, LIU Yulan
, WANG Haibo, WANG Xiuying, ZHU Huiling, ZHANG Jing, WANG Shuhui, TU Zhixiao
肝脏是机体的新陈代谢中心，同时也是体内的主要解毒和免疫防御器官。饲养环境中的致病性和非致病性抗原会刺激仔猪肝脏巨噬细胞产生、释放大量炎性介质，进而造成肝脏结构和功能损伤，最终导致生长抑制[1]。因此，通过营养手段来调控炎性介质的大量产生，对缓解肝脏损伤具有重要意义，也是缓解炎症的有效手段。
亚麻籽油中含有大量α-亚麻酸(C18 ∶ 3n-3)，而α-亚麻酸是二十碳五烯酸(EPA)(C20 ∶ 5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA)(C22 ∶ 6n-3)的前体。大量研究表明，n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)(如EPA和DHA)在急性化学肝损伤[1]、胆汁淤积性肝损伤[2]、糖尿病肝损伤[3]、脂肪肝[4]等一系列肝脏损伤模型中发挥着重要的保护作用。n-3 PUFA的保护作用可能与其抑制炎性介质的过量产生有关[1, 2, 3, 4]。但是，关于亚麻籽油发挥护肝作用的分子机理尚不清楚。
Toll样受体4(TLR4)和核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)是调节天然免疫和获得性免疫反应的重要蛋白家族。其中TLR4信号通路关键基因包括TLR4、髓样分化因子88(MyD88)、白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，NOD信号通路关键基因包括NOD1、NOD2、受体互作蛋白2(RIPK2)。研究发现，TLR4和NOD被激活后，可激活各自下游的信号分子，最终激活核因子-κB(NF-κB)，从而诱导炎性介质的表达，最终导致肝脏损伤[5]。因此，我们可以推测亚麻籽油可能通过TLR4和NOD信号通路，来调节炎性介质的产生，从而对肝脏损伤起调控作用。本研究通过给断奶仔猪注射脂多糖(LPS)诱导炎症，研究亚麻籽油对肝脏TLR4和NOD信号通路关键基因以及炎性介质表达水平的影响，旨在为探索亚麻籽油是否通过调控TLR4和NOD信号通路进而缓解肝脏炎性损伤提供初步依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与设计选择24头平均体重为(6.98±0.05) kg的 “杜×长×大”断奶仔猪，按体重相近原则，随机分为4个组，分别为对照组(5.0%玉米油)、LPS组(5.0%玉米油+LPS)、2.5%亚麻籽油组(2.5%玉米油+2.5%亚麻籽油+LPS)、5.0%亚麻籽油组(5.0%亚麻籽油+LPS)，每组6个重复，每个重复1头猪，试验期21 d。玉米油由山东西王食品有限公司提供，亚麻籽油由甘肃陇郁香粮油工业有限责任公司提供。玉米油和亚麻籽油脂肪酸组成见表1。试验第21天，LPS组、2.5%亚麻籽油组和5.0%亚麻籽油组仔猪分别腹膜注射100 μg/kg体重的LPS(大肠杆菌血清型O55 ∶ B5，Sigma公司)，对照组仔猪注射等量生理盐水。LPS注射剂量和作用时间参考前期研究结果[6, 7, 8]。前期研究表明，仔猪腹膜注射100 μg/kg体重的LPS，4 h后会产生炎症反应，且导致肝脏损伤。饲粮参照NRC(2012)营养需要量配制，基础饲粮组成及营养水平见表2。
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表 1 玉米油和亚麻籽油脂肪酸组成 Table 1Fatty acid composition of the corn oil and flaxseed oil |
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表 2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
仔猪注射LPS或生理盐水4 h后，屠宰，取肝脏，立即投入液氮冻存，随后转移至-80 ℃冰箱保存，用于提取组织总RNA。
1.3 mRNA表达分析 1.3.1 主要仪器与试剂7500实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)仪(Applied Biosystems)，梯度升降温功能 PCR仪(TaKaRa)，Nanodrop 2000超微量分光光 度计(Thermo)，Tanon-4100凝胶成像系统(上海天能)。RNAiso Plus(总RNA提取试剂)、Prime-Script® RT reagent kit with gDNA eraser(cDNA合成试剂盒)和SYBR® Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(real-time PCR试剂盒)均购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.3.2 测定方法组织总RNA提取、cDNA合成、real-time PCR参照陈少魁等[9]的方法。Real-time PCR数据计算采用Livak等[10]的2-ΔΔCt法，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因。
1.3.3 引物设计与合成根据GenBank中已发表的猪TLR4、MyD88、IRAK1、TRAF6、NOD1、NOD2、RIPK2、NF-κB、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、环氧酶2(COX2)、热休克蛋白70(HSP70)、GAPDH的基因序列，利用Primer premier 6.0软件设计real-time PCR引物(表3)。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
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表 3 基因的引物序列 Table 3 Primer sequences of genes |
用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和LSD多重比较，试验结果以平均值±标准误表示。P<0.10表示具有显著性趋势，0.05≤P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 亚麻籽油对LPS刺激仔猪肝脏COX2、HSP70、TNF-α mRNA相对表达量的影响由表4可知，与对照组相比，LPS刺激显著提高了仔猪肝脏COX2、HSP70、TNF-α的mRNA相对表达量(P<0.05)；与LPS组相比，饲粮添加2.5%亚麻籽油可显著降低COX2、TNF-α的mRNA相对表达量(P<0.05)，饲粮添加5.0%亚麻籽油可显著降低TNF-α的mRNA相对表达量(P<0.05)。
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表 4 亚麻籽油对LPS刺激仔猪肝脏COX2、HSP70和TNF-α mRNA相对表达量的影响 Table 4 Effects of flaxseed oil on the mRNA relative expression levels of COX2,HSP70 and TNF-α in liver of piglets after LPS challenge |
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表 5亚麻籽油对LPS刺激仔猪肝脏TLR4和NOD信号通路关键基因mRNA相对表达量的影响 Table 5 Effects of flaxseed oil on the mRNA relative expression levels of the key genes in TLR4 and NOD signaling pathway in liver of piglets after LPS challenge |
由表5可知，与对照组相比，LPS刺激显著提高了仔猪肝脏TLR4、MyD88、IRAK1、NOD1、NOD2、RIPK2、NF-κB的mRNA相对表达量(P<0.05)；与LPS组相比，2.5%亚麻籽油可显著降低NOD1、NOD2的mRNA相对表达量(P<0.05)，有降低RIPK2 mRNA相对表达量的趋势(0.05≤P<0.10)，5.0%亚麻籽油可显著降低NOD2 mRNA相对表达量(P<0.05)。
3 讨 论目前诱导炎症的经典方法是腹膜或静脉注射一定剂量的LPS[11]，LPS也被广泛应用于仔猪肝脏损伤研究。前期研究证实，LPS刺激可引起肝脏组织学损伤和功能紊乱[6, 7, 8]。肝脏中枯否细胞在LPS刺激后可分泌一系列炎性介质(如TNF-α)，这些炎性介质在肝脏损伤中起重要作用[1]。有关亚麻籽油对猪肝脏损伤调控作用的研究较少。研究报道认为，亚麻籽油在老鼠肝脏损伤研究中的添加量为5%~10%[3, 4]、在猪肠道损伤研究中的添加量为2%[12]。 另外，结合养猪生产实践(油脂添加量通常不超过5%)，本试验选择在饲粮中添加2.5%和5.0%的亚麻籽油来研究亚麻油是否可以缓解LPS诱导的仔猪肝脏炎症反应。
TNF-α和COX2是典型的炎性介质，在正常情况下不表达或表达量较低[2, 6, 7]。研究表明，这些炎性介质在炎症状态下表达量会急剧提高，是机体炎症反应的标志，LPS刺激会使这些炎性介质的表达量显著提高[2, 6, 7]。HSP通常被认为是一种对细胞具有保护作用的细胞内分子[13]，细胞内高水平HSP70可以降低炎症反应，促进肝再生[14]。研究表明，细胞内HSP70可直接与NF-κB相互作用，从而防止NF-κB的活化[15]。本试验结果表明，LPS刺激显著提高了仔猪肝脏TNF-α、COX2、HSP70的mRNA相对表达量，原因可能是LPS通过提高肝脏TNF-α的表达量，经负反馈途径进一步引起抗炎介质(如HSP70)的表达[16]。研究证实，LPS刺激导致肝脏HSP70和炎性介质COX2、TNF-α mRNA表达量显著上升[2, 6, 7]，同时也使肝脏HSP70、COX2、TNF-α蛋白表达量显著上升[16]。LPS刺激不同生长阶段猪，均会使其肝脏HSP70过量表达[17]，添加PUFA则能缓解这一现象。亚麻籽油能显著降低狗白细胞中HSP70 mRNA的表达量[18]。Narayanan等[19]也发现DHA能显著降低前列腺癌细胞HSP70蛋白的表达量。Chen等[8]研究表明，富含EPA和DHA等n-3 PUFA的鱼油缓解了LPS刺激导致的肝脏COX2 mRNA和TNF-α mRNA表达量的增加，同时也降低了蛋白的表达量。研究也发现，在大鼠酒精脂肪肝模型中鱼油可以降低肝脏HSP70、COX2、TNF-α的mRNA和蛋白表达量[20]。Chen等[2]研究表明DHA能通过抑制炎性介质的表达，缓解肝脏的损伤。Han等[4]发现，亚麻籽油能显著降低由高脂肪饲粮诱导的脂肪肝大鼠肝脏TNF-α的mRNA表达量的增加。Jangale等[3]也发现，日粮添加亚麻籽油或鱼油能显著降低糖尿病大鼠肝脏NF-κB、TNF-α、白细胞介素-6(IL-6)的mRNA表达量的增加。本试验结果表明，2.5%亚麻籽油可显著降低COX2、TNF-α的mRNA表达量，5.0%亚麻籽油可显著降低TNF-α的mRNA表达量。因此，亚麻籽油可能通过减少肝脏炎性介质的产生，进而保护肝脏。
为了探究亚麻籽油调节炎症的机制，本试验检测了TLR4和NOD信号通路关键基因的mRNA表达量。TLR4是Toll样受体家族(TLRs)中的重要成员，主要识别LPS[21]。当LPS刺激时，LPS与TLR4结合，将信号传递到胞内。在胞内，TLR4通过TIR(Toll/IL-1)区域与MyD88羧基端结合，活化MyD88。活化的MyD88能依次激活下游的IRAK1、TRAF6，最终激活NF-κB。激活的NF-κB转入核内，诱导炎性介质的表达[21]。NOD1和NOD2是NOD家族中最具代表性的成员，主要识别肽聚糖(PGN)。NOD1和NOD2都能结合共同的下游分子RIPK2，并进一步激活NF-κB，诱导炎性介质的转录[5, 22, 23]。当动物机体遭受应激或感染时，炎性介质大量产生，导致肝脏出现损伤。因此，我们推测亚麻籽油可能通过调控TLR4和NOD信号通路，来调节炎性介质的产生，从而发挥对肝脏的保护作用。
本试验发现，LPS刺激导致TLR4(TLR4、MyD88、IRAK1、NF-κB)和NOD(NOD1、NOD2、RIPK2)信号通路关键基因mRNA表达量显著上升。2.5%亚麻籽油可显著降低NOD1、NOD2的mRNA表达量，有降低RIPK2 mRNA表达量的趋势，5.0%亚麻籽油可显著降低NOD2的mRNA表达量。目前，有关亚麻籽油对肝脏TLR4和NOD信号通路关键基因表达影响的研究未见报道。前期研究表明，鱼油(富含EPA和DHA)可以降低LPS刺激导致的肝脏NOD1、NOD2、RIPK2的mRNA表达量的增加[8]。同时，鱼油也可显著降低LPS刺激引起的肠道、肌肉、下丘脑-垂体-肾上腺轴NOD信号通路关键基因的上调表达[24, 25, 26]。本试验结果暗示，LPS刺激诱导仔猪肝脏TLR4和NOD信号通路关键基因表达，导致炎性介质的释放，从而导致肝脏损伤，而亚麻籽油可通过调控NOD信号通路降低LPS刺激导致的仔猪肝脏炎性介质上调表达，从而发挥护肝作用。
4 结 论LPS刺激诱导仔猪肝脏TLR4和NOD信号通路关键基因表达，导致炎性介质(COX2和TNF-α)的过量释放。2.5%和5.0%亚麻籽油可通过抑制NOD信号通路，缓解LPS刺激导致的仔猪肝脏炎性介质过量表达。
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