腹泻是动物养殖过程中常见的疾病，引起腹泻的原因多且复杂，尤其在仔猪断奶阶段的腹泻一直是养猪生产的难题，影响到仔猪的生长发育。腹泻一般会造成胃肠道分泌、消化吸收功能紊乱，严重时会引起肠道通透性增加，肠绒毛受损、排列紊乱，紧密连接蛋白表达下降，同时还会伴随着细菌内毒素过量分泌、炎症反应加剧等症状^{[1, 2, 3]}，因此，加强幼畜生长阶段的肠道发育与健康对抵御腹泻具有重要意义。在过去的20年中，益生菌被广泛地用于治疗和预防腹泻类疾病，像腹泻型肠易激综合征(IBS)、抗生素相关性腹泻及流行性腹泻等^{[4, 5, 6]}。有研究表明，益生菌如屎肠球菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳酸菌等可以通过改善肠道黏膜屏障而达到缓解腹泻的目的^{[6, 7]}。Ling等^[8]发现酪酸梭菌可以减少小鼠由抗生素引起的腹泻，促进肠道组织的修复，降低肠道通透性，减轻炎症反应。此外，酪酸梭菌还可以减少由大肠杆菌或轮状病毒引起的腹泻，增强小肠黏膜上皮紧密连接蛋白的表达，降低炎症因子的产生，促进分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)的分泌^{[9, 10]}。Bisson等^[11]报道乳酸菌可以抵御大肠杆菌的入侵，促进机体免疫功能。也有研究发现乳酸菌可以增加应激模型小鼠肠道sIgA的分泌，减少炎症因子的含量^[12]。目前有关益生菌对预防急性腹泻及保护肠道黏膜屏障方面的研究还相对较少^[6]。因此，本试验采用番泻叶(番泻叶是中医中制备肠易激综合征模型的常用药物^[13])制备大鼠腹泻模型，选取唾液乳酸菌和酪酸梭菌2种益生菌，研究它们对抵御大鼠急性腹泻及维护肠道黏膜屏障的作用，为益生菌维护肠道健康提供理论依据与数据支持。

试验饲粮为鼠维持料，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

酪酸梭菌(Clostridium butyricum)，购自于青岛某生物技术有限公司。菌液制备：用强化梭菌培养基培养至对数生长期后，将菌液离心，用灭菌生理盐水洗2次，利用生理盐水将菌液浓度调整到6.28×10⁹ CFU/mL，4 ℃冷藏备用。唾液乳酸菌(Lactobacillus salivarius ZJ614)，来自于浙江农林大学动物科技学院。菌液制备：用MRS液体培养基培养至对数生长期，用相同方法将浓度调整到4.80×10⁹ CFU/mL，4 ℃冷藏备用。

番泻叶(购自于北京同仁堂药店)制剂制备：取番泻叶15 g加水500 mL，煮沸约10 min，2层纱布过滤，过滤液减压浓缩成0.3 g/mL，-20 ℃冷存备用，用时水浴加温至25 ℃^[14]。

选取清洁级21日龄断奶雄性Wistar大鼠48只[平均体重(57.45±6.23) g]，温度控制在(22±2) ℃。所有大鼠随机分在4个组中，即正常对照组(C1组)、模型对照组(C2组)、酪酸梭菌组(T1组)、唾液乳酸菌组(T2组)，每个组6个重复，每个重复2只大鼠。试验期共9 d，试验于每日08:30按每100 g体重1 mL的剂量灌胃，对照组(C1、C2组)经口灌服生理盐水，试验组(T1、T2组)经口灌服相应益生菌剂；第8天开始C1组在正常灌胃0.5 h后再按照每100 g体重1 mL的剂量灌服生理盐水，其余各组在正常灌胃0.5 h后灌服等量番泻叶制剂，观察各组大鼠腹泻情况。试验期间大鼠自由采食。记录大鼠初始体重、第8天体重及耗料量。试验结束后处死所有大鼠并采集血液及肠道样品。

第8天大鼠灌服番泻叶3 h后连续记录大鼠腹泻情况，计算腹泻率与腹泻指数。

腹泻率(%)=100×腹泻的动物数/该组动物总数；

腹泻指数=稀便率×平均稀便级(式中稀便率为每只动物所排的稀便数与总便数之比。稀便级表示每只动物稀便的程度，以稀便污染滤纸的直径定级，分为4级：<1 cm为1级，1~1.9 cm为2级，2~3 cm为3级，>3 cm为4级。平均稀便级=所有稀便级数/稀便次数)^[14]。

第9天灌胃结束4 h后，采用摘眼球法采集血液，然后放入促凝真空采血管中，4 ℃静置过夜，3 000 r/min(4 ℃)离心15 min，分离血清，分装于0.2 mL离心管中，-80 ℃保存。采用D-乳酸试剂盒(Sigma公司)和显色基质鲎试剂盒(含偶氮化试剂终点显色法，厦门市鲎试剂实验厂有限公司)分别测定血清中D-乳酸和内毒素的含量。

采血后断颈处死，剖开腹腔，分离肠道组织，剪取4 cm左右回肠中段肠段，用预冷的无菌生理盐水轻轻除净肠道内容物，后将肠段等分为3份，一份用4%多聚甲醛固定过夜后，石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红(HE)染色，封固。光镜(Nikon ECLIPSE Ci光学显微镜)观察，拍照(Tucsen图森CCD ICE5.0拍照系统)，采用Image-Pro Insight 8.0采集、测量图片，每个切片选择5～10个左右肠绒毛和隐窝测量肠绒毛长度及隐窝深度。

另取一份肠段放于RNAlater溶液中，采用实时荧光定量(real-time fluorescene quantitative PCR,qRT-PCR)方法测定回肠细胞因子白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)及紧密连接蛋白闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭锁蛋白(occludin) mRNA的相对表达量(引物信息见表 1)，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为参比基因。再另取一份肠段置于冻存管中，液氮预冻后于-80 ℃保存，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(USCN公司)检测回肠组织中sIgA的含量。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实时荧光定量PCR引物序列信息 Table 1 Information of primer sequences used for qRT-PCR 基因 Genes 引物序列 Primer sequence (5′—3′) 退火温度 Annealing temperature/℃ NCBI编号 NCBI No. 产物长度 Amplicon size/bp 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH F:CAGGGCTGCCTTCTCTTGTG R:GATGGTGATGGGTTTCCCGT 60 NM_017008.4 172 肿瘤坏死因子-α TNF-α F:CTCAGCGAGGACACCAAGGG R:CATCTTTTTGGGGAGCGCCT 62 XM_008772775.1 218 白细胞介素-1β IL-1β F:CCTTGTCGAGAATGGGCAGT R:TTCTGTCGACAATGCTGCCT 60 NM_031512.2 222 白细胞介素-10 IL-10 F:CCTCTGGATACAGCTGCGAC R:CAGTAGATGCCGGGTGGTTC 60 NM_012854.2 202 转化生长因子-β1 TGF-β1 F:AGGGCTACCATGCCAACTTC R:CCACGTAGTAGACGATGGGC 60 NM_021578.2 168 闭锁小带蛋白1 ZO-1 F:CTTGCCACACTGTGACCCTA R:GGGGCATGCTCACTAACCTT 60 XM_008759502.1 262 闭锁蛋白 occludin F:CAGCCCAGTTTGGTCTGTTT R:TTTCCACTCGGGCTCAATCC 60 NM_031329.2 236

表1 实时荧光定量PCR引物序列信息 Table 1 Information of primer sequences used for qRT-PCR

根据单因素完全随机设计，以SAS 9.2的MEANS模块对基本统计量进行分析，采用GLM模块对数据进行方差分析，采用LSD法进行多重比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

试验期内各组大鼠的生长情况及灌服番泻叶 后大鼠的腹泻情况列于表 2。由表中数据可知，各组大鼠灌服番泻叶之前与灌服8 d后平均日增重及料重比均无显著差异(P>0.05)。第8天灌服番泻叶后，C2、T1、T2组均出现稀便，腹泻率为100%，稀便率分别为76%、69%、72%，相互之间差异不显著(P>0.05)。而T1与T2组的腹泻指数极显著低于C2组(P<0.01)，分别降低27%和21%。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 各组大鼠的生长及腹泻情况 Table 2 Growth and diarrhea condition of rats in each group 项目 Items 组别 Groups P值 P-value 平均标准误 SEM C1 C2 T1 T2 初始体重 IBW/g 56.46 56.81 58.82 57.71 0.803 5 0.90 第8天体重 The 8th day BW/g 94.02 94.87 99.23 97.87 0.319 8 1.13 平均日增重 ADG/g 5.37 5.44 5.77 5.74 0.129 9 0.08 料重比 F/G 2.12 2.02 1.96 2.05 0.357 4 0.03 第8天腹泻率 The 8th day diarrhea rate/% 0 100 100 100 第8天稀便率 The 8th day loose stools rate 0Bb 0.76Aa 0.69Aa 0.72Aa <0.01 0.06 第8天腹泻指数 The 8th day diarrhea index 0Cc 2.13Aa 1.55Bb 1.69Bb <0.01 0.18 同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。 In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

表2 各组大鼠的生长及腹泻情况 Table 2 Growth and diarrhea condition of rats in each group

灌服番泻叶后，酪酸梭菌与唾液乳酸菌对大鼠肠道通透性的影响如表 3所示。由表中数据可 知，C2组大鼠血清中内毒素及D-乳酸含量极显 著高于C1组(P<0.01)。而与C2组相比，T1、T2组血清中内毒素与D-乳酸含量极显著降低(P<0.01)，其中血清中内毒素含量分别降低43%和45%，D-乳酸含量分别降低44%和40%。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 各组大鼠血清内毒素及D-乳酸含量 Table 3 Serum endotoxin and D-lactate contents of rats in each group 项目 Items 组别 Groups P值 P-value 平均标准误 SEM C1 C2 T1 T2 内毒素 Endotoxin/(EU/mL) 0.143Cc 0.379Aa 0.217Bb 0.208Bb <0.01 0.020 D-乳酸 D-lactate/(mg/L) 0.890Cc 8.342Aa 4.711Bb 4.967Bb <0.01 0.603

表3 各组大鼠血清内毒素及D-乳酸含量 Table 3 Serum endotoxin and D-lactate contents of rats in each group

试验各组大鼠回肠组织形态情况如表 4所示。番泻叶对回肠绒毛高度、隐窝深度及绒毛高 度与隐窝深度的比值无显著影响(P>0.05)。与 C2组相比，T1、T2组回肠隐窝深度显著降低(P<0.05)，同时回肠绒毛高度与隐窝深度的比值极显著升高(P<0.01)。各组大鼠回肠组织结构如图 1所示。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 各组大鼠回肠绒毛高度及隐窝深度 Table 4 Ileum villus height and crypt depth of rats in each group 项目 Items 组别 Groups P值 P-value 平均标准误 SEM C1 C2 T1 T2 绒毛高度 Villous height/μm 282.11 254.23 310.39 272.74 0.408 4 11.67 隐窝深度 Crypt depth/μm 97.07ab 107.97a 88.77b 84.91b 0.017 2 3.95 绒毛高度与隐窝深度的比值 V/C 2.92ABab 2.32Bb 3.55Aa 3.25Aa <0.01 0.15

表4 各组大鼠回肠绒毛高度及隐窝深度 Table 4 Ileum villus height and crypt depth of rats in each group

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图1 各组大鼠回肠组织结构 Fig. 1 Ileum morphological structure of rats in each group

试验各组大鼠回肠紧密连接蛋白表达情况如表 5所示。T1组回肠ZO-1及occludin mRNA的相对表达量分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)高于其他3组，而唾液乳酸菌对2种回肠紧密连接蛋白mRNA的相对表达量无显著影响(P>0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 各组大鼠回肠ZO-1、occludin mRNA相对表达量 Table 5 ZO-1 and occludin mRNA relative expression levels of rats ileum in each group 项目 Items 组别 Groups P值 P-value 平均标准误 SEM C1 C2 T1 T2 闭锁小带蛋白1 ZO-1 0.543Bc 0.873Bb 1.155Aa 0.697Bb <0.01 0.069 闭锁蛋白Occludin 0.752b 0.728b 1.375a 0.745b 0.027 2 0.095

表5 各组大鼠回肠ZO-1、occludin mRNA相对表达量 Table 5 ZO-1 and occludin mRNA relative expression levels of rats ileum in each group

试验各组大鼠回肠细胞因子mRNA相对表达量及sIgA含量如表 6所示。与C1组相比，C2组回肠抗炎性因子IL-10及促炎性因子IL-1β mRNA 的相对表达量分别极显著(P<0.01)和显著(P< 0.05)升高；与C2组相比，T1组回肠IL-10的mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01)，T2组则差异不显著(P>0.05)。番泻叶、酪酸梭菌及唾液乳酸菌对回肠TGF-β1、TNF-α mRNA相对表达量及sIgA含量的影响则无显著差异(P>0.05)。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 各组大鼠回肠细胞因子mRNA相对表达量及sIgA含量 Table 6 Cytokine mRNA relative expression levels and sIgA content of rats ileum in each group 项目 Items 组别 Groups P值 P-value 平均标准误 SEM C1 C2 T1 T2 白细胞介素-10 IL-10 0.515Bb 0.997Aa 0.623Bb 1.105Aa <0.01 0.078 转化生长因子β1 TGF-β1 0.447 0.577 0.507 0.728 0.324 1 0.051 肿瘤坏死因子-α TNF-α 0.642 1.002 0.790 0.618 0.657 3 0.076 白细胞介素-1β IL-1β 0.670b 1.220a 0.827ab 0.893ab 0.110 4 0.083 分泌型免疫球蛋白A sIgA/(μg/g) 5.357 5.934 5.247 5.205 0.733 7 0.248

表6 各组大鼠回肠细胞因子mRNA相对表达量及sIgA含量 Table 6 Cytokine mRNA relative expression levels and sIgA content of rats ileum in each group

番泻叶在中医中常用来制备肠易激综合征模型，其主要化学成分是番泻总甙类物质，可以导致小肠和结肠的剧烈运动，同时还会引起消化道黏膜的损伤^[15]。前人研究表明，按照每100 g体重0.2 g的剂量灌服番泻叶后小鼠会在3 h左右出现腹泻症状^[13]，同时存在量效依赖关系^[15]。当番泻叶提取物浓度大于25 g/L时，可致使细胞生长缓慢或死亡，造成细胞贴壁能力差，细胞间隙明显加大^[16]。在本试验中，灌服番泻叶引起了大鼠急性腹泻，使得大鼠稀便率与腹泻指数极显著升高，说明试验急性腹泻模型建立成功。

本试验中，唾液乳酸菌是从仔猪肠道分离、筛选后获得的高黏附性乳酸杆菌，良好的定植能力可以提高乳酸杆菌在肠道的生存时间，竞争抑制病原菌对宿主肠道细胞的黏附。酪酸梭菌又名丁酸梭菌，临床试验证明其对治疗腹泻、肠道应激综合征、腹部症状的有效率可达80%以上。研究表明，益生菌FF1能够显著改善由大肠杆菌引起的大鼠失重问题^[11]。口服酪酸梭菌可以显著地改善动物生长性能，降低动物腹泻率^[17]，还可以有效地治疗和预防小鼠由大肠杆菌O157 ∶ H7引起的腹泻，减少死亡率^{[10, 18]}。但Ventola等^[19]研究发现鼠李糖乳杆菌对于预防由轮状病毒引起的大鼠腹泻作用并不显著。在本试验中，唾液乳酸菌和酪酸梭菌对大鼠增重及料重比方面未显现出明显优势，但显著降低了由番泻叶导致的腹泻指数的升高，说明这2种益生菌对由番泻叶引起的急性腹泻均有一定的预防作用。

腹泻常常与肠道黏膜屏障改变有关。目前认为肠道黏膜屏障包括黏膜黏液层、sIgA、紧密连接蛋白及抗菌肽等化学物质。研究发现，益生菌可以维护肠道组织形态，减少肠道通透性，促进先天性免疫系统发挥作用，同时可以抵抗感染，抑制炎症^[7]。血清中D-乳酸含量往往与肠道黏膜通透性的改变有关，同时能够反映肠道黏膜损坏的状态^{[20, 21]}。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖成分，正常情况下机体肠腔内含有大量细菌和内毒素。当肠道通透性加大时，有害菌分泌的内毒素会经肠道吸收入血，导致血清中内毒素含量的上升。本试验中，模型对照组大鼠血清中的D-乳酸与内毒素的含量极显著高于正常对照组，说明番泻叶可能引起了肠道黏膜损伤，肠道菌群紊乱，并使肠道通透性增加。Luyer等^[22]报道乳酸菌能够减少出血性休克大鼠的血浆内毒素含量，阻止细菌易位。本试验中，酪酸梭菌与唾液乳酸菌均显著降低了急性腹泻大鼠血清中D-乳酸与内毒素的含量，这可能是由于这2种益生菌前期加强了肠道黏膜的发育，抵御了肠黏膜的损伤，巩固了肠道屏障功能，同时维持了肠道菌群的稳定性。

小肠绒毛长度和隐窝深度是衡量肠上皮细胞生长发育状况的指标。益生菌可以促进肠道发育，显著增加空肠、回肠肠道绒毛高度，降低回肠隐窝深度^[23]。在本试验中，酪酸梭菌与唾液乳酸菌均显著降低了急性腹泻大鼠回肠隐窝深度，极显著地提高了绒毛高度与隐窝深度的比值，说明这2种益生菌促进了肠道绒毛的发育，缓解了急性腹泻应激对肠道绒毛的损害，减弱了由番泻叶引起的肠道通透性的增加。

肠上皮细胞以及上皮细胞之间的紧密连接分子构成一道连续和完整的物理屏障，能够机械性地阻挡肠腔中病原微生物的入侵。紧密连接蛋白包括occludin、claudins、闭锁小带蛋白(ZOs)和连接或黏附分子^{[24, 25]}。细胞间紧密连接的通透性决定着整个肠上皮细胞的屏障功能^[26]。本试验发现，酪酸梭菌可以极显著地增加急性腹泻大鼠回肠ZO-1 mRNA的相对表达量，显著增加occludin mRNA的相对表达量；而唾液乳酸菌则没有显著改变这2种紧密连接蛋白mRNA的相对表达量。由此可以认为，酪酸梭菌调节了肠道上皮之间的紧密连接，提高了肠道上皮的屏障功能。这与Endo等^[27]发现酪酸梭菌MIYAIRI 588可以减少非酒精性脂肪肝模型大鼠的血清内毒素含量，增加肠道ZO-1和occludin蛋白的表达量一致。

益生菌可直接作用于宿主的免疫系统，刺激胸腺、脾脏等免疫器官的发育，提高巨噬细胞活力，活化肠黏膜内相关淋巴组织，使免疫球蛋白A生物合成与分泌增加，提高消化道黏膜免疫功能^[23]。sIgA是保护肠道上皮细胞远离肠毒素和致病性微生物的第1道防线^[28]。大量研究表明，在体内或体外试验中，益生菌可以提高肠道对sIgA的分泌量^[7]。但本试验中，番泻叶、唾液乳酸菌及酪酸梭菌均对回肠黏膜sIgA含量没有产生显著影响，这可能与大鼠自身恢复力较强有关。IL-10是由一些白细胞或非血管性细胞分泌的一类重要的免疫抑制性细胞因子^[29]，可以增强先天性免疫的免疫耐受^[30]。IL-10或其受体缺失时会引起严重的肠道炎症和一系列促炎性细胞因子的分泌^[31]。一定剂量的唾液乳酸菌可以诱导T淋巴细胞分泌IL-10、TGF-β等细胞因子^[32]。本试验中，灌服番泻叶可引起大鼠回肠IL-10 mRNA相对表达量的上升，说明肠道存在一定的炎症，而自身已产生抵御炎症的反应，产生了大量的IL-10；同时，唾液乳酸菌组与模型对照组无显著差异，酪酸梭菌组与正常对照组无显著差异，这可能是由于酪酸梭菌协助了自身免疫应答，并没有引起肠道炎症，而唾液乳酸菌则没有实现这样的作用。近期的研究表明，IL-1β可以通过招募粒细胞和刺激固有淋巴细胞促进先天性免疫功能，而患结肠炎模型的小鼠其体内的白细胞介素-1(IL-1)家族会随着疾病的不同阶段发挥不同的功能^{[33, 34]}。本试验中，模型对照组大鼠回肠IL-1β mRNA相对表达量比正常对照组有升高的趋势，说明了大鼠体内仍存在炎症问题，而酪酸梭菌和唾液乳酸菌均有抑制炎症反应的趋势。

断奶大鼠连续灌服唾液乳酸菌或酪酸梭菌后，可以有效地抵御由番泻叶引起的急性腹泻，降低肠道通透性，同时具有增强和保护肠道黏膜屏障的作用。