2. 甘肃农业大学动物医学院, 兰州 730070
2. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
反刍动物可以消化利用粗饲料，是由于其瘤胃内栖息着大量的微生物，这些微生物包括细菌、原虫、古菌和真菌[1]。这些微生物可以将植物纤维转化为易消化的化合物，然后被宿主进一步吸收利用[2]。经过长期的选择和进化，微生物与宿主间已经形成了相互制约相互依赖的关系，这种关系对于维持反刍动物健康、提高生产性能等起到至关重要的作用[3, 4, 5]。其中瘤胃细菌起着重要的作用[6]，种类(50多个种属)和数量(1010~1011个/mL)也最多[7]。目前，白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus,R.albus)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens,R.flavefaciens)和产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes,F.succinogenes)是研究饲粮纤维降解过程中研究最多的菌,也是被公认的瘤胃三大优势纤维分解菌[8]。研究表明绝大部分的瘤胃厌氧真菌都能分解纤维素，都具有高活性的降解植物细胞壁的纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和酯酶[9]。原虫约占到瘤胃内容物总生物量的1/2[10]，部分纤毛原虫在消化纤维物质的同时还可以使甲烷的产量增加[11]。大量研究表明，瘤胃微生物的组成及丰度受很多因素的影响，如动物个体差异[12]、精粗比[13]和饲粮组成,且饲粮因素最为关键[14, 15]。目前，国内已经普遍将玉米青贮和燕麦干草作为反刍动物饲粮中粗纤维的主要来源[16]，但是其在瘤胃内的消化机理及对微生物区系的影响研究报道较少。本试验通过给绵羊饲喂不同燕麦干草含量的粗饲料，采用实时定量PCR技术对瘤胃中真菌、原虫和3种纤维分解菌进行定量研究，为进一步研究饲粮结构对瘤胃微生物区系的影响及提高绵羊对粗饲料利用率提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计及饲养管理选取9只体况和体重[(70.32±2.14) kg]相近，装有永久性瘘管的德国美利奴与蒙古羊杂种公羊为试验动物。粗饲料为全株玉米青贮和燕麦干草，燕麦干草由铡草机铡成3~5 cm长，精饲料由玉米、棉籽粕、菜籽粕、预混料等组成。
采用3×3拉丁方设计，9只羊随机分为3组，每组3只，各组分别采用全株玉米青贮、全株玉米青贮+燕麦干草(1∶1)(混合组)、燕麦干草为粗饲料。饲粮精粗比34.50∶65.50。试验饲粮组成及营养水平见表 1。进行3期饲养试验，每期20 d，15 d预试期，5 d采样期。
 | 表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
试验羊单栏饲养，每天分别于08:00和18:00分2次等量饲喂，自由饮水。
1.2 样品采集分别于每期试验最后1 d饲喂前(0 h)、饲喂后1、3、5和7 h采集瘤胃液，立即用HI98103型笔式酸度计(北京泰亚赛福有限公司)测定瘤胃液pH，经4层灭菌纱布过滤，滤液装于经高压灭菌的采样管内，-70 ℃保存。
1.3 引物设计与合成根据GenBank上白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的16S rRNA序列，真菌、原虫的18S rRNA序列，利用Primer Premier 3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)分别设计特异性引物，结果见表 2。引物由上海生物工程有限公司合成。
| 表 2 瘤胃微生物实时定量PCR的引物序列 Table 2 Primer sequences of rumen microorganisms for RT-qPCR |
瘤胃微生物总DNA的提取利用天根生化科技(北京)有限公司粪样DNA提取试剂盒(DP328)进行。瘤胃微生物定量采用实时定量PCR比较阈值法，目的菌相对含量计算采用2-∆∆Ct法。PCR反应体系及反应参数参照Roche试剂盒(Gat.No.06402712001)说明书进行。反应体系(20 μL)为：Master Mix 10 μL，模板2 μL(20 ng)，上、下游引物各0.6 μL，ddH2O 6.8 μL。反应参数为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。在延伸期收集荧光信号。
1.5 数据处理试验数据用Excel 2010建立数据库，通过SPSS 19.0软件中的单因素方差分析对数据进行统计分析和显著性检验，运用LSD法进行多重比较，结果用平均值±标准误表示，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2 结 果 2.1 饲粮中燕麦干草含量对绵羊瘤胃液pH的影响由表 3可知，3组瘤胃液pH随时间的推移都呈先降低再升高的趋势，且晨饲前(0 h)3组瘤胃液pH都最高，晨饲后开始下降，3 h下降至最低后开始上升。晨饲前全株玉米青贮组瘤胃液pH最高，且显著高于燕麦干草组(P＜0.05)。饲喂后1和5 h，全株玉米青贮组显著低于燕麦干草组(P＜0.05)，且饲喂后3 h全株玉米青贮组极显著低于混合组(P＜0.01)。
| 表 3 饲粮中燕麦干草含量对绵羊瘤液pH的影响 Table 3 Effects of dried oat hay content in diet on rumen fluid pH of sheep |
由表 4可知，以全株玉米青贮组作为为对照分析燕麦干草含量对绵羊瘤胃液真菌相对含量的影响，混合组、燕麦干草组真菌相对含量随时间的变化有所不同。混合组、燕麦干草组均在0 h真菌的相对含量最高，饲喂后3 h降至最低。晨饲前混合组和燕麦干草组的真菌相对含量极显著高于全株玉米青贮组(P＜0.01)，喂后1 h这2组真菌相对含量下降，混合组显著低于全株玉米青贮组(P＜0.05)。喂后3 h混合组和燕麦干草组分别极显著(P＜0.01)、显著(P＜0.05)低于全株玉米青贮组。喂后5 h燕麦干草组真菌相对含量显著高于全株 玉米青贮组(P＜0.05)。喂后7 h燕麦干草组、混合组与全株玉米青贮组差异不显著(P>0.05)。
| 表 4 饲粮中燕麦干草含量对绵羊瘤胃液真菌相对含量的影响 Table 4 Effects of dried oat hay content in diet on relative content of fungus in rumen fluid of sheep |
由表 5可知，以全株玉米青贮组作为对照分析燕麦干草含量对绵羊瘤胃液原虫相对含量的影响，随时间的延长瘤胃液原虫的相对含量变化趋势不同，但混合组和燕麦干草组原虫相对含量都在饲喂后3 h最高。混合组在饲喂后1和5 h显著 低于青贮组(P＜0.05)。而燕麦干草组原虫相对含量在喂后0和3 h分别等于、高于全株玉米青贮组外，其他时间点均低于全株玉米青贮组，且7 h降至最低。
| 表 5 饲粮中燕麦干草含量对绵羊瘤胃液原虫相对含量的影响 Table 5 Effects of dried oat hay content in diet on relative content of protozoa in rumen fluid of sheep |
由表 6可知，以全株玉米青贮组作为对照分析燕麦干草含量对绵羊瘤胃液黄色瘤胃球菌相对含量的影响，随时间的延长瘤胃液黄色瘤胃球菌的相对含量呈降低升高再降低的趋势。燕麦干草 组在喂后1 h极显著低于全株玉米青贮组(P＜0.01)，喂后3和7 h显著或极显著低于其他2组(P＜0.05或P＜0.01)。喂后5 h混合组和燕麦干草组黄色瘤胃球菌相对含量均高于全株玉米青贮组，且燕麦干草组显著高于其他2组(P＜0.05)。
| 表 6 饲粮中燕麦干草含量对绵羊瘤胃液黄色瘤胃球菌相对含量的影响 Table 6 Effects of dried oat hay content in diet on relative content of R.flavefaciens in rumen fluid of sheep |
由表 7可知，以全株玉米青贮组作为对照分析燕麦干草含量对绵羊瘤胃液白色瘤胃球菌相对含量的影响，混合组和燕麦干草组白色瘤胃球菌相对含量在0~7 h均高于全株玉米青贮组，且随时间延长呈先降低后升高再降低的趋势。除喂后1 h混合组和燕麦干草组显著高于全株玉米青贮组(P＜0.05)外，其他时间均极显著高于全株玉米青贮组(P＜0.01)。而且，喂后5和7 h燕麦干草组分别显著(P＜0.05)、极显著(P＜0.01)高于混合组。
| 表 7 饲粮中燕麦干草含量对绵羊瘤胃液白色瘤胃球菌相对含量的影响 Table 7 Effects of dried oat hay content in diet on relative content of R.albus in rumen fluid of sheep |
由表 8可知，以全株玉米青贮组作为对照分析燕麦干草含量对绵羊瘤胃液产琥珀酸丝状杆菌相对含量的影响，随时间延长产琥珀酸丝状杆菌的相对含量变化不一致。混合组在1 h极显著高于全株玉米青贮组和燕麦干草组(P＜0.01)。全株玉米青贮组在5 h极显著低于混合组和燕麦干草组(P＜0.01)。混合组在5 h显著高于燕麦干草组(P＜0.05)。燕麦干草组在7 h时显著高于混合组(P＜0.05)。
| 表 8 饲粮中燕麦干草含量对绵羊瘤胃液产琥珀酸丝状杆菌相对含量的影响 Table 8 Effects of dried oat hay content in diet on relative content of F.succinogenes in rumen fluid of sheep |
瘤胃液pH是综合反映反刍动物瘤胃发酵水平和内环境的重要指标，可以通过测定瘤胃液pH评定瘤胃发酵[19]。通常瘤胃液pH维持在6.0~7.0的范围内[20]。本试验中，瘤胃液pH维持在5.8~6.7之间，3组瘤胃液pH随时间的延长均呈先降低后升高的变化趋势，0 h pH最高，饲喂后逐渐下降至3 h pH达到最低，该结果与其他研究结果基本一致。王洪亮等[21]研究显示，在对肉牛饲喂不同粗饲料后，各组瘤胃液pH均降低，且在2~4 h降至最低，采食后8~10 h又回升至采食前水平，但组间pH无显著差异。郭勇庆等[22]研究表明，瘤胃发酵生理过程的最适pH各不相同，消化纤维素时pH最适范围为6.0~6.8，合成蛋白质时pH的最适范围为5.8~7.4，产生挥发性脂肪酸(VFA)时pH最适范围为4.2~6.6，氨产生最适pH为6.2。瘤胃液pH是食糜中VFA与唾液中缓冲液相互作用以及瘤胃上皮对VFA吸收及随食糜流出等因素综合作用的结果[24]。本试验中，全株玉米青贮组瘤胃液pH在1~3 h内略低于6.0，这可能是由于瘤胃微生物消化分解饲粮中碳水化合物产生大量了VFA所致[24]。随着饲粮被消化，唾液等缓冲性物质的增加，使得瘤胃液pH开始缓慢回升。3组瘤胃液pH差异不显著，说明精料水平在30%~50%时对瘤胃液pH影响较小[25, 26]。但是，混合组和燕麦干草组的瘤胃液pH高于全株玉米青贮组，可能是由于燕麦干草的结构性碳水化合物含量高于全株玉米青贮，适口性较低，采食速度慢，导致其在瘤胃内降解率、外排速度低，滞留时间长[24]。
3.2 饲粮中燕麦干草含量对绵羊瘤胃液真菌、原虫及纤维分解菌相对含量的影响本试验中，混合组和燕麦干草组瘤胃液真菌相对含量在0 h极显著高于全株玉米青贮组，饲喂后0~3 h随着3种瘤胃液细菌相对含量的增加，真菌的含量急剧下降。导致此现象出现的原因可能是真菌更偏向于利用饲粮中的木质素而非纤维素类物质[27]。同时，由于其在瘤胃总微生物所占比例较低，所以对纤维降解的总体贡献要小于瘤胃细菌[28]。早期的研究表明，白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌能抑制厌氧真菌对玉米茎和纤维素的降解能力[29, 30]。本试验中，燕麦干草组在饲喂后5 h时真菌和3种纤维分解菌的相对含量均较高，但3种纤维分解菌的相对含量高于真菌，说明瘤胃真菌与细菌存在拮抗作用[31]。Atasoglu等[32]研究认为，不同饲粮类型对瘤胃真菌种群有明显的影响，当饲喂纤维素含量较高的饲粮时，动物瘤胃中的真菌数量要比饲喂低纤维素饲粮动物多。这与本试验中混合组与燕麦干草组真菌在0 h的相对含量高于全株玉米青贮组的结果一致。
Jounay等[10]研究表明，原虫的主要发酵底物是淀粉和可溶性糖类。本试验中，混合组和燕麦干草组原虫的相对含量除在3 h高于全株玉米青贮组外，其他时间点均接近或低于全株玉米青贮组，而且低于同水平下3种纤维分解菌和真菌的相对含量。NRC(2001)指出，燕麦干草的非结构性碳水化合物(non structure carbohydrates,NSC)含量为13.6%(干物质基础)，低于全株玉米青贮(34.7%)。这表明给绵羊饲喂燕麦干草时，真菌和纤维分解菌起主要作用。
产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是瘤胃中最主要的纤维分解细菌，它们消化纤维素的能力要强于其他纤维分解菌，在牛瘤胃的总纤维分解菌中所占比例分别为33.0%、2.6%和46.0%[33]。本试验中，混合组和燕麦干草组产琥珀酸丝状杆菌和白色瘤胃球菌的相对含量显著高于全株玉米青贮组，表明给绵羊饲喂燕麦干草时，白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌为优势菌群。这可能是因为白色瘤胃球菌比黄色瘤胃球菌更具有亲和力，附着纤维的能力远高于黄色瘤胃球菌，它们在吸附过程中存在相同的吸附位点和屏障，白色瘤胃球菌可以抢占黄色瘤胃球菌的吸附位点。而黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌由于吸附位点不一致，几乎不存在竞争关系，但是，当黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌完全定植后，白色瘤胃球菌的吸附会增加黄色瘤胃球菌的脱落[34]。
4 结 论① 在精粗比为34.50∶65.50的饲粮中采用全株玉米青贮+燕麦干草(1∶1)的粗饲料，可以使绵羊瘤胃液pH维持在正常范围内，有利于维持瘤胃内环境稳态和瘤胃微生物的生长。
② 在精粗比为34.50∶65.50的饲粮中采用全株玉米青贮+燕麦干草(1∶1)的粗饲料，绵羊瘤胃内原虫数量下降，而3种主要的纤维分解菌数量升高，且白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌为优势菌群。
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