硒(Se)是哺乳动物新陈代谢所必需的基本微量元素，其在动物的健康生长、繁殖等方面起着重要作用。Se在动物体内主要以硒蛋白的形式来发挥其多种生理功能，而硒蛋白又是一种特殊的蛋白质，它是Se以硒代半胱氨酸(selenocysteine，Sec)形式结合到蛋白质上的形成存在。Sec是第21种氨基酸，它由密码子UGA编码，而UGA在生物系统中是一终止密码子，其识别需要特殊的机制。将UGA识别为指导Sec合成的密码子，需要特殊因子的参与，如硒蛋白mRNA自身3′-非编码区(3′-UTR)的Sec插入稳定的茎-环结构硒代半胱氨酸插入序列(seleno cysteine insertion sequence，SECIS)^{[1, 2]}。在人体中分离得到了25种硒蛋白^[3]，它们很多是作为细胞重要的抗氧化防御系统，起着清除氧自由基的作用，具有保护生物膜完整、解毒和增强机体免疫等功能^[4]。硒蛋白P(SelP)是其中一种较为特殊的硒蛋白，它主要是由肝脏分泌到血浆中的一种含硒分泌性糖蛋白，人体血浆中约50%的Se是以SelP的形式存在^[5]。高等哺乳动物中硒蛋白一般只有一个Sec残基，而SelP是目前在高等生物中发现的唯一含多个Sec残基的硒蛋白^{[6, 7]}。SelP被认为在生物体内起转运和储存硒的作用^[8]。

目前，虽然在人和鼠中已经通过试验探索了部分SelP的功能，但对SelP而言，在以人为模型的研究中由于不易获得有效的研究材料，使得其功能及其在代谢中的作用机理尚没有精确的科学阐明，其生物学功能也还有待于进一步的深入研究；猪与人类在营养代谢、生理结构和功能、基因同源性等方面具有较高的相似性，它已成为研究人类医学问题的一种理想模型。因此，以猪为模型研究SelP的生物学功能具有重要意义，然而猪中完整的硒蛋白P基因(Sepp1)序列还未见报道。本试验拟克隆猪Sepp1，对其基因序列进行生物信息学分析，并对其mRNA在猪不同组织中的分布情况进行分析，为进一步以猪为模型研究SelP的生物学功能奠定基础。

Tetrad 2梯度PCR仪(Bio-Rad)、5804R台式高速冷冻离心机(Eppendorf)、Milli Q Plus超级纯水仪(Millipore)、凝胶成像系统GelDoc XR(Bio-Rad)、电泳仪及水平电泳槽(Bio-Rad)、Nanodrop2000微量核酸分析仪(Thermo)、7900HT荧光定量PCR仪(ABI)，文中提及的其他设备、器械均为国产。

主要试剂：TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；PrimeScript^TM逆转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、DNA分子量标准均购自大连宝生物工程有限公司；One-step SYBR Green荧光定量试剂盒购自QIAGEN公司；引物由上海生工生物公司合成；DNA凝胶回收试剂盒、快速质粒小量提取试剂盒均购自OMEGA Bio-Tek公司。

克隆菌株及质粒：大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10为本实验室保存，克隆载体pMD19-T购自大连宝生物工程有限公司。

通过NCBI GenBank数据库查询猪表达序列标签(expressed sequence tag,EST)，获得1段疑似Sepp1的序列片段(GenBank登录号：CX065456.1)，根据该片段设计Sepp1快速克隆的上游引物F1：ATCAACAAGAAGAAAACCAAACAGA，下游引物：3′-site adapter primer，采用cDNA末端快速克隆(3′-RACE)技术扩增含完整3′-端全长的Sepp1。采集新鲜“杜×长×大”(DLY)猪肝脏组织，采用TRIzol法提取总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸测定仪检测其质量。以质量合格的总RNA为模板，以Oligo (dT)- 3′-site primer为引物，按逆转录试剂盒说明书操作合成第1链cDNA。然后以cDNA为模板，以F1和3′-site adapter primer引物对扩增获得含完整开放阅读框(ORF)至polyA的Sepp1序列。PCR反应条件为94 ℃变性5 min，35个循环(94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min)，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。对PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段进行胶回收(具体步骤按胶回收试剂盒说明书操作)，然后将回收片段连接到pMD19-T载体上(具体步骤按克隆试剂盒说明书操作)，转入TOP10感受态细胞，然后涂布含Amp的LB平板，37 ℃倒置培养过夜。通过PCR对转化子进行阳性鉴定，对阳性转化子进行划线纯化并摇菌，再送上海英骏生物技术有限公司测序。利用NCBI Blast、SCEISearch 2.18等在线分析软件对克隆的基因序列进行分析并与EST序列进行拼接，确认后提交NCBI GenBank。

DLY公猪(体重约60 kg)6只，屠宰后新鲜收集肝脏、肾脏、肌肉、甲状腺、垂体、下丘脑、心脏、睾丸、脾脏等组织，切割成1 g左右大小，装入1.5 mL离心管中(无RNA酶，Axygen，USA)，液氮中保存待测。采用TRIzol法提取总RNA，用于定量分析。采用ABI Primer Express 3.0软件设计定量引物对，Sepp1定量引物对为：AACCAGAAGCGCCAGACACT和TGCTGGCATATCTCAGTTCTCAGA，看家基因Actb定量引物对为：CCCAAAGCCAACCGTGAGAA和CCACGTACATGGCTGGGGTG。引物送上海生工生物公司合成。

采用QIAGENT公司One-step SYBR Green RT-PCR Kit进行一步法实时荧光定量分析(ABI 7900HT)，荧光定量PCR反应体系为10 μL，包含5.0 μL 2×SYBR Green Mix (含RT-mix)、总RNA 100 ng、上及下游引物混合液各1 μL(2 μmol/L)，每个样重复2次。RT-PCR反应条件为95 ℃变性30 s，48 ℃反转录40 min，40个循环(95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s)，溶解曲线(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s)。本试验采用ΔCt相对定量方法来对不同组织基因表达量进行分析，具体方法为：以看家基因Actb作为参比基因，每一个样品中，ΔCt值是目标基因和参比基因Ct值的差值(ΔCt=Ct_target-Ct_reference)，以肾脏组织中目标基因表达量为标准，假定其表达量为1，其ΔCt值定为ΔCtR，其他组织样品中目标基因ΔCt值减去ΔCtR值的差值即为ΔΔCt(ΔCt-ΔCtR)，根据基因PCR扩增是2ⁿ扩增的原理，则目标基因在其组织样品中的相对表达量为2^-ΔΔCt。数据以平均值±标准误表示。

以猪肝脏总RNA为模板，反转录合成第1链cDNA，利用F1和3′-RACE的方法扩增获得了1条1 700 bp左右的目的条带(图1-A)。该片段经TA克隆到pMD19-T载体后，送上海英俊公司测序确定，然后与EST序列进行拼接，获得一段2 109 bp的cDNA序列，其含有完整的ORF和polyA结构，经分析确定其为猪Sepp1，然后提交NCBI GenBank数据库，序列号为：EF113596.2。Sepp1经SECISearch 2.18软件分析，具有典型的硒蛋白特有的3′-UTR SECIS发夹结构(图1-B)。经NCBI Blast比对分析该基因的ORF区长1 170 bp，编码390个氨基酸，含有14个Sec残基，分别位于第59、267、286、309、311、327、339、352、354、361、376、378、385和387位，其中大部分位于C端。人SelP(NP-005401)含10个Sec，小鼠SelP(AAA42129.2)含10个Sec，牛SelP(BAA84781.1)含12个Sec，这几个物种SelP的Sec大部分(90%以上)都分布在C-端^{[3, 6, 7]}。采用SingalP 3.0 server在线软件(www.cbs.dtu.dk/services/singalP/)对猪SelP进行信号肽预测，结果显示其在21和22位氨基酸有可能的信号肽切割位点(图1-C)。猪Sepp1的ORF编码区与人、小鼠、牛Sepp1的ORF区的同源性分别为：83.72%、76.31%、87.02%。猪SelP的氨基酸序列与人、小鼠、牛SelP的氨基酸序列的同源性分别为：76.15%、68.70%、82.14%，序列比对见图2。

图1（Figure 1）

Fig. 1

A. 猪Sepp1 RT⁃PCR 分析(M:DNA 分子量标准,1:PCR 扩增产物)｡B. 猪Sepp1 3′⁃UTR SECIS 发夹结构分析｡C. SelP 蛋白信号肽预测｡ A. RT⁃PCR analysis of porcine Sepp1 (M: DNA molecular weight marker, lane 1: RT⁃PCR product). B. SECIS hairpin structure analysis of 3′⁃UTR of Sepp1 of pig. C. Potential signal peptide predicted of SelP protein.图1 猪Sepp1的克隆及基因序列分析 Fig. 1 Cloning and gene sequence analysis of porcine Sepp1

采用RT-PCR对猪肝脏、肾脏、肌肉、甲状腺、垂体、下丘脑、心脏、睾丸、脾脏共9个组织进行了Sepp1的相对表达量分析，以肾脏组织的表达量为1，其他组织相对肾脏组织的相对表达量分析结果见图3。Sepp1在猪9个组织中均有mRNA表达，在肝脏中相对表达量最高，其次是甲状腺；在肝脏和甲状腺中的相对表达量均高于肾脏组织，分别是肾脏组织的6.8倍和1.7倍；在其余几个组织中的相对表达量均低于肾脏组织，在肌肉中的相对表达量最低，只有肾脏组织中相对表达量的0.01。Sepp1在猪9个组织中的相对表达量依次是肝脏>甲状腺>肾脏>睾丸>下丘脑>脾脏>垂体>心脏>肌肉。

图2（Figure 2）

Fig. 2

图2 猪、牛、人、小鼠SelP氨基酸序列比对 Fig. 2 Alignment of the amino acid sequence of SelP among cattle,human,mouse and pig

图3（Figure 3）

Fig. 3

图3 猪Sepp1在猪不同组织中的相对表达量 Fig. 3 The relative expression level of Sepp1 in various tissues of pigs

未知序列基因的克隆可根据其在不同物种间序列同源性比较，选择同源性较高的序列片段设计兼并引物，PCR扩增获得部分片段并测序分析，然后根据获得的部分基因片段信息，设计引物，采用5′-RACE和3′-RACE等方法，获得基因的完整序列。随着猪表达序列标签数据库等生物信息数据库的急剧丰富，利用在线生物信息学软件查询获得目标基因EST序列片段，特别是5′-EST序列信息，在此基础上设计引物，采用传统5′-RACE和3′-RACE等方法克隆获得基因片段并进行序列鉴定和分析，成为克隆猪硒蛋白基因的强有力手段。本试验采用传统PCR方法结合EST生物信息学分析等技术手段克隆并鉴定猪中的Sepp1，并将其提交NCBI GenBank数据库，序列号为：EF113596.2。分析猪Sepp1 CDS编码区和人Sepp1 CDS区有83.72%的同源性。经SECISearch 2.18软件分析，猪Sepp1具有硒蛋白基因特有的典型3′-UTR SECIS茎-环发夹结构。

硒蛋白是一种特殊蛋白质，是Sec以编码密码子UGA的形式掺入到合成的蛋白质中，即Sec合成进入蛋白质则是由密码子UGA介导的翻译行为，在没有特殊识别因子存在时，UGA是一个终止信号；而在有特殊识别因子时，该密码子则指导Sec合成掺入到蛋白质分子中，故Sec被认为是第21种氨基酸^[9]。SelP的氨基酸序列中含有10~17个Sec残基^{[6, 7]}，人和小鼠的SelP含有10个Sec残基，牛的含12个Sec残基。本研究中对猪Sepp1编码的氨基酸序列进行分析，发现其含14个Sec残基。SelP是一种胞外糖蛋白，是血浆硒最主要的存在形式，占血浆总硒含量的50%(人)或60%(鼠)^{[5, 6]}。采用SingalP 3.0 server在线软件(www.cbs.dtu.dk/services/singalP/)对猪SelP进行信号肽预测，发现其在21和22位氨基酸之间有可能的信号肽切割位点，说明该蛋白质为分泌性胞外蛋白。

硒蛋白的Sec是由UGA编码的，UGA有双重功能，既可以编码Sec，同时也可以起到终止密码子的作用，使蛋白质翻译终止，2种作用相互竞争^[10]。猪SelP存在14个UGA编码的Sec，故理论上应该在任意一个Sec/UGA处翻译终止，产生多个亚型。已有报告发现大鼠SelP有至少4个亚型，蛋白质翻译在第2个、第4个、第7个和第10个Sec/UGA处终止产生的N端相同，C端不同的亚型^[11]。人SelP至少也有2种亚型，分别是在第2个Sec处终止只含有1个Sec的小亚型和含有10个Sec的全长SelP^[12]。Takahashi等^[13]的研究发现，SelP不同亚型之间的功能不一样，仅含1个Sec的小亚型有还原氧化型的低密度脂蛋白，起抗动脉硬化的作用，而位于C端的9个Sec则起转运和储存硒的作用。猪SelP是否也具有多个亚型尚不清楚。

SelP是一种富Se蛋白，它能够结合肝素并通过肝素结合于细胞膜，被广泛认为有运输硒、抗氧化、结合重金属等功能^{[8, 14]}。硒蛋白P主要表达部位是肝脏，但在其他组织部位也有表达^[7]，由肝脏产生的SelP分泌到血浆中，而由其他组织细胞产生的SelP则分泌到细胞间隙^[15]。本研究也发现猪Sepp1的mRNA在肝脏中具有最高丰度，其次为甲状腺和肾脏。

① 本试验成功克隆了猪Sepp1，并提交NCBI GenBank数据库，序列号为EF113596.2。

② 猪硒蛋白P为分泌性蛋白，其氨基酸序列中含有14个Sec残基，在21和22位氨基酸位点具有可能的信号肽切割位点。

③ RT-PCR结果显示，Sepp1在猪各种组织中均有表达，其中在肝脏中具有最高的mRNA分布，随后依次是甲状腺>肾脏>睾丸>下丘脑>脾脏>垂体>心脏>肌肉。