2. 广东溢多利生物科技股份有限公司, 珠海 519060;
3. 上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306;
4. 上海市水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306;
5. 上海高校知识服务平台, 上海海洋大学水产动物遗传育种中心(ZF1206), 上海 201306
2. Guangdong VTR Bio-Tech Co., Ltd., Zhuhai 519060, China;
3. Key Laboratory of Freshwater Fishery Cermplasm Resources, Ministry of Aquaculture, Shanghai 201306, China;
4. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai 201306, China;
5. Shanghai University Knowledge Service Platform Aquatic Animal Breeding Center(ZF1206), Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
磷是鱼体所必需的矿物元素，饲料中缺乏磷会影响机体中间代谢，导致生长和饲料转化率降低、骨骼畸形、脂肪堆积[1, 2]。由于磷在水中的含量较少，所以必须由饲料中提供充足的磷。尽管植物性原料中含有丰富的磷，但大多以植酸磷的形式存在，难以为动物所利用[3, 4, 5]，因此通常的方法是添加无机磷酸盐来满足水产动物对磷的需求。但这不但增加饲料成本，更重要的是大量未被利用的植酸磷和未消化的磷酸盐排泄进入水体，对环境造成严重污染。
植酸，即六磷酸肌醇，是植物中磷的主要贮存形式，具有极强的鳌合能力，能与钙、镁、钾、钠、锌、铁、铜、锰等物质形成不溶性的盐类络合蛋白质，抑制消化酶活性。研究表明，植酸可降低饲料中矿物质的利用率[6, 7]，降低蛋白质的消化利用[8]。
植酸酶能够将植酸(盐)降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸(盐)结合的其他营养物质，提高营养物质的利用率，并减少无机磷酸盐的添加量。植酸酶有多个最适pH范围，根据最适pH的不同，有中性植酸酶和酸性植酸酶之分。酸性植酸酶的适宜pH范围一般为2.0～7.0，中性植酸酶的适宜pH在7.0左右。近年来，酸性植酸酶已在鸡[9, 10]、鸭[11]、猪[12, 13, 14]等畜禽动物上进行了较为广泛的研究和应用，在水产动物上的研究已见于斑点叉尾 (Ictalurus puuctatus)[15]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[16]、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[17]等。中性植酸酶主要应用于无胃、前肠呈中性的淡水鲤科鱼类饲料中。异育银鲫(Carassius auratus gibelio)是以天然雌核发育的方正银鲫为母本，以兴国红鲤为父本，经人工授精繁育的子代，具有生长快、抗逆性强等特点，已成为我国鲫鱼养殖的主要品种。本试验主要研究在饲料中添加不同水平中性植酸酶替代磷酸二氢钙对异育银鲫生长、体成分及营养物质消化率、沉积率和血浆生化指标的影响，为中性植酸酶在水产饲料中的合理应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料耐高温中性植酸酶由广东溢多利生物科技股份有限公司提供，适宜pH范围为4.5～8.0(无胃鱼消化道中pH为6.5～8.4)，活性为2 000 IU/g。
1.2 试验设计共配制6种试验饲料，分别为磷酸二氢钙含量为1.5%的正对照饲料和磷酸二氢钙含量分别为1.0%、0.5%的负对照饲料，在含1.0%磷酸二氢钙饲料中分别添加400、800 IU/kg中性植酸酶以及在含0.5%磷酸二氢钙饲料中添加400 IU/kg中性植酸酶的试验饲料。中性植酸酶的添加量是在参考文献[18]的基础上适当降低。饲料中添加0.05%的三氧化二钇(Y2O3)为内源指示剂，用于营养物质表观消化率的测定。各原料过40目筛，逐级混匀，用单螺杆挤压机(SLP-45，中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所研制)制成直径为2 mm的沉性颗粒饲料[制粒温度(85±5) ℃]，饲料于通风阴凉处晾干，置于4 ℃冰箱中保存备用。试验饲料组成及营养水平见表 1。
 | 表 1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis)1) |
试验用异育银鲫购自浙江金华异育银鲫育苗场，正式试验前，用含0.5%磷酸二氢钙饲料饲喂异育银鲫2周，使其逐渐适应试验饲料。选出270尾体格健壮、体重[(39.0±3.0) g]均匀的异育银鲫，随机分为6个组，每组3个重复(缸)，每个重复放养15尾鱼。采用室内充气循环水养殖系统，每个试验缸大小为0.60 m×0.50 m×0.50 m(135 L)。每日吸污，保持水质清新，同时更换1/10水量；试验期间每天投喂3次(08:30、11:30和16:30)，每次投喂时间约20 min，投饲率为2.5%～3.0%，根据摄食情况作相应调整，以达到表观饱食并无剩余残饵，各缸保持基本一致的投饲量。饲养期间水温(26.0±2.0) ℃，pH 6.5～7.3；溶解氧浓度>4 mg/L。
1.4 测定指标和方法 1.4.1 生长指标和形体指标养殖试验结束后，鱼体饥饿24 h，统计每缸鱼尾数并称重，计算增重率(weight gain rate,WGR)、饲料系数(feed conversion ratio,FCR)、存活率(survival rate,SR)。每缸取3尾鱼，测量其体长、体重，解剖取内脏团、肝胰脏并称重，计算肝体比(hepato-somatic index,HSI)、脏体比(viscero-somatic index,VSI)、肥满度(condition factor,CF)。
增重率(%)=100×[末重(g)-初重(g)]/初重(g)；
饲料系数=摄食量(g)/体增重(g)；
存活率(%)=100×末尾数/初尾数；
肝体比(%)=100×肝脏重(g)/体重(g)；
脏体比(%)=100×内脏重(g)/体重(g)；
肥满度(%)=100×体重(g)/体长(cm)3。
1.4.2 饲料、全鱼、椎骨组成及营养物质沉积率在养殖试验开始前，取6尾鱼进行初始鱼的全鱼常规营养成分分析。养殖试验结束后，每缸取3尾鱼(每组9尾)，置于-20 ℃冰箱中冻存，用于全鱼常规营养成分分析。将剔除内脏及两侧肌肉的鱼体微波加热5 min，去掉头骨，将脊椎骨剥离干净，于105 ℃烘干后在-20 ℃保存，用于测定椎骨钙、磷含量。饲料、全鱼椎骨营养成分的测定方法如下：水分含量采用105 ℃烘干法测定；粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(2300全自动分析仪，瑞士)测定；粗脂肪含量采用索氏提取法测定；粗灰分含量采用550 ℃灼烧法(SXL-1008马弗炉，上海精宏实验设备有限公司)；钙、磷含量的测定分别采用钙甲基百里香酚蓝和磷钼酸试剂盒测定，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。在上述数据的基础上，计算蛋白质、脂肪、灰分和磷的沉积率。
蛋白质沉积率(%)=100×(Wt×Wtp-W0×W0p)/(Wf×Wfp)；
脂肪沉积率(%)=100×(Wt×Wtl-W0×W0l)/(Wf×Wfl)；
灰分沉积率(%)=100×(Wt×Wta-W0×W0a)/(Wf×Wfa)；
磷沉积率(%)=100×(Wt×Wtph-W0×W0ph)/(Wf×Wfph)。
式中:W0为初重(g)；Wt为末重(g)；Wtp为末全鱼粗蛋白质含量；Wtl为末全鱼粗脂肪含量；Wta为末全鱼粗灰分含量；Wtph为末全鱼磷含量；W0p为初全鱼粗蛋白质含量；W0l为初全鱼粗脂肪含量；W0a为初全鱼粗灰分含量；W0ph为初全鱼磷含量；Wf为饲料投喂量；Wfp为饲料粗蛋白质含量；Wfl为饲料粗脂肪含量；Wfa为饲料粗灰分含量；Wfph为饲料磷含量。
1.4.3 营养物质表观消化率在养殖试验的后2周，采用虹吸法收集粪便(每天于投饲后1 h后开始收集粪便，1 d 2次，取包膜完整的粪便于60 ℃烘干，-20 ℃保存待测)。测定指标包括饲料、粪便中的干物质、粗蛋白质、磷、Y2O3含量，计算干物质、蛋白质和磷的表观消化率。钇元素采用等离子体发射光谱(ICP)法测定，其他指标的测定方法同1.3.2。
干物质表观消化率(%)=100×(a-b)/a；
蛋白质表观消化率(%)=100×(a×c-b×d)/(a×c)；
磷表观消化率(%)=100×(a×e-b×f)/(a×e)。
式中：a为粪便中指示剂的含量；b为饲料中指示剂的含量；c为饲料中粗蛋白质的含量；d为粪便中粗蛋白质的含量；e为饲料中磷的含量；f为粪便中磷的含量。
1.4.4 血浆生化指标养殖试验结束后，饥饿24 h后每缸取5尾鱼，用经肝素钠试剂润洗后的注射器进行尾静脉采血，4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取血浆于-80 ℃冷冻待测。血浆生化指标通过全自动生化分析仪(迈瑞BS-200，深圳)测定，包括碱性磷酸酶(ALP)(AMP缓冲液法)活性及甘油三酯(TG)(氧化酶法)、总蛋白(TP)(双缩脲法)、ALB(白蛋白)(溴甲酚绿法)、磷(磷钼酸法)、钙(偶氮胂法)含量。
1.5 数据统计与分析试验结果以平均值±标准差表示，使用SPSS 17.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，差异显著者用Duncan氏法进行多重比较，差异显著水平为P＜0.05。
2 结 果 2.1 生长性能和形体指标由表 2可知，在不添加中性植酸酶的情况下，随磷酸二氢钙添加量由0.5%增加到1.5%，异育银鲫的增重率显著增加(P＜0.05)，饲料系数和肝体比、脏体比显著降低(P＜0.05)，肥满度无显著变化(P>0.05)；在含1.0%磷酸二氢钙饲料中添加400 IU/kg中性植酸酶后，增重率提高了9.2%(P>0.05)，而添加800 IU/kg中性植酸酶后，增重率提高了11.8%(P＜0.05)，达到与1.5%磷酸二氢钙组基本一致的水平，且有降低饲料系数的趋势(P＜0.10)；在含0.5%磷酸二氢钙饲料中添加400 IU/kg中性植酸酶后，增重率有提高的趋势(P＜0.10)，并达到与1.0%磷酸二氢钙组基本一致的水平。试验结束时，各组存活率均为100%。
| 表 2 不同磷酸二氢钙含量饲料中添加中性植酸酶对异育银鲫生长和形体指标的影响 Table 2 Effects of supplementation of neutral phytase in diets with various monocalcium phosphate contents on growth and body indices of allogyogenetics silver crucian carp (Carassius auratus gibelio) |
由表 3可知，全鱼水分、粗蛋白质、粗灰分含量在各组间无显著差异(P>0.05)；在不添加中性植酸酶的情况下，随磷酸二氢钙添加量由0.5%增加到1.5%，全鱼粗脂肪含量显著降低(P＜0.05)；在含1.0%磷酸二氢钙饲料中添加800 IU/kg中性植酸酶后，全鱼粗脂肪含量显著降低(P＜0.05)；在含0.5%磷酸二氢钙饲料中添加400 IU/kg中性植酸酶后，全鱼粗脂肪含量有降低的趋势(P＜0.10)。
| 表 3 不同磷酸二氢钙含量饲料中添加中性植酸酶对异育银鲫体成分及营养物质沉积率的影响 Table 3 Effects of supplementation of neutral phytase in diets with various monocalcium phosphate contents on body composition and nutrient deposition rates of allogyogenetics silver crucian carp (Carassius auratus gibelio) |
在营养物质沉积率方面，在不添加中性植酸酶的情况下，随磷酸二氢钙添加量由0.5%增加到1.5%，蛋白质和灰分沉积率显著升高(P＜0.05)，脂肪沉积率无显著变化(P>0.05)；在含1.0%磷酸二氢钙饲料中添加800 IU/kg中性植酸酶后，蛋白质和灰分沉积率显著升高(P＜0.05)，并达到与1.5%磷酸二氢钙组基本一致的水平。在不添加中性植酸酶的情况下，1.5%磷酸二氢钙组的磷沉积率显著高于0.5%和1.0%磷酸二氢钙组(P＜0.05)，但0.5%、1.0%磷酸二氢钙组间无显著差异(P>0.05)；在含1.0%磷酸二氢钙饲料中添加400和800 IU/kg中性植酸酶均显著提高了磷沉积率(P＜0.05)，在含0.5%磷酸二氢钙饲料中添加400 IU/kg中性植酸酶也显著提高了磷沉积率(P＜0.05)。
2.3 干物质、蛋白质和磷的表观消化率以及椎骨钙、磷、粗灰分含量由表 4可知，各组在蛋白质表观消化率上无显著差异(P>0.05)。在不添加中性植酸酶的情况下，随磷酸二氢钙添加量由0.5%增加到1.5%，干物质和磷表观消化率显著增加(P＜0.05)；在含1.0%磷酸二氢钙饲料中添加400 IU/kg中性植酸酶后，磷表观消化率显著升高(P＜0.05)，而添加800 IU/kg中性植酸酶后，干物质和磷表观消化率均显著升高(P＜0.05)；在含0.5%磷酸二氢钙饲料中添加400 IU/kg中性植酸酶后，磷表观消化率显著升高(P＜0.05)，干物质表观消化率也有升高的趋势(P＜0.10)。
| 表 4 不同磷酸二氢钙含量饲料中添加中性植酸酶对异育银鲫营养物质表观消化率及椎骨钙、磷、粗灰分含量的影响 Table 4 Effects of supplementation of neutral phytase in diets with various monocalcium phosphate contents on apparent digestibility of nutrients and contents of Ca, P and ash in vertebra of allogyogenetics silver crucian carp (Carassius auratus gibelio) |
在不添加中性植酸酶的情况下，随磷酸二氢钙添加量由0.5%增加到1.5%，椎骨钙、磷含量显著增加(P＜0.05)，椎骨粗灰分含量无显著变化(P>0.05)；在含1.0%磷酸二氢钙饲料中添加800 IU/kg中性植酸酶后，椎骨钙含量显著升高(P＜0.05)，椎骨磷含量无显著变化(P>0.05)；在含0.5%磷酸二氢钙饲料中添加400 IU/kg中性植酸酶后，椎骨钙、磷含量在数值上均有所增加(P>0.05)。
2.4 血浆生化指标由表 5可知，各组在血浆TP、ALB、钙、磷含量上均无显著差异(P>0.05)；在不添加中性植酸酶的情况下，随着磷酸二氢钙添加量的升高，血浆ALP活性显著降低(P＜0.05)；在含1.0%磷酸二氢钙饲料中添加400和800 IU/kg中性植酸酶均显 著降低了血浆ALP活性(P＜0.05)；在含0.5%磷酸二氢钙饲料中添加400 IU/kg中性植酸酶也显著降低了血浆ALP活性(P＜0.05)。在含1.0%磷酸二氢钙饲料中添加400和800 IU/kg中性植酸酶组血浆TG含量显著高于其他各组(P＜0.05)。
| 表 5 不同磷酸二氢钙含量饲料中添加中性植酸酶对异育银鲫血浆生化指标的影响 Table 5 Effects of supplementation of neutral phytase in diets with various monocalcium phosphate contents on plasma biochemical indices of allogyogenetics silver crucian carp (Carassius auratus gibelio) |
植酸的特殊结构与理化特性使其对大量矿物元素及一些蛋白质活性物质具有很强的螯合作用。植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和磷酸的一类酶，同时释放出与植酸(盐)结合的其他营养物质，提高营养物质的利用率，提高动物的增重率，并减少饲料中无机磷酸盐的添加量，减少粪磷的排放。我国主养鲤科鱼类多属于无胃鱼，消化道pH多呈中性，中性植酸酶更适合无胃鱼。本研究中，在含1.0%磷酸二氢钙饲料中添加800 IU/kg中性植酸酶后增重率提高了11.8%，同时干物质和磷的表观消化率显著提高，表明饲料中的中性植酸酶释放了植酸螯合的营养物质和磷，使得更多的营养物质和磷能够被利用[19]，满足了异育银鲫对磷的需求，提高了磷的消化率，促进了鱼体的生长。张璐等[20]发现，饲料中添加200 mg/kg酸性植酸酶使鲈鱼(Lateolabra×japonicus Cuvier)的增重率从859.3%提高到947.2%；类似报道见于尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)[21]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[22]等。在花鲈(Lateolabrax japonicus)试验中，在磷酸二氢钙的添加量减少了60%~100%的情况下，添加1 000和1 500 FTU/kg中性植酸酶使总磷消化率提高了5.8%~18.9%，同时也显著提高了干物质的消化率[23]，与本试验结果基本一致；在黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)饲料添加中性植酸酶对磷表观消化率也有显著性影响[18]，类似报道也见于建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)[24]、暹罗鲶(Pangasius pangasius)[25]等。此外，Baruah等[26]在南亚黑鲮(Labeo rohita)、Vandenberg等[27]在虹鳟、Zhu等[28, 29]在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)的研究中也发现饲料中添加酸性植酸酶显著提高了干物质消化率。本试验中，在1.0%磷酸二氢钙饲料中添加400和800 IU/kg中性植酸酶均显著提高了磷的沉积率，说明添加植酸酶提高了磷的利用率，进而促进鱼体生长。秦巍仑等[24]在建鲤上的研究也表明饲料中添加酸性植酸酶能够提高磷的沉积率，与本试验结果一致。本试验在含1.0%、0.5%磷酸二氢钙的饲料中添加400 IU/kg中性植酸酶，使增重率分别提高了9.2%和9.4%，未达显著水平，表明植酸酶添加量可能不够，这可能与鱼类消化道短、食物在消化道停留的时间短、低剂量的植酸酶难以在短时间水解产生足量的无机磷有关。该结果与尼罗罗非鱼饲料中添加500 IU/kg酸性植酸酶对生长无显著影响，而添加1 000 IU/kg酸性植酸酶显著改善了生长的报道相一致[20]。此外，饲料中添加500 IU/kg酸性植酸酶对七星鲈鱼(Lateolabrax japonicas)[30]、斑点叉尾 [31]生长的影响也不显著。
饲料中的营养素尤其是蛋白质、脂肪等通常会对鱼类的形体指标产生影响[32, 33]。牛纪锋等[34]报道，在大口黑鲈(Micropterus salmoides)饲料中添加酸性植酸酶能降低其肝体比，其原因可能是植酸酶降解植酸产生环已六醇，促进肝脏及其他组织中脂肪的新陈代谢，阻止了肝脏中脂肪的沉积，从而降低了肝体比。本试验中，在不添加中性植酸酶的情况下，随着磷酸二氢钙添加量的增加，异育银鲫的脏体比和肝体比显著降低；在含1.0%磷酸二氢钙饲料中添加800 IU/kg中性植酸酶，脏体比和肝体比显著降低。马恒甲等[17]在草鱼饲料中添加1 000 IU/kg酸性植酸酶后显著降低了脏体比、肝体比，与本试验结果一致。杨健等[35]报道，随饲料中磷酸二氢钙添加量的降低(从3.0%降到0.5%)，添加中性植酸酶对鲤鱼(Cyprinus carpio)的肥满度并无显著影响，本试验中也有类似结果。
当饲料中磷缺乏时，脂肪的氧化过程受到抑制，导致更多脂肪存积于体内[36]，当通过补充磷酸盐或添加植酸酶满足鱼体对磷的需求后，鱼体脂肪沉积量下降。本研究中，1.5%磷酸二氢钙组的全鱼粗脂肪含量显著低于0.5%磷酸二氢钙组，说明缺乏磷使得鱼体粗脂肪含量偏高；在大黄鱼(Pseudosciaena crocea)[37]饲料中添加酸性植酸酶和在草鱼[38]饲料中添加中性植酸酶以及本试验在含1.0%磷酸二氢钙异育银鲫饲料中添加中性植酸酶后均观察到全鱼粗脂肪含量下降的现象。本试验还发现，饲料中添加植酸酶使得灰分沉积率显著增高，此结果与张璐等[37]研究结果一致，这可能与植酸酶能够打开植酸和矿物质之间的螯合键，提高了鱼体对矿物质(钙、磷等)的吸收和利用有关。研究发现，在饲料中添加1 000 IU/kg酸性植酸酶显著提高了尼罗罗非鱼椎骨磷含量[18]；植酸酶能促进骨骼矿化，改善鱼体成分也在暹罗鲶[25]、南亚野鲮(Labeo rohita)[39]中得到证实。本试验在1.0%磷酸二氢钙饲料中添加800 IU/kg中性植酸酶后显著提高了全鱼磷含量和椎骨钙含量，椎骨磷含量也有增加的趋势，这表明植酸酶在降解植酸释放无机磷的同时，也可以将原本螯合的蛋白质、矿物元素释放出来，促进了鱼体对营养物质的消化吸收，从而改善了鱼体体成分，促进了椎骨中矿物元素的沉积[40]。
ALP又称正磷酸单酯磷酸水解酶，是反映骨骼代谢的重要指标。血浆ALP在水生动物的矿化作用和膜运输中起着非常重要的作用[41]。本试验中，随磷酸二氢钙添加量由0.5%增加到1.5%，异育银鲫血浆ALP活性显著降低，在1.0%磷酸二氢钙饲料中，随着植酸酶添加量的增加，血浆ALP活性也显著降低。刘宏等[11]在肉鸭中的研究也有类似结果，并认为较高的血浆ALP活性与骨骼更新活跃有关，当饲粮中缺乏可利用磷时，成骨细胞活动增强，ALP的活性较高，随着植酸酶的添加量的增加，饲粮可利用磷增加，骨磷周转变慢，从而使血浆ALP的活性降低。本试验中，在含1.0%磷酸二氢钙饲料中添加400、800 IU/kg中性植酸酶均使血浆TG含量显著增加，表明鱼类的脂类代谢增强，鱼体脂肪沉积量下降。血浆TP、ALB含量在机体免疫应答中起着重要作用，血浆TP含量是鱼体营养和健康状况的重要指标[42]。在本试验中，各组血浆TP、ALB含量均无显著差异，表明异育银鲫摄食低磷酸二氢钙的饲料8周尚不足以影响其代谢机能，同时，血浆钙、磷含量也无显著变化，这与在黄颡鱼[28, 29]的试验中添加酸性植酸酶不影响血浆磷含量的报道一致。
4 结 论综上所述，在磷酸二氢钙含量为1.0%的饲料中添加800 IU/kg中性植酸酶可显著提高异育银鲫的增重率、蛋白质与磷的沉积率、干物质与磷的表观消化率，达到和磷酸二氢钙含量为1.5%的饲料基本一致的水平。
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