1(Table 1)

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) % 项目 Items 谷氨酰胺添加量 Gln addition/% 0 0.1 0.2 0.4 原料 Ingredients 鱼粉 Fish meal 18.00 18.00 18.00 18.00 菜籽粕 Rapeseed meal 12.00 12.00 12.00 12.00 豆粕 Soybean meal 26.00 26.00 26.00 26.00 面粉 Wheat flour 27.30 27.30 27.30 27.30 玉米蛋白粉 Corn gluten meal 7.50 7.50 7.50 7.50 豆油 Soybean oil 2.10 2.10 2.10 2.10 鱼油 Fish oil 2.10 2.10 2.10 2.10 大豆卵磷脂 Soybean lecithin 0.50 0.50 0.50 0.50 矿物质预混料 Mineral premix1) 1.50 1.50 1.50 1.50 维生素预混料 Vitamin premix2) 0.20 0.20 0.20 0.20 氯化胆碱 Choline chloride 0.30 0.30 0.30 0.30 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 2.00 2.00 2.00 2.00 纤维素 Cellulose 0.50 0.40 0.30 0.10 谷氨酰胺 Gln 0.10 0.20 0.40 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels 粗蛋白质 CP 39.82 40.28 39.96 40.47 粗脂肪 EE 7.73 7.53 7.31 7.60 水分 Moisture 10.57 10.44 10.57 10.23  1)矿物质预混料为每千克饲料提供The mineral premix provided the following per kg of diets：Fe (as ferric citrate) 12 mg，Zn (as zinc sulfate) 32 mg，Mn (as manganese sulfate) 20 mg，Cu (as copper sulfate) 25 mg，I (as potassium iodide) 0.10 mg，Mg (as magnesium sulphate) 350 mg，K (as monopotassium phosphate) 1 000 mg，Na (as monosodium phosphate) 300 mg，Ca (as calcium lactate) 65 mg，Co (as cobalt dichloride) 5 mg，Se (as sodium selenite) 0.3 mg。  2)维生素预混料为每千克饲料提供The vitamin premix provided the following per kg of diets：VA 2 mg，VB1 100 mg，VB2 60 mg，VB6 120 mg，VB12 0.2 mg，VC 105 mg，VD3 0.15 mg，VE 100 mg，VK3 40 mg，生物素 biotin 2.5 mg，叶酸 folic acid 4.0 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 150 mg，烟酸 nicotinic acid 400 mg，肌醇inositol 2 000 mg。

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis)

试验用黄颡鱼幼鱼购自浙江省湖州渔场，在试验条件下饲养2周后开始试验。试验前，禁食24 h后取健康、体重相近的黄颡鱼幼鱼进行分组，将240尾平均体重为(2.49±0.04) g的黄颡鱼幼鱼随机分为4组，每组3个重复，每个重复20尾，以重复为单位饲养于300 L的蓝色玻璃钢桶中，试验期为10周。试验用水为经过曝气处理的自来水，试验期间水温为19～29 ℃，pH 7.5～7.8，整个养殖过程中连续充气(1 L/min)，溶氧浓度不低于6 mg/L，氨氮浓度不高于0.05 mg/L。每2周测量1次体重，每天投喂2次，日投喂量为其体重的6%～8%，投喂时间分别为07:00和17:00，投喂后1 h观察其摄食情况，根据鱼的进食情况调整投喂量。每天除污1次，前2周隔天换水1次，之后视水质情况每天换水40%～60%。

试验结束后，禁食12 h，每桶随机挑选3尾鱼，用未浸润过肝素的一次性注射器心脏取血，所取血样于-4 ℃静置过夜后5 000 r/min离心取血清，将血清样本立即送往宁波大学第一附属医院检测血清生化指标。

采血后的黄颡鱼在冰浴条件下进行解剖，剥取肝胰脏、肌肉与肠道组织，各组织按质量体积比1∶ 9加入预冷生理盐水，用电动匀浆机在冰浴条件下进行组织匀浆。在4 ℃、3 000 r/min条件下离心20 min，取上清液测定各组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、GSH-Px活性及MDA和蛋白质含量。上述指标均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

头肾细胞的获取：将100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10 IU/mL肝素和2%的小牛血清加入到L-15培养基中。解剖黄颡鱼获得头肾后，立即置于培养基中挤压破碎，并通过100 μm金属网，获得的细胞悬液转入51%的Percoll溶液中，上层缓慢加入34%的Percoll溶液，不连续梯度密度离心分离巨噬细胞带(4 ℃、600×g，5 min)，收集中间带细胞，将细胞调整为1×10⁷个/mL的悬液，通过0.01%胎盘兰鉴定存活率在95%以上。

吞噬指数的测定：将100 μL酵母悬液(1×10⁸个/mL)加入到100 μL头肾细胞悬液中(23.5 ℃，40 min)。在显微镜下对巨噬细胞吞噬的酵母细胞数量进行统计。

呼吸爆发活性的测定：将100 μL 1 mg/mL氮蓝四唑(NBT)[含100 mL 1 μg/mL的丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)]加入到100 μL头肾细胞悬液中(25 ℃，45 min)，通过无水甲醇终止反应，70%甲醇漂洗2次，空气干燥。加入120 μL 2 mol/L氢氧化钾(KOH)和140 μL二甲基亚砜(DMSO)，以KOH/DMSO为空白使用酶标仪在630 nm下测定吸光度(OD)值，呼吸爆发活性以OD值表示。

试验数据用平均值±标准误(mean±SE)表示，采用SPSS 17.0统计软件中的ANOVA过程进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，有显著差异的，再用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著。

由表2可知，0.2%组血清总蛋白和球蛋白含量显著高于对照组及0.1%、0.4%组(P<0.05)，0.1%、0.4%组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。饲料中添加谷氨酰胺对血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶活性无显著影响(P>0.05)，但均在添加量为0.2%时有最大值。血清葡萄糖含量随着谷氨酰胺添加量的增加先升高后降低，在添加量为0.1%时达到最高值，但是组间差异未达到显著水平(P>0.05)。饲料中添加谷氨酰胺后，血清甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量均有所升高，且0.2%组上述指标均显著高于对照组(P<0.05)。

谷氨酰胺对黄颡鱼幼鱼不同组织中抗氧化指标的影响见表3。在肝脏中，饲料中添加谷氨酰胺可以提高CAT的活性，且在添加量为0.2%时达到最高值，比对照组高129 U/mL，差异显著(P<0.05)； GSH-Px活性在0.1%组有最高值，且显著高于其他各组(P<0.05)。在肌肉中，SOD和GSH-Px活性在0.1%组有最高值，且显著高于其他各组(P<0.05)；此外，0.2%组GSH-Px活性亦显著高于对照组(P<0.05)。在肠道中，饲料中添加谷氨酰胺对各抗氧化指标没有产生显著影响(P>0.05)。

表 2(Table 2)

表2 谷氨酰胺对黄颡鱼幼鱼血清生化指标的影响 Table 2 Effects of Gln on serum biochemical indices of juvenile Pelteoobagrus fulvidraco (n=3) 项目 Items 谷氨酰胺添加量 Gln addition/% 0 0.1 0.2 0.4 总蛋白 TP/(g/L) 32.15±0.35a 32.20±0.70a 37.20±1.74b 33.77±1.42a 白蛋白 ALB/(g/L) 9.80±1.30 9.20±0.20 9.90±0.46 9.47±0.06 球蛋白 GLOB/(g/L) 23.01±0.30a 22.90±0.60a 27.30±1.35b 24.30±1.41a 谷丙转氨酶 ALT/(U/L) 9.67±3.51 16.33±3.79 22.00±13.53 7.67±2.52 谷草转氨酶 AST/(U/L) 188.33±20.74 282.67±36.56 348.33±172.28 192.00±43.71 碱性磷酸酶 ALP/(U/L) 24.67±8.08 24.00±5.20 30.00±9.64 25.33±5.69 胆固醇 CHOL/(mmol/L) 3.52±0.39a 4.02±0.18ab 4.96±0.15b 4.24±0.36c 甘油三酯 TG/(mmol/L) 3.79±0.85a 4.09±0.43a 5.78±1.06b 3.47±0.18a 高密度脂蛋白 HDL(mmol/L) 0.37±0.05a 0.40±0.04ab 0.47±0.04bc 0.49±0.04c 低密度脂蛋白 LDL/(mmol/L) 0.93±0.08a 0.99±0.07ab 1.22±0.10c 1.15±0.14bc 葡萄糖 GLU/(mmol/L) 5.24±1.72 6.37±0.22 5.45±0.72 5.31±0.80  同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。  In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P＞0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P＜0.05). The same as below.

表2 谷氨酰胺对黄颡鱼幼鱼血清生化指标的影响 Table 2 Effects of Gln on serum biochemical indices of juvenile Pelteoobagrus fulvidraco (n=3)

表 3(Table 3)

表3 谷氨酰胺对黄颡鱼不同组织中抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of Gln on antioxidant indices in different tissues of juvenile Pelteoobagrus fulvidraco (n=3) 项目 Items 谷氨酰胺添加量 Gln addition/% 0 0.1 0.2 0.4 肝脏 Liver 超氧化物歧化酶 SOD/(U/mg prot) 46.76±2.95 57.46±12.01 53.21±5.72 50.12±4.19 过氧化氢酶 CAT/(U/mg prot) 56.79±14.83a 61.90±7.71ab 185.87±124.57b 89.69±22.27ab 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 1.03±0.37 0.76±0.03 0.83±0.14 0.89±0.04 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/((U/mg prot) 2.55±0.02a 3.76±0.26b 2.51±0.08a 2.55±0.39a 肠道 Intestine 超氧化物歧化酶 SOD/(U/mg prot) 16.97±5.92 18.05±4.13 17.57±6.16 15.99±8.74 过氧化氢酶 CAT/(U/mg prot) 13.29±3.68 14.81±9.16 18.80±7.00 19.64±0.40 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 1.77±0.73 1.26±0.21 1.46±0.60 1.48±0.63 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/((U/mg prot) 150.03±47.59 161.87±112.36 247.73±166.12 72.30±33.63 肌肉 Muscle 超氧化物歧化酶 SOD/(U/mg prot) 18.94±2.35a 26.23±3.90b 20.66±3.17ab 19.69±2.91a 过氧化氢酶 CAT/(U/mg prot) 27.59±15.99 49.17±21.04 39.37±20.18 41.52±41.24 丙二醛 MDA/(nmol/mg prot) 3.05±1.38 4.82±1.50 3.08±2.02 2.76±0.19 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px/((U/mg prot) 84.78±26.90a 724.93±220.18c 384.01±126.83b 260.57±143.74ab

表3 谷氨酰胺对黄颡鱼不同组织中抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of Gln on antioxidant indices in different tissues of juvenile Pelteoobagrus fulvidraco (n=3)

由表4可知，随着饲料中添加谷氨酰胺添加量的增加，黄颡鱼幼鱼头肾巨噬细胞的吞噬指数呈升高趋势，且0.2%和0.3%组较对照组显著升高(P<0.05)，但0.2%和0.3%组间差异不显著(P>0.05)；饲料中添加谷氨酰胺对头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性无显著影响(P>0.05)。

表 4(Table 4)

表4 谷氨酰胺对黄颡鱼幼鱼头肾非特异性免疫指标的影响 Table 4 Effects of Gln on non-specific immune indices of head-kidney juvenile Pelteoobagrus fulvidraco (n=3) 项目 Items 谷氨酰胺添加量 Gln addition/% 0 0.1 0.2 0.4 吞噬指数 Phagocytic index 5.44±0.06a 5.48±0.06ab 5.57±0.05bc 5.58±0.03c 呼吸爆发活性 Respiratory burst activity 0.24±0.03 0.26±0.01 0.25±0.03 0.21±0.01

表4 谷氨酰胺对黄颡鱼幼鱼头肾非特异性免疫指标的影响 Table 4 Effects of Gln on non-specific immune indices of head-kidney juvenile Pelteoobagrus fulvidraco (n=3)

鱼类的血清生化指标能够反映机体的健康状况和生理状况，也是疾病诊断和测定的依据之一^[11]。血清中的总蛋白、白蛋白含量能准确反映机体蛋白质的吸收与代谢，血清中较高的球蛋白含量使机体具有更强的疾病预防能力和免疫响应功能^{[12, 13]}。血清中胆固醇和甘油三酯的含量可反映机体脂肪代谢状况。本试验中，0.2%组的血清总蛋白、球蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量均显著高于对照组，这可能是因为谷氨酰胺可以通过脱氨基和转氨基作用合成多种氨基酸，减少机体的蛋白质分解，弥补幼鱼蛋白质合成能力不足等问题^{[14, 15]}。这与谷氨酰胺在幼鲟鱼^[16]、日本对虾^[17]、罗非鱼^[18]和鲑鱼^[19]上应用的试验结果一致，但与王周等^[20]和周荣艳^[21]在断奶仔猪上得出的饲粮中添加谷氨酰胺对提高血清总蛋白含量有一定作用但影响不显著的结论不一致，这可能是因为试验动物种类不同所致。综上所述，饲料中添谷氨酰胺可改善黄颡鱼的防御能力，提高机体的非特异性免疫力。

在抗氧化防护系统中，主要的抗氧化酶包括SOD、CAT和GSH-Px，MDA是脂质过氧化最重要的产物之一^[22]。本试验结果表明饲料中谷氨酰胺的添加量为0.1%时可以显著提高黄颡鱼幼鱼肝脏中CAT、GSH-Px及肌肉中SOD、GSH-Px的活性，这与谷氨酰胺在泥鳅^[6]、鲤鱼^[23]、半滑舌鳎^[24]和杂交鲟^[25]等水生动物上的研究结果一致。在本试验中，谷氨酰胺对黄颡鱼幼鱼肝脏、肌肉和肠道中不同抗氧化酶活性的影响有增加也有降低，目前关于其机制也存在一定的争论，张军民等^[26]推测在机体的抗氧化系统内可能存在着动态平衡机制，即一种机制激活时，则另一种可能处于被抑制状态，这可能是机体的自我保护机制之一。从总体上看，谷氨酰胺可以提高黄颡鱼幼鱼的抗氧化能力。

头肾是鱼类重要的淋巴组织，含有丰富的巨噬细胞，巨噬细胞的吞噬作用对鱼类抵抗病原微生物的入侵具有重要的意义^[27]。从黄颡鱼头肾巨噬细胞吞噬啤酒酵母的结果来看，饲料中添加谷氨酰胺可以增强黄颡鱼幼鱼头肾巨噬细胞的吞噬能力，从而提高机体的非特性免疫力。

综上所述，饲料中添加谷氨酰胺能够有效地提高黄颡鱼幼鱼的抗氧化能力和非特异性免疫力，综合各项指标判定0.1%～0.2%的添加量效果较佳。