鸡蛋营养成分全面且均衡，是人们重要的动物性食品之一，但鸡蛋的消费量因其较高的胆固醇含量而受到制约^{[1, 2, 3]}。研究表明，通过调节膳食中的胆固醇含量可以降低血液中胆固醇含量^{[4, 5]}，且这一理念普遍深入人心。虽然美国膳食指南在2015年对胆固醇的摄入量已不加限制^[6]，但并非全部专家给予认同和赞同^{[7, 8, 9]}，胆固醇仍是心血管健康的潜在威胁之一^[10]，尤其对于那些有动脉粥状硬化、糖尿病、高胆固醇血症的人^{[11, 12]}，更应加以注意。随着人们对健康的重视和对高胆固醇危害意识的增强，低胆固醇鸡蛋越来越受到大众的青睐^[13]。因此，寻求新途径研发低胆固醇鸡蛋对生产保健蛋品及发展蛋鸡产业具有重要的现实意义。选择利用植物源性添加剂来降低鸡蛋胆固醇可能是绿色、安全、理想的途径之一。苜草素(polysavone)是从紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中通过现代破壁萃取工艺技术提取的纯植物饲料添加剂，具有用量少、功效明显、稳定性好的特点，其主要功能活性成分为多糖、黄酮、皂甙等^[14]。研究表明，皂甙、黄酮和多糖具有促进畜禽生长、增强机体免疫力、降血脂、提高机体抗氧化等作用^{[15, 16, 17]}，且能减少畜牧业对抗生素的依赖。Dong等^[18]研究表明，饲粮中添加500～1 000 mg/kg苜草素能够提高肉鸡的抗氧化活性，改善肉品质。王长康等^[19]在蛋鸡上的研究表明，苜草素能提高蛋鸡生产性能与蛋品质，对降低血清胆固醇含量也有作用。张丽娜等^[20]表明，蛋鸡饲粮中添加苜草素能够显著降低全蛋及肝脏中胆固醇含量，以500～1 000 mg/kg较优。综上所述，研究一般多限于对生产性能或直观代谢指标的表述，缺乏相关更深层次的动物代谢较为明晰的机制佐证，本研究以蛋鸡为例，探讨苜草素对其胆固醇代谢及相关基因表达的影响，探讨苜草素对蛋鸡鸡蛋胆固醇和血脂代谢影响的效用，并分析该效用与蛋鸡肝脏组织中调控胆固醇代谢的关键基因3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)、固醇结合蛋白元件-2(SERBP-2)、胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)和卵巢组织中卵黄蛋白原受体(OVR)mRNA表达的关系，阐明苜草素对蛋鸡胆固醇代谢的作用机制，进而为确定苜草素在蛋鸡饲粮中的合理应用提供依据。

试验用苜草素为棕黄色粉末，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供。苜草素提取方法为破壁萃取^[14]，主要有效成分包括：多糖≥15%，总黄酮≥5%，总皂甙≥5%。

选取540只健康、产蛋性能基本一致的26周龄尼克蛋鸡。采用单因子完全随机设计，试验鸡随机分成5个组，每组6个重复，每个重复18只。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中分别添加300、600、900、1 200 mg/kg的苜草素，试验期77 d，其中预试期7 d，正试期70 d。

试验基础饲粮为玉米-豆粕型，参照我国《鸡饲养标准》(NY /T 33—2004)产蛋鸡营养需要配制，基础饲粮组成及营养水平见表 1。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 59.00 豆粕 Soybean meal 22.00 菜籽粕 Rapeseed meal 2.60 棉籽粕 Cottonseed meal 2.00 豆油 Soybean oil 2.20 磷酸氢钙 CaHPO4 1.60 石粉 Limestone 8.20 食盐 NaCl 0.30 DL-蛋氨酸 DL-methionine 0.10 预混料 Premix1) 2.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 代谢能 ME/(MJ/kg) 11.34 粗蛋白质 CP 16.49 赖氨酸 Lys 0.79 蛋氨酸 Met 0.36 苏氨酸 Thr 0.61 钙 Ca 3.45 总磷 TP 0.61 有效磷 AP 0.41 1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 10 000 IU，VD3 1 800 IU，VE 10 IU，VK 10 mg，VB12 5 ug，硫胺素 thiamine l mg，核黄素 riboflavin 4.5 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 50 mg，烟酸 niacin 24.5 mg，吡哆醇 pyridoxine 5 mg，生物素 biotin 1 mg，叶酸 folic acid 1mg，胆碱 choline 500 mg，Mn 65 mg，I 0.4 mg，Fe 60 mg，Cu 8 mg，Zn 80 mg，Se 0.3 mg。 2)粗蛋白质、钙和总磷为实测值，其余为计算值。CP, Ca and TP were measured values, while the others were calculated values.

表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

试验鸡只采用3层阶梯式笼养，密闭式鸡舍，自控式湿帘降温通风系统，各组均匀分布于鸡舍不同空间，自由采食、饮水，每天光照16 h。每天饲喂2次(08:30、14:30)，15:00准时收集鸡蛋。每天观察鸡群健康状况，记录死淘鸡数，常规免疫、消毒和饲养管理。

正试期第35天和第70天，每个重复随机取3枚鸡蛋分离蛋黄，称重后装于10 mL离心管，于4 ℃冰箱保存。试验结束时，鸡称重求得每重复平均体重，每个重复选取与重复内平均体重差异不显著(P>0.05)的蛋鸡3只，空腹12 h后于左翅下采血5 mL于促凝管中，室温静置1 h后3 500 r/min离心15 min制成血清，分装于EP管中，-20 ℃保存备用。采血后鸡只屠宰分别取同部位的肝脏组织和卵泡组织各2 g左右放入冻存管快速置于液氮中速冻，-80 ℃保存待测。

蛋黄处理方法参照文献[21]，胆固醇提取后用0.45 μm有机微孔滤膜过滤，色谱柱测定。鸡蛋胆固醇含量用蛋黄胆固醇含量(mg/g)和全蛋胆固醇含量(mg/枚)2个指标表示^[22]。

血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量按照试剂盒说明书于采样后48 h内采用全波长酶标仪(美国Bio-Tek公司)进行测定，试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司。

取肝脏组织30 mg、卵巢组织50 mg，按照试剂盒(北京天恩泽有限公司)说明书提取总RNA，用紫外分光光度计(日本Hitachi公司)测定总 RNA浓度及纯度，所有样品吸光度比值 (OD260 nm/OD280 nm)在1.8～2.0，1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。用反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)将所有RNA样品进行反转录，反应采用10 μL体系，转录方法参照试剂盒说明书。获得的cDNA稀释10倍，-20 ℃保存备用。

根据GenBank上原鸡的cDNA序列，用Primer 5.0软件设计引物，将β-肌动蛋白(β-actin)设为内参基因。引物由上海英俊生物技术有限公司合成，引物详细资料见表 2。肝脏HMGCR、SREBP-2、CYP7A1和卵泡OVR的mRNA表达量，用荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)测定，配制每个样品3个重复。20 μL反应体系：0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水6 μL、cDNA模板2 μL、上及下游引物各1 μL、SYBR Green-Ⅱ(大连宝生物工程有限公司) 10 μL；循环条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。目的基因表达量的计算采用2^-ΔΔCT法^[23]，以β-actin表达量为参比。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 目的基因引物序列 Table 2 Primer sequences of the target genes 基因 Genes 序列编号 Sequence No. 产物大小 Product size/bp 引物序列 Primer sequence (5′—3′) β-肌动蛋白 β-actin NM_205518.1 114 上游：ATTGTCCACCGCAAATGCTTC 下游：AAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶 HMGCR NM-204485.1 173 上游：GCTGGAACTATGAGTGCCCAA 下游：TGAGAAGATTGTGAGGAGACCA 固醇结合蛋白元件-2 SREBP-2 XM_004937701.1 217 上游：CCAAGGAGAGCCTGTACTGC 下游：CCCATTGAGTCCAGGAAAGA 胆固醇7α-羟化酶 CYP7A1 NM-001001753.1 216 上游：CATTCACTGATACGCCAGGGA 下游：TCTTGACTGCAGCATGACGTA 卵黄蛋白原受体 OVR NM-205229.1 153 上游：TGTGACAGTGGAGAAGATGAAGAG 下游：AGGTGCACACTCCAACTCAT

表 2 目的基因引物序列 Table 2 Primer sequences of the target genes

试验数据采用SPSS 18.0进行单因素方差分析，组间平均值用Duncan氏法进行多重比较，数据均用“平均值±标准差”表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

由表 3可知，在试验第35天，600和900 mg/kg苜草素组的蛋黄胆固醇含量显著低于对照组和300 mg/kg苜草素组(P＜0.05)，900 mg/kg苜草素组的全蛋胆固醇含量显著低于对照组(P＜0.05)，各组的蛋黄重无显著差异(P>0.05)。试验第70天，900 mg/kg苜草素组的蛋黄胆固醇含量显著低于对照组(P＜0.05)，各组蛋黄重和全蛋胆固醇含量均无显著差异(P>0.05)，但 试验组的全蛋胆固醇有降低的趋势，与第35天测定结果基本趋于一致。

表 3

Table 3

表 3(Table 3)

表 3 苜草素对鸡蛋胆固醇含量的影响 Table 3 Effects of polysavone on cholesterol content of eggs 项目Items 时间Time/d 苜草素添加水平 Polysavone supplemental level/(mg/kg) P值 P-value 0 300 600 900 1 200 蛋黄胆固醇 35 11.57±0.84a 11.51±0.82a 10.71±0.98b 10.68±0.54b 11.13±0.89ab 0.028 Egg-yolk cholesterol/(mg/g) 70 11.50±0.79a 11.12±0.78ab 10.86±0.64ab 10.52±0.71b 11.07±0.56ab 0.038 蛋黄重 35 15.20±0.77 14.52±0.63 15.29±0.86 14.68±0.53 14.94±0.62 0.051 Yolk weight/g 70 15.69±0.91 15.95±0.74 15.54±0.68 15.89±0.61 16.03±0.65 0.528 全蛋胆固醇 35 175.92±15.09a 166.98±13.47ab 163.37±13.99ab 156.68±8.71b 166.42±16.72ab 0.037 Whole egg cholesterol/(mg/枚) 70 180.36±14.38 177.12±12.24 168.59±9.38 167.06±11.13 177.64±14.53 0.060 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表 3 苜草素对鸡蛋胆固醇含量的影响 Table 3 Effects of polysavone on cholesterol content of eggs

由表 4可知，饲粮中添加苜草素对蛋鸡血清中TC、TG、LDL-C含量无显著影响(P>0.05)。饲粮中添加苜草素对蛋鸡血清中HDL-C含量有显著影响(P＜0.05)，其中900 mg/kg苜草素组与对 照组差异显著(P＜0.05)，升高了37.74%。试验组的HDL/LDL均高于对照组，其中600和900 mg/kg苜草素组与对照组差异显著(P＜0.05)，分别升高了107.50%和102.50%。

表 4

Table 4

表 4(Table 4)

表 4 苜草素对蛋鸡血清生化指标的影响 Table 4 Effects of polysavone on serum biochemical parameters of laying hens mmol/L 项目Items 苜草素添加水平 Polysavone supplemental level/(mg/kg) P值 P-value 0 300 600 900 1 200 总胆固醇 TC 2.68±0.66 2.57±0.73 2.55±0.72 2.33±0.69 2.34±0.59 0.868 甘油三酯 TG 2.93±0.94 3.04±0.71 3.29±0.87 2.62±0.94 2.32±0.63 0.419 高密度脂蛋白胆固醇 HDL-C 0.53±0.11b 0.61±0.08ab 0.65±0.09ab 0.73±0.14a 0.62±0.08ab 0.036 低密度脂蛋白胆固醇 LDL-C 1.43±0.47 1.15±0.51 0.89±0.42 0.97±0.41 1.21±0.54 0.343 高密度脂蛋白/低密度脂蛋白HDL/LDL 0.40±0.15b 0.61±0.23ab 0.83±0.29a 0.81±0.23a 0.58±0.19ab 0.015

表 4 苜草素对蛋鸡血清生化指标的影响 Table 4 Effects of polysavone on serum biochemical parameters of laying hens

由表 5可知，与对照组相比，600、900、1 200 mg/kg苜草素组肝脏HMGCR mRNA的表达量分别下降了64.42%、62.50%、48.08%(P＜0.05)；与对照组相比，900和1 200 mg/kg苜草素组肝脏CYP7A1 mRNA的表达量分别升高了61.73%、69.14%(P＜0.05)。各组肝脏中SREBP-2和卵巢中OVR mRNA表达量没有显著差异(P>0.05)。

表 5

Table 5

表 5(Table 5)

表 5 苜草素对肝脏HMGR、SREBP-2、CYP7A1和卵泡OVR mRNA表达量的影响 Table 5 Effects of polysavone on mRNA expression of HMGR, SREBP-2, CYP7A1 in liver and OVR in ovarian follicle 项目Items 苜草素添加水平 Polysavone supplemental level/(mg/kg) P值 P-value 0 300 600 900 1 200 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶 HMGCR 1.04±0.32a 0.84±0.25ab 0.37±0.20c 0.39±0.18c 0.54±0.30bc ＜0.001 固醇结合蛋白元件-2 SREBP-2 1.05±0.34 1.28±0.56 1.00±0.33 1.02±0.99 1.31±0.79 0.857 胆固醇7α-羟化酶 CYP7A1 0.81±0.31a 0.96±0.34ab 1.22±0.28ab 1.31±0.20b 1.37±0.40b 0.035 卵黄蛋白原受体 OVR 1.03±0.59 1.02±0.72 1.16±0.46 0.77±0.58 0.94±0.80 0.874

表 5 苜草素对肝脏HMGR、SREBP-2、CYP7A1和卵泡OVR mRNA表达量的影响 Table 5 Effects of polysavone on mRNA expression of HMGR, SREBP-2, CYP7A1 in liver and OVR in ovarian follicle

研究表明，过量摄入高胆固醇食物(如鸡蛋)会危害患有心脏病、高血压、糖尿病等人群的健康^[24]，故降低鸡蛋中胆固醇含量对改善蛋品的食用价值具有重要意义。蛋鸡体内胆固醇主要与LDL受体结合，以极低密度脂蛋白(VLDL)形式随血液转运至卵母细胞，VLDL进入卵母细胞的量决定了蛋黄中胆固醇含量^[25]。大豆异黄酮中的金雀异黄素(genistein)通过抑制酪氨酸激酶降低LDL受体活性从而降低蛋黄中胆固醇的沉积^[26]。尹靖东等^[22]用40 mg/kg大豆黄酮饲喂28周龄蛋鸡，极显著降低了蛋黄和全蛋中胆固醇含量，并显著抑制了氧化胆固醇的形成。Malinow等^[27]发现，苜蓿皂苷通过抑制大鼠肠道对胆固醇的吸收进而降低血清中TC含量。有研究称皂苷主要通过与肠道胆固醇结合来促进胆固醇的排泄并降低其吸收，以此调节胆固醇代谢^[15]。侯永刚等^[28]报道，对蛋鸡饲喂60和90 mg/kg苜蓿皂苷，蛋黄、全蛋胆固醇含量显著和极显著降低。张丽娜等^[20] 发现，饲粮中添加苜草素对蛋黄胆固醇含量无显著影响，但1 000 mg/kg苜草素组能够显著降低全蛋中胆固醇含量且有降低蛋黄胆固醇含量的趋势。本研究结果表明，添加900 mg/kg苜草素显著降低了蛋黄胆固醇含量，说明苜草素对鸡蛋胆固醇含量有降低的作用，这可能与苜草素中的黄酮与皂甙等活性物质能够降低鸡蛋胆固醇含量有关，而与张丽娜等^[20]的结果有差异是由于本试验选取产蛋高峰期蛋鸡作为试验对象，而前人研究选用产蛋后期蛋鸡，蛋鸡年龄与鸡蛋中胆固醇含量存在显著相关性。但是苜草素的添加水平与其降低鸡蛋胆固醇的含量未呈线性关系，只有添加适当水平苜草素才能发挥其最大效果。

王长康等^[19]在肉鸡上的研究结果显示，苜草素试验组显著降低血清中TC和雌二醇(E2)含量，但不影响血清HDL-C含量。董晓芳等^[29]也有相似报道，在给1日龄肉仔鸡饲粮添加500 mg/kg苜草素，28和42 d后分别显著降低血清中TG和TC含量。谢泰华等^[30]在28周龄蛋鸡中添加苜草素对血脂指标无显著影响，但对血清TC、LDL-C含量有降低的趋势。而本试验添加苜草素使蛋鸡血清中TC和LDL-C含量较对照组有所降低但不显著，与前人研究的结果相似，但本试验添加苜草素组均不同程度升高血清HDL-C含量和HDL/LDL，与前人研究的结果有异，其主要原因：一是苜草素对肉鸡和蛋鸡血脂指标的影响效果不同可能与鸡种有关，肉鸡胆固醇代谢与其生长发育的脂肪代谢有关，而产蛋鸡胆固醇代谢主要是围绕蛋黄胆固醇形成进行，这两者不同的胆固醇代谢模式对鸡来讲，其代谢机制可能不同，且本试验苜草素的添加水平与前人不同也可能是造成结果差异的原因；二是本试验中各组蛋鸡血清TC含量未出现显著差异，说明苜草素对蛋鸡循环着的血液总TC与蛋黄胆固醇的作用间没有必然相关关系^[31]，而苜草素提高HDL-C含量和HDL/LDL，其一说明其更有利于HDL将肝外组织中TC运回肝脏，在肝脏经代谢转化或以非酯化的形式形成胆汁酸从而排泄掉^[32]，这种功效与胆固醇在机体内的转运有关；其二说明血清中HDL/LDL与鸡蛋胆固醇含量存在显著负相关的关系。

本研究表明，苜草素影响鸡蛋胆固醇含量，但与其饲粮添加水平不呈线性关系，这种效应的代谢特征主要表现在提高蛋鸡血液HDL-C含量和HDL/LDL。本试验探讨了这种代谢影响的相关基因调控机制。禽类的胆固醇主要在肝脏组织和卵巢组织中合成。研究表明，HMGCR和SREBP-2、CYP7A1、OVR分别在蛋鸡胆固醇的合成、排泄、沉积过程中调控着关键作用^{[33, 34]}。

蛋鸡从饲料中获取的外源性胆固醇十分有限，主要是通过从头合成途径满足机体胆固醇的需求。HMGCR是胆固醇合成的限速酶，通过调控HMGCR mRNA的表达可以控制血清和蛋黄中的胆固醇含量^[33]。Elkin等^[34]添加0.06%的阿托瓦他丁显著降低肝脏细胞HMGCR mRNA的表达量，并使蛋黄中胆固醇含量下降35%。本试验表明，添加600和900 mg/kg苜草素使蛋鸡肝脏HMGCR mRNA的表达量分别下降了64.42%、62.50%，而添加1 200 mg/kg苜草素组鸡肝脏HMGCR mRNA的表达量降低了48.08%，这种效果与其降低蛋黄胆固醇和全蛋胆固醇的试验效果相一致，并能在一定程度上解释苜草素影响鸡蛋胆固醇含量与其饲粮添加水平不呈线性关系之故。说明苜草素可以通过降低HMGCR mRNA的表达来达到降低鸡蛋胆固醇含量的目的，而对血清中TC含量影响不显著是由于血清TC含量受到许多因素的影响，它不仅是由胆固醇合成的限速酶基因的表达水平决定的。SREBP-2是转录因子SREBPs的一种，通过在转录水平上促进HMGCR的表达来特异性调控胆固醇代谢，但SREBP-2通常在胆固醇含量较低时才发挥作用^[35]。本试验中饲粮添加苜草素未能改变鸡肝脏SREBP-2 mRNA表达量，说明苜草素没有通过SREBPs通路在转录水平来调控HMGCR mRNA表达。CYP7A1是动物肝脏中胆汁酸合成的限速酶，Shi等^[36]研究表明：苜蓿皂苷能上调高脂大鼠CYP7A1的表达，增强CYP7A1活性，从而加强了粪便中胆汁酸的分泌。本试验中添加900和1 200 mg/kg苜草素蛋鸡CYP7A1 mRNA表达量显著高于对照组，且饲粮添加900 mg/kg苜草素鸡蛋胆固醇降低效果最明显，这与苜草素中含有一定的苜蓿皂苷有关。推测CYP7A1 mRNA表达量的增加会提高CYP7A1的活性，加快蛋鸡肝脏胆固醇向胆汁酸的转化，进而血清中HDL-C含量显著增加，限制了胆固醇向鸡蛋蛋黄中的沉积量。说明苜草素增强蛋鸡肝脏胆固醇的排泄也可能是其调控胆固醇代谢的途径之一。蛋黄几乎包含了鸡蛋中全部胆固醇，蛋黄胆固醇的沉积过程主要通过OVR介导的内吞作用将VLDL携带的胆固醇转运至发育中的卵母细胞，随卵母细胞的生长最终形成蛋黄^[37]，OVR的内呑作用与蛋鸡的繁殖性能至关重要。本试验中饲粮添加苜草素并未影响蛋鸡卵巢中OVR mRNA的表达量，说明苜草素影响鸡蛋胆固醇含量的调控并未发生在蛋黄胆固醇的沉积环节。综上，苜草素影响鸡蛋胆固醇含量的主要调控途径可能是通过抑制蛋鸡胆固醇的内源性合成和促进胆固醇的排泄来进行。

① 饲粮添加苜草素能降低蛋黄胆固醇和全蛋胆固醇含量，本试验推荐26~35周龄蛋鸡饲粮苜草素添加水平为900 mg/kg。

② 苜草素降低鸡蛋胆固醇含量的代谢特征主要是提高蛋鸡血清HDL-C含量和HDL/LDL，其调控机制主要是通过下调HMGCR mRNA的表达量来抑制蛋鸡胆固醇的内源性合成和上调CYP7A1 mRNA的表达量来促进胆固醇向胆汁酸的转化排泄2种途径来实现。