2. 扬州大学实验农牧场, 扬州 225009
, LIANG Xianghuan2, WANG Mengzhi1
, ZHANG Jun1,2, WANG Hongrong1, ZHOU Gang1, ZHANG Xin1, XU Qiaoyun1
2. Experimental Farm of Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
随着高密度集约化养殖的发展，动物常处于免疫应激状态中，导致动物体需要消耗更多的营养成分以维持免疫反应的需要[1]，从而导致动物对饲料利用效率降低，生长发育受到限制，引起生产性能的下降。而如何通过营养调控的方法来促进机体免疫力，进而提高生产性能已成为当前主要的研究课题[2]。近年来的研究发现，机体内某些氨基酸除了为构成机体最基本物质(蛋白质)合成提供底物外，还能够通过自身及其代谢产物对机体内的许多代谢反应产生调节作用，精氨酸(arginine，Arg)作为机体的一种条件性必需氨基酸和功能性氨基酸[3-4]，已受到越来越多的关注。刘凤菊等[5]研究发现，当以平均日增重为评价指标时，1~3周龄雌性肉仔鸡的精氨酸需要量为1.38%。Zhou等[6]在黄石斑鱼的研究中发现，黄石斑鱼幼鱼对饲料中精氨酸需要量为2.8%。曾雯娉[7]研究报道，凡纳滨对虾幼虾对饲粮中精氨酸需要量为2.16%，而对于泌乳奶牛中精氨酸需要量尚未见明确的文献报道。而在应激、创伤或饥饿状态下，机体对精氨酸的需求大大增加，仅靠自身合成不能满足生理代谢的需求，必须及时补充。而且，精氨酸能够显著增加胸腺的重量并提高胸腺淋巴细胞数，可以缓解由于机体损伤所引起的胸腺萎缩[8]。Jahanian[9]研究发现，通过向肉鸡饲粮中添加高于NRC推荐量的精氨酸能够增强机体的免疫功能；还可通过提高家禽体内免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)以及CD4+细胞的浓度来提高对败血症的抵抗力[10]。此外，精氨酸还能有效地减轻或者消除机体在热应激情况下产生的免疫应答[11-13]，进而提高生产性能。在奶牛上的研究已经表明，提供2倍需要量的精氨酸能够提高乳腺上皮细胞分泌牛奶酪蛋白的含量[14]，但是，关于精氨酸对奶牛免疫性能的作用尚无直接研究报道。本课题组前期体外奶牛乳腺上皮细胞的研究表明，提供2倍需要量的精氨酸可获得最高的酪蛋白表达量。为此，本试验在灌注精氨酸研究其调控奶牛泌乳性能的基础上，通过测定奶牛血清免疫抗体、细胞因子等指标，来初步研究阐明精氨酸对泌乳中期奶牛机体免疫力的影响，以期为精氨酸在奶牛上的生产应用研究提供一些基础资料。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计将试验牛随机分为3组，试验采用3×3复式拉丁方设计，每期22 d(包括灌注期7 d，间隔期15 d)。3组试验用灌注液分别为：酪蛋白组(对照组)、以对照组为基础的精氨酸组(本试验选择体外细胞培养试验促进酪蛋白表达最优的2倍精氨酸浓度进行灌注，灌注量为37.66 g/d)[14]、丙氨酸组(与2倍精氨酸组等氮，灌注量为77.24 g/d)。灌注液由南京剑桥生物科技有限公司配制，每组每天经由颈静脉滞留针匀速灌注8 h，灌注总量皆为4 L。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
每个试验期结束时，每头试验牛颈静脉采血，1份加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)抗凝管中，用于血常规分析；1份加入促凝管中，447.2×g离心20 min并取血清，用于免疫球蛋白等生化指标测定。
1.3 血清IgA、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)浓度测定采用北京华英生物技术研究所的牛IgA、IgG、IgE检测试剂盒(BS-0360)，测定血清中IgA、IgG及IgE浓度，具体测定步骤参照试剂盒说明书进行。
1.4 血清免疫细胞因子白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度测定IL-1、IL-6及TNF-α浓度采用放射免疫法测定，所使用的酶联免疫分析(ELISA)试剂盒均购自上海R&B公司(CK-E94174B、CK-E92031B、CK-E92026B)，具体测定步骤参照试剂盒说明书进行。
1.5 血常规及血清生化指标测定总蛋白浓度、白球比、谷丙转氨酶及谷草转氨酶活性在扬州市疾病控制中心测定。
1.6 统计分析试验数据用Excel 2003整理统计后，利用SAS 9.0软件中的方差分析(ANOVA)进行显著性检验和多重比较。P＜0.05为显著差异水平。
2 结果与分析 2.1 血清免疫球蛋白浓度和牛奶体细胞数由表 2可知，各组间血清中IgA与IgE浓度无显著差异(P>0.05)，而IgG浓度以精氨酸组最高，丙氨酸组次之，酪蛋白组最低，组间差异显著(P<0.05)。此外颈静脉灌注精氨酸能够显著降低牛奶中体细胞数，精氨酸组奶牛牛奶中的体细胞数显著低于酪蛋白组及丙氨酸组(P<0.05)，酪蛋白组与丙氨酸组间无显著差异(P>0.05)。
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表 2 精氨酸灌注对泌乳奶牛血清免疫球蛋白浓度和牛奶体细胞数的影响 Table 2 Effects of arginine infusion on serum immunoglobulin concentrations and milk SCC of lactating cows |
由表 3可知，颈静脉灌注精氨酸能够显著提高泌乳奶牛血浆中总蛋白的浓度及白球比(P<0.05)，而谷丙转氨酶及谷草转氨酶活性没有显著的变化(P>0.05)。
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表 3 精氨酸灌注对泌乳奶牛血清生化指标的影响 Table 3 Effects of arginine infusion on serum biochemical indices of lactating cows |
由表 4可知，泌乳牛血清中IL-6浓度不受灌注精氨酸的影响，各组间IL-6浓度没有显著差异(P>0.05)；而精氨酸组血清中IL-1浓度最高，要显著高于酪蛋白组(P<0.05)，但是与丙氨酸组之间差异不显著(P>0.05)。TNF-α浓度以精氨酸组最高，显著高于其他2组(P<0.05)，这2组之间无显著差异(P>0.05)。
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表 4 精氨酸灌注对泌乳奶牛血清免疫细胞因子浓度的影响 Table 4 Effects of arginine infusion on serum immuno-cytokine concentrations of lactating cows |
精氨酸在体内除了作为多种化合物底物参与机体组织代谢与蛋白质代谢外，还可作为一种游离型的氨基酸间接参与细胞增殖，神经传递及免疫应答等活动。研究表明，精氨酸在精氨酸酶的作用下分解产生鸟氨酸，其进一步分解生成的多胺对细胞增殖、创面愈合有重要作用[15]；在一氧化氮合成酶的作用下生成的一氧化氮能够灭杀病毒、细菌和肿瘤细胞等[16-17]。因此，精氨酸与机体免疫功能等密切相关[18-20]。免疫球蛋白能够与抗原结合，激活机体自身的免疫反应，还能够刺激抗体生成，产生多种生物学效应[21]。其中，IgG在血清中的浓度最高，具有调理吞噬、结合细菌等颗粒抗原等免疫作用[22]，而且是唯一能通过胎盘的免疫球蛋白，在自然被动免疫中起重要作用[23]。IgA和IgE能够耐受蛋白酶的消化作用，是机体消化道和呼吸道免疫的主要抗体[24]。
精氨酸能够通过提高胃癌患者血清中IgA、IgM以及CD4+的浓度提高病患对胃癌的抵抗力[10, 25]；还能够显著提高大鼠肠道中淋巴结数量和IgA的浓度，并显著提高试验大鼠的存活率[26]。饲粮中添加0.3%和0.6%的精氨酸能够显著提高艾美耳球虫攻毒后肉仔鸡血清中IgM和IgG浓度，改善肉鸡的体液免疫水平[27]。Tan等[28]在肉鸡中通过强饲球虫疫苗诱发空肠炎症反应，在补给精氨酸后发现肠黏膜中IgA和IgG的浓度有显著的提高。在泌乳母猪的研究中也发现，精氨酸组母猪血清中IgG、IgM的浓度要显著高于对照组[29]。本试验在奶牛的研究上发现，精氨酸可显著提高泌乳奶牛血清中IgG浓度，而对IgA、IgE浓度却没有显著影响。与上述其他畜禽添加效果并不完全一致，可能是由于物种不同所致，但也提示精氨酸可通过提高血清IgG进而提高奶牛机体本身的免疫力和胎儿的被动免疫力。
牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞数，多数是白细胞，通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成，约占牛体细胞数的95%，其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞[30]。牛奶中体细胞数是评价奶牛乳房健康状况和牛奶质量的重要指标，当奶牛泌乳系统受到细菌侵袭而发生感染和损伤时，承担机体损伤修复以及排除感染功能的白细胞就会在乳腺中大量集聚，进而促使牛奶中体细胞数大幅上升[31]。前人研究发现，饲粮中补充精氨酸能够显著提高母猪的泌乳性能[32]，而本试验研究发现灌注精氨酸能够显著降低泌乳奶牛牛奶中体细胞数。
3.2 精氨酸灌注对泌乳奶牛血清生化指标的影响血清总蛋白主要在肝脏中合成，由血清白蛋白和血清球蛋白组成，血清总蛋白在体内除了作为机体的主要营养源，还参与维持体内的渗透压，作为机体蛋白质的重要来源用于组织修补，其浓度的高低直接反映出动物生长发育情况和生理健康状态。本试验在奶牛上的结果发现，精氨酸显著提高了血清中总蛋白浓度，作为机体免疫球蛋白的合成原料，血清蛋白质浓度的升高，不仅反映了泌乳奶牛对饲粮蛋白质利用率的改善，而且还改善了机体的体液免疫水平。李新国[33]在7日龄断奶仔猪饲粮中添加0.6%和0.8%精氨酸的研究发现，精氨酸能显著提高仔猪血清中总蛋白浓度，廖英杰等[34]在团头鲂幼鱼饲粮补充精氨酸发现，血清总蛋白浓度随着饲粮精氨酸水平升高而显著升高，Zhou等[35]在南美白对虾的研究中也发现类似规律。白球比作为临床医学上肝功能检测的一个重要指标，其数值的高低能够一定程度地反映机体的免疫状况，本试验中向机体补充精氨酸显著提高了总蛋白中白球比，进而可提高泌乳奶牛的机体健康状态。刘玉兰等[36]通过向仔猪饲粮中添加精氨酸的研究发现，精氨酸能够在一定程度上缓解脂多糖刺激所导致的总蛋白、白蛋白浓度的降低，提高白球比。杨慧等[29]也发现精氨酸能够显著提高母猪血清中白球比，并通过促进机体蛋白质的合成来维持机体血液中抗体的合成和分泌，从而提高机体的免疫力[37]。
谷丙转氨酶与谷草转氨酶是广泛存在于动物细胞线粒体中的2种氨基转移酶，在机体蛋白合成与氨基酸代谢起着重要作用，它们的活性与氨基酸代谢强弱有一定关联[38]。本试验中灌注精氨酸并没有对ALT及AST的活性产生影响。这一结果与潘杰等[39]在断奶仔猪上的研究发现的结果一致。
3.3 精氨酸灌注对泌乳奶牛血清中细胞因子浓度的影响细胞因子IL-1和IL-6作为一种淋巴细胞刺激因子，可以促进B细胞增殖和抗体分泌[40-41]。TNF-α对肿瘤细胞具有直接的抑制增殖和坏死作用，但对正常细胞的生长分化及其代谢功能的发挥无影响。此外，TNF-α还可通过活化巨噬细胞，诱导免疫调节介质的产生来介导免疫应答[42-43]。本试验结果表明，精氨酸能够提高泌乳奶牛血清中免疫细胞因子IL-1和TNF-α的浓度，这一结果与郭祎玮[44]在肉仔鸡中所发现的结果一致，该试验通过向饲粮中添加不同水平的精氨酸发现，肉仔鸡血清中IL-1和TNF-α浓度随饲粮中精氨酸添加量的上升呈二次上升趋势，李新国[33]在断奶仔猪中的研究也发现，饲粮中添加0.8%精氨酸能够显著提高仔猪脾脏中TNF-α的基因表达量。这些结果均表明，精氨酸能够在一定程度上提高IL-1和TNF-α的浓度，通过促进炎症反应而有利于吞噬细胞清除侵入机体的病原体，进而提高泌乳奶牛机体的自我防御能力。
另有研究报道，给肌注脂多糖(LPS)引发全身炎症反应的肉鸡补给精氨酸，可缓解IL-1和IL-6的过量表达，并减轻由于LPS引起的炎症反应[45]；给注射LPS引发炎症反应的断奶仔猪饲粮中补充精氨酸，可抑制LPS引起肠道中IL-6和TNF-α的过量表达，进而缓解了机体的炎症反应[46]；向热应激小鼠饲粮中添加精氨酸，有利于改善由于热应激引起的IL-1、干扰素γ(INF-γ)、TNF-α等mRNA的过量表达，从而缓解机体的热应激并降低小鼠死亡率[47]。以上研究表明，补给精氨酸还能缓解免疫应激或热应激状态下机体的炎症反应和应激状态，这在今后精氨酸在奶牛的应用研究中还需要进一步的开展试验予以阐明。
4 结论综上，颈静脉灌注精氨酸提高了奶牛血清中白球比及总蛋白、IgG及IL-1和TNF-α的浓度，且能够降低牛奶中体细胞数，有利于提高奶牛机体的免疫能力和胎儿被动的免疫力。
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