家禽肠道是一个复杂而多样的生态环境，其体内微生物超过400种，这些微生物对宿主的正常发育和营养物质的消化吸收起着重要的作用。长期以来，由于微生物形态过于简单，缺乏明显的外部特征，人们对环境中细菌菌群结构的了解不多。随着基于16S rDNA分子技术的发展，更全面更深入地了解微生物菌落结构成为可能，其中变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)技术被用于检测人类^[1]、猪^[2]、鸡^[3]等动物胃肠道主要细菌的结构和多样性^[4]。肠道菌群失调会减弱机体对营养物质的吸收率，降低机体免疫力，削弱肠道的屏障功能^[5]，影响畜禽的生长和健康，所以对肠道微生物是否会导致动物肠道功能紊乱等相关研究十分迫切。目前，对宿主与肠道微生物之间相互作用的了解非常有限，直接限制了对动物肠道微生物与肠道功能的研究。因此，本研究通过特定细菌物种通用引物聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法，对笼养和散养的雏鸡及产蛋鸡所有肠道内容物菌群16S rDNA V3区进行PCR-DGGE指纹图谱比较分析，研究不同饲养方式下不同生长阶段蛋鸡十二指肠、空肠、回肠和盲肠中细菌种群结构和多样性的发育性变化，旨在为了解家禽肠道菌群结构和分离特异性有益菌提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验动物与样品采集

试验动物分别选自大庆兴和牧业蛋鸡养殖场的笼养蛋鸡和大庆林甸散养蛋鸡，品种均为海蓝灰蛋鸡系。随机选取体重相近的8和30周龄的笼养与散养蛋鸡各25只，剖杀，取全部小肠，同时分别取相同周龄饲养方式相同的每5只鸡的十二指肠、空肠、回肠和盲肠的肠道内容物并分别混匀，按每管1 g分装至5 mL离心管中，-20 ℃保存。

1.2 DNA提取

采用十二烷基硫酸钠(SDS)高盐抽提法提取样品基因组DNA^[6]。用细菌基因组DNA提取试剂盒(上海海博生物有限公司)进行过柱纯化和溶解，最终总DNA溶于30 μL无菌水中，-20 ℃保存。

1.3 细菌16S rDNA片段的PCR扩增

以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引 物GC-338F和518R扩增样品16S rDNA高变区序列(表 1)^[7]。

PCR扩增体系(50 μL)为：10× PCR buffer 5 μL；dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL；rTaq(5 U/μL)0.4 μL；GC-338F(20 mmol/L)1 μL；518R(20 mmol/L)1 μL；模板DNA 50 ng；补ddH₂O至50 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最终72 ℃延伸10 min。PCR产物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收。

PCR仪为Biometra公司生产的T-Gradient，凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统。

1.4 PCR产物的DGGE分析

取10 μL PCR产物进行DGGE分析。采用变形梯度为35%～55%、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶，化学变性剂为100%尿素7 mol/L和40%(体积分数)的丙烯酰胺，在1×TAE缓冲液中150 V、60 ℃下电泳5 h。

1.5 DGGE图谱中优势条带的回收与测序

用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带。以2 μL回收产物为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，连接到PMD18-T载体上，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，菌液由北京华大基因研究中心对插入的细菌16S rDNA片段进行序列测定。

1.6 数据分析

用Quantity One软件对鸡各段肠道分离的细菌的PCR-DGGE指纹图谱进行条带计数和模拟，在GenBank中使用Blast程序进行同源性比较，获得最相似典型菌株的16S rDNA序列。

2 结果与分析 2.1 PCR产物的DGGE分析结果

分别从8和30周龄笼养和散养蛋鸡的十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物中提取总DNA，经电泳分析，各肠道内容物总DNA分子质量相近，均在2 000 bp以上，说明总DNA提取一致。以鸡各肠道内容物提取的细菌总DNA为模版，以GC-338F和518R为引物扩增16S rDNA序列，得到约200 bp的DNA片段用于DGGE分析。

样品16S rDNA PCR产物的DGGE分析结果如图 1。小肠内容物的特定菌群分析表明，细菌通用引物扩增的16个样本中均得到16S rDNA V3区片段，利用上述已得到片段16S rDNA V3区进行PCR-DGGE指纹图谱和聚类分析。不同饲养模式不同年龄鸡小肠肠道细菌种类丰富，且不相同。所有样品总共分离出35条条带，十二指肠、空肠、回肠和盲肠中细菌总条带数，8周龄笼养雏鸡分别为8、12、8和9条，散养雏鸡分别有8、13、14和9条；笼养成年蛋鸡分别有13、12、9和9条，散养成年蛋鸡分别有16、15、13和10条。各鸡各肠道中虽然有些共性条带，但30周龄成年蛋鸡肠道菌种数量多于8周龄雏鸡，散养鸡肠道细菌总数多于笼养鸡，且均以十二指肠中细菌总数差别最大。

2.2 各样品之间的细菌群落结构相似性

从各鸡小肠中共分离出39株菌，根据各肠道中总细菌种属数量中的相同细菌种属的比例，进行菌种遗传相似系数计算，非加权分组平均法(UPGMA)聚类图如图 2所示。

不同饲养模式雏鸡和成年蛋鸡不同肠道中细菌群落的组成有很大差异。相同周龄相同肠道组织中菌种遗传相似系数很低，30周龄散养和笼养蛋鸡小肠中细菌菌种相似系数为18.9%~33.5%；8周龄散养和笼养蛋鸡小肠中细菌菌种相似系数为17.0%~33.3%。相同饲养模式下，不同周龄蛋鸡相同肠道组织中菌种相似系数较高。散养条件下，8和30周龄蛋鸡各肠道细菌菌种相似系数为19.4%~35.2%；笼养条件下，8和30周龄蛋鸡各肠道细菌菌种相似系数为33.1%~49.1%，明显高于散养条件下不同周龄蛋鸡肠道菌群分布的相似性，说明笼养环境相对稳定，散养环境复杂，散养环境下鸡只采食的细菌类别可变性较大。菌群相似性指数是测量群落间或样方间相似程度指数指标，相似性指数的高低说明细菌群落相似程度，也可间接地说明共性菌群以外的菌群情况。由上述结果中可知，不同饲养环境不同周龄鸡肠道菌群组成差别较大，饲养模式、周龄及肠道部位均影响鸡肠道中细菌的多样性。

2.3 主要电泳条带的序列测定

DGGE凝胶条带回收后，以338F/518R为引物进行PCR扩增，获得约200 bp的DNA片段。PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆测序。指纹图谱中分别割胶回收测序结果见表 2，测序结果与GenBank中的序列进行比对，得到条带所代表的细菌类型，绘制系统发育树，如图 3所示。在39个测序结果中，与GenBank数据库中微生物的同源性绝大多数大于92%，有的同源性甚至达到100%。

经鉴定，蛋鸡小肠中细菌种类分为4个菌门，为变形菌(Proteobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、放线菌(Actinobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)以及环境样品(environmental samples)。其中2株变形菌(占总菌比例5.1%)为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)(条带8)和哥假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas mexicana)(条带21)，均仅在散养鸡肠道中检测到，分别为8周龄雏鸡的空肠和30周龄成年蛋鸡的回肠中。4株拟杆菌(占总菌比例10.2%)，为蓝斑拟杆菌(Bacteroides plebeius)(条带2)、丁酸弧菌(Butyricimonas virosa)(条带13_2)、克拉副普氏菌(Paraprevotella clara)(条带14)和Alistipes putredinis(条带33)，其中条带2为 相似度89%的蓝斑拟杆菌亚种，与条带3同源的 丁酸弧菌存在各鸡的小肠中；条带14为相似度72%的克拉副普氏菌变种，在散养鸡肠道中和8周龄的笼养鸡空肠中检测到；而条带33同源菌Alistipes putredinis仅在成年蛋鸡小肠中发现。

5株放线菌(占总菌比例12.8%)包括2株阴道加德菌(Gardnerella vaginalis)(条带28和29)，3株螺旋链霉菌(Streptomyces spiralis)(条带30、31和32)，其中条带28和29是相似度92%的变种，同源于阴道加德菌；条带30、31和32为相似度100%的同源螺旋链霉菌；条带28同源的阴道加德菌和条带30、31和32同源的螺旋链霉菌存在各鸡小肠中；而阴道加德菌(条带29)仅在30周龄散养成年蛋鸡肠道中发现。

本试验分析的39株细菌中，有21株为厚壁菌(占总菌比例53.8%)，是蛋鸡小肠中的优势菌群。其中乳酸菌属(Lactobacillus)共有10株(占总菌比例25.6%)，是厚壁菌中的优势菌属(占47.6%)，包括3株鸟乳酸菌(Lactobacillus aviaries)、3株棉子糖乳酸菌(Lactococcus raffinolactis)、1株敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)、1株陪伴粪球菌(Coprococcus comes)、1株同代乳杆菌(Lactobacillus equigenerosi)和1株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。30周龄散养和笼养成年蛋鸡小肠中各检测到7株乳酸菌，而8周龄的雏鸡小肠中分别检测到5株(散养)和6株(笼养)。各鸡小肠均有的共同乳酸菌为3种，分别是鸟乳酸菌(条带4、5和23)、棉子糖乳酸菌(条带6和25)和同代乳杆菌(条带15_1)；其中条带4和条带23相似性仅为31%，与鸟乳酸菌相似性仅为27%，而他们与条带5的相似性达98%，说明条带4和23为鸟乳酸菌的新种；条带15与同代乳杆菌的相似性仅为36%，在各鸡小肠中均检测到，为鸡肠道中共同菌种；棉子糖乳酸菌(条带6_1和6_2)在各鸡小肠中存在，但在十二指肠中未检测到，是鸡后段小肠中存在的共同菌种。敏捷乳杆菌(条带11)、陪伴粪球菌(条带12)和嗜酸乳杆菌(条带34)为不同日龄鸡特有的乳酸菌种。其中条带11与敏捷乳杆菌相似度为87%，是敏捷乳杆菌的亚种，仅分离自8周龄笼养和散养的小鸡肠道中，30周龄成年鸡肠道中未发现；条带12与陪伴粪球菌的相似度为70%，是陪伴粪球菌的变种，仅分离自30周龄笼养和散养的成年蛋鸡小肠中，8周龄雏鸡肠道中未发现；条带34与嗜酸乳杆菌相似性为84%，是嗜酸乳杆菌的亚种，仅在散养30周龄鸡的十二指肠中检测到，在其他鸡肠道中均未检测到，是散养成年鸡小肠中特有菌种。

厚壁菌中有6株梭菌属(Clostridium)(占总菌的15.4%)，分别为普氏梭杆菌(Fusobacterium plautii)(条带1)、第三梭状芽孢杆菌(Clostridium tertium)(条带7)、缓腐梭菌(Clostridium lentocellum)(条带17)、艰难梭菌(Clostridium difficile)(条带24)、煎盘梭菌(Clostridium sartagoforme)(条带26)和不规则梭菌(Clostridium irregulare)(条带27)。其中普氏梭杆菌、第三梭状芽孢杆菌和煎盘梭菌在各鸡小肠中检测到，是鸡的共同梭菌；而条带1与普氏梭杆菌相似性为92%，是普氏梭杆菌的亚种，条带17与缓腐梭菌相似性为90%，是缓腐梭菌的亚种，条带26与煎盘梭菌相似性为90%，为煎盘梭菌的亚种。条带7与第三梭状芽孢杆菌相似度仅为32%，仅在成年蛋鸡肠道中检测到，雏鸡小肠中不存在或未检出；条带27与不规则梭菌相似性为89%，是不规则梭菌变种，仅在散养雏鸡小肠中发现，而在其他鸡小肠中未检出；条带24与艰难梭菌相似性为85%，是艰难梭菌变种，是雏鸡小肠共同菌株，而在成年散养蛋鸡小肠中未发现。厚壁菌中还有4株菌，分别为鲁梅利杆菌(Rummeliibacillus stabekisii)、普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)以及加洛链球菌(Streptococcus gallolyticus)。这4株菌在散养成年蛋鸡小肠中均检测到，且与普氏粪杆菌同源的条带9是散养成年蛋鸡小肠中特有菌属，而与鲁梅利杆菌同源的条带3和与加洛链球菌同源的条带10在散养雏鸡小肠中也检测到。

另在鸡肠道中检测到7株环境样品(占总菌比例17.9%)是不可培养菌(uncultured bacterium)(条带13_1、16、18、19、20、22和35)，且这7株菌相似性均高于97%，在各鸡小肠中均有发现，普遍存在鸡肠道中。

以上结果说明，饲养模式和肠道部位影响鸡肠道细菌的结构。

3 讨 论

肠道微生物可通过养分的利用和胃肠道系统的发育来影响宿主的营养、健康和生长性能。肠道微生物菌群的组成，会对宿主的健康和生长产生影响。对人类^[8]、猪^[9]、鸡等的研究结果均证实不同个体肠道菌群指纹图谱有差异，即使是饲养于相同环境、饲喂相同饲料、相互接触的同龄鸡，都会表现出不同的带谱，说明宿主因素对肠道菌群的组成影响很大。由于动物种类^[10]、饲养环境、温度^[11]等均影响肠道菌群结构，且基于传统培养方法很难全面地反映或比较肠道菌群的结构特征，本研究采用先进且有效的DGGE技术对笼养和散养模式下8和30周龄海蓝褐蛋鸡十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物中细菌组成进行研究，分析不同饲养方式下蛋鸡肠道中微生物类群发育性变化。从所有鸡整个小肠中发现35个菌属的细菌，散养鸡较笼养鸡小肠中细菌种属相对较多，散养雏鸡整个小肠中细菌总数较笼养雏鸡的多7株，而散养成年蛋鸡比笼养成年蛋鸡小肠细菌总数多11株；相同饲养模式，成年鸡肠道菌群较雏鸡阶段丰富，主要表现在十二指肠中细菌数量相差较多，空肠之后的肠道中细菌总数相差不多。如散养条件下，雏鸡十二指肠细菌有8株，成年蛋鸡有16株；笼养条件下，雏鸡十二指肠有8株细菌，成年蛋鸡有13株，证实禽的生活环境对肠道中菌的生存有很大影响。

为了开发动物用益生菌制剂菌，在各个肠道均存活的乳酸菌株将作为后备菌进行研究。本研究从鸡各肠道分离出乳酸菌株共10株。目前，关于同代乳杆菌的研究报道仅有3篇^[12-14]，且均是从马的肠道中分离出来或是做成微生态制剂饲喂马。对该菌进行生物学特性研究发现，同代乳杆菌具有高耐酸耐胆盐能力，可以在pH为3.0的环境存活，对肠上皮细胞黏附力高达60%以上，没有致病性，且能够降低马血液胆固醇含量和尿素含量，可作为益生菌进行开发。本研究首次从笼养蛋雏鸡肠道中分离出同代乳杆菌，根据以上研究结果显示，同代乳杆菌可以作为蛋鸡用微生态制剂的后备菌在未来试验中进一步研究。鸟乳酸菌仅在Waters等^[15]的一篇综述中提到过，作为微生态制剂菌，没有发现其他的相关研究报道。关于敏捷乳杆菌的研究有3个，最早的研究是Palop等^[16]研究发现一株敏捷乳杆菌R16能够在含有芥末籽提取物的环境中生长，并可以降解硫甙，说明该菌具有一定的生命抗性和生物活性；Baele等^[17]证实敏捷乳杆菌为鸽子肠道中乳酸菌属的重要组成部分；最近的研究，即Stephenson等^[18]研究发现，敏捷乳杆菌为肉鸡肠道常驻乳酸菌属菌株，具有高黏附和定植力，并具有高效表达抗菌蛋白的功能。本研究发现了敏捷乳杆菌，通过以上研究的对比，说明该菌在禽类肠道具有很好的定植的能力和适应性，因此敏捷乳杆菌可作为微生态制剂菌进行进一步研究。

关于棉子糖乳球菌的研究都是近2年的，且均为发酵牛奶中关于该菌的研究^[19-20]，至今没有从禽肠道中分离鉴定该菌的研究，但Meslier等^[19]的研究中提到棉子糖乳球菌为环境中的常见乳酸菌，而本研究在鸡肠道中分离出该菌，根据前人研究它的促发酵作用，该菌具有微生态制剂后备菌的特性，具体应用效果有待于进一步研究。关于陪伴粪球菌的研究，多数为20世纪90年代前的^[21]，最近的仅有1篇，为Graessler等^[22]的研究，均是说明陪伴粪球菌在肠道中数量的增多与克罗恩氏病(节段性肠炎)有关，因此该菌不可作为微生态制剂菌。

此外，鸡各肠道还有3株非乳酸菌属共同菌，为1株鲁梅利杆菌和2株阴道加德菌。而其中阴道加德菌，有多个研究表明该菌为致病菌^[23-24]，会产生生殖道炎症，因此不可作为益生菌制剂后备菌研究。目前，直接研究鲁梅利杆菌菌属的报道仅有2篇^[25-26]，均是从土壤中分离并鉴定的，但是Vaishampayan等^[25]分离出的鲁梅利杆菌，经测定严格需氧，耐高盐，28~32 ℃生长良好；而Her等^[26]分离出的鲁梅利杆菌菌株不耐盐(NaCl<1.5%)，也不耐酸(pH 5~10)，不具有微生态制剂制备菌的优良特性。因此，本研究分离出的芽孢杆菌属鲁梅利杆菌是否可作为微生态制剂制备菌，有待于进一步的研究确定。

4 结 论

① 饲养模式和饲养阶段对鸡肠道中细菌种类分布有很大影响，散养模式细菌种类更丰富，成年鸡较雏鸡肠道细菌多；肠道不同肠段决定细菌种类的多样性和特异性，尤其是小肠入口的十二指肠是各鸡细菌种类差异最明显的肠段。

② 本研究分离鉴定出9株乳酸菌和1株芽孢杆菌，其中除同代乳杆菌已在马属动物上作为微生态制剂制备菌应用过外，鸟乳酸菌、敏捷乳杆菌、棉子糖乳球菌及鲁梅利杆菌是否可作为微生态制剂制备菌，均有待于进一步的研究确定，可作为后备菌保存。