钒作为生物体的一种必需微量元素，参与蛋白质、核酸、糖及脂类物质的代谢，具有其特殊的营养生理功能，其在微量条件下，能维持机体正常的生长和发育，参与葡萄糖转运等[1, 2]。但作为重金属的一种，钒在过量条件下会对机体产生较严重的毒性效应，如造成动物体重减少，采食量降低，降低心率并造成心脏损伤、肺纤维、肝肾氧化损伤[3, 4, 5]，引起胚胎畸形等，甚至直接引起死亡。在鼠上的研究表明，钒引起大鼠中毒浓度为0.25 mg/L，致死浓度为6.00 mg/L[5]。有研究表 明，钒会随着蛋鸡饲粮被摄入，最终转运到鸡蛋中，且鸡蛋中钒残留剂量会随着饲粮钒的增加而增加，而蛋黄是鸡蛋中钒的主要沉积部位[6]。鸡蛋作为人类日常廉价的优质蛋白质源，含有丰富的营养物质，残留于鸡蛋中的钒是否会对人体健康造成潜在的安全隐患，目前还未见报道。本研究通过将含钒饲粮饲喂蛋鸡的鸡蛋所得蛋黄粉配制成大鼠基础饲粮，予以饲喂大鼠，从而评价含钒蛋黄粉(有机钒)是否能影响大鼠的生长和健康。
1 材料与方法 1.1 材料、试剂和仪器分别收集蛋鸡摄入含钒量为0、5和10 mg/kg的饲粮12周后所产鸡蛋，小心去除蛋壳和蛋白，冷冻干燥后制得蛋黄粉。取27只3周龄清洁级Wistar大鼠(购于成都达硕生物有限公司)，分笼饲养，温度(23±2) ℃，相对湿度(55±2)%，自由饮水、进食，适应环境7 d后，开始正式试验。谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(UN)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、甘油三酯(TG)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；醌氧化还原酶1(NQO1)试剂盒购自武汉基因美公司；核因子E2相关因子2(Nrf2)和NQO1引物、提取、反转录以及定量试剂购自天根生物有限公司；其他试剂均为分析纯。
超纯水制备仪(美国密理博公司)；电子天平；微波消解仪；电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，7500a，美国安捷伦公司)，为满足对金属元素的测定要求用外标物——10-12 g/L Li、Y、Ce、Tl和Co的2% HNO3调节液对仪器灵敏度(Li、Y和Tl)、氧化物水平(CeO/Ce)和双电荷(Ce+2/Ce)进行优化；酶标仪(美国Thermo公司)；实时荧光定量PCR(C1000，成都伯乐科技有限公司)。
1.2 基础饲粮基础饲粮以玉米淀粉、蛋黄粉为主配制而成，其中粗蛋白质、总能、粗脂肪水平参照Imura等[7]设计，粗纤维、维生素以及矿物质添加量参考Reeves等[8]。饲粮制成块状，方便大鼠啃食。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (as fed-basis) |
大鼠试验设3个处理，分别在大鼠基础饲粮中加入600 g/kg 3种来源的蛋黄粉，依次为处理1、2和3。经实测，3种蛋黄粉含钒量分别为0.006、0.053和0.080 mg/kg，所配试验饲粮分别含钒0.107、0.137和0.164 mg/kg。
动物饲养与管理试验选用21日龄断奶Wistar大鼠27只，单只饲养于20 cm×15 cm×20 cm铁制笼中，自由采食及饮水，预饲7 d后，按体重无差异原则分成3个处理，分别饲喂3种试验饲粮。在每天上午和下午各记录1次房间温度及相对湿度值，观察大鼠的活动状态及精神状态。试验期35 d。
1.5 样品采集与测定试验结束时，将所有大鼠称重后，通过摘眼球采血，收集2 mL血液到含0.2%肝素钠的抗凝管中，混匀，然后3 500 r/min离心10 min，收集上清液，分装于200 μL EP管中，保存于-20 ℃冰箱中待测。采血后，将大鼠脊髓脱臼处死，然后取约0.2 g肝脏放于灭菌的1.5 mL EP管中，保存于-80 ℃超低温冰箱中，用于基因测定。取肝脏、肾脏、肺脏、脾脏以及心脏进行称重，分别计算相应的器官指数，计算公式为：
器官指数(%)=100×相应的器官重量/大鼠活体重量。
取1/2肝脏、肾脏固定于4%的多聚甲醛溶液中，用于组织切片观察。将余下的肝脏、肾脏装袋，保存在-20 ℃冰箱中，用于抗氧化等生化指标以及钒残留量的测定。
1.5.1 血浆生化指标测定将冻存的血浆样放置室温待其完全解冻后，按南京建成生物工程研究所生产的试剂盒说明书进行指标测定。血浆ALT活性采用改良赖氏法测定，AST活性采用酶动力法测定，UN含量采用脲酶法测定，MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，TG含量采用脂酶比色法测定。
1.5.2 肝脏、肾脏抗氧化指标测定取肝脏和肾脏组织各1.0 g于冰生理盐水中，制成10%组织匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液用于以下指标的测定。
肝脏、肾脏SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，MDA含量采用TBA法测定，T-AOC采用还原 法测定；肝脏TG含量及ALT、AST活性测定方法同血浆；肝脏GSH含量采用微量酶标法测定，GST活性采用化学比色法测定，NQO1采用酶联免疫分析法(ELISA)测定。
1.5.3 肝脏、肾脏组织切片观察将放在4%多聚甲醛中的肝脏、肾脏组织，脱水，石蜡包埋，做切片，苏木精-伊红常规染色，显微镜下观察并记录病理组织变化。
1.5.4 肝脏、肾脏钒残留测定称取一定量保留的肝脏和肾脏样品，进行微波消解[9]，然后采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)标准曲线法定量测定组织中的钒含量[10]。
肝脏基因测定将冻存于-80 ℃冰箱中的肝脏样品取出，液氮条件下用去除RNA酶的研钵磨细，加入细胞裂解液，提取其中的RNA，将得到的RNA进行反转录，加入引物后进行荧光定量，测定Nrf2与NQO1 mRNA在肝脏中的相对表达量。Nrf2引物参考Habeos等[11]，NQO1引物采用Primer Premier 6.0设计[12](表 2)。RNA提取、反转录以及实时荧光定量PCR过程均参照天根生物试剂盒进行，基因的相对表达量用2-△△CT计算[13]。
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表 2 实时荧光定量PCR引物 Table 2 Primers for real-time quantitative PCR |
数据均采用SAS 9.0统计软件进行统计，分析结果以平均值和集合标准误表示。使用单因素方差分析的一般线性模型(GLM)过程进行分析，并以Duncan氏法进行多重比较，结果以P<0.05为显著性标准，P<0.10为有显著性差异的趋势。
2 结 果 2.1 生长性能从表 3可以看出，试验期末3个处理大鼠体重、体增重、总采食量、单位体重采食量及饲料转化率均无显著差异(P>0.05)。
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表 3 含钒蛋黄粉对大鼠生长的影响 Table 3 Effects of egg yolk powder including vanadium on growth of rats |
从表 4可以看出，试验期末3个处理大鼠肝脏、肾脏、肺脏、脾脏和心脏指数无显著差异(P>0.05)。
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表 4 含钒蛋黄粉对大鼠器官指数的影响 Table 4 Effects of egg yolk powder including vanadium on organ indices of rats |
从表 5可以看出，3个处理大鼠血浆AST、ALT活性及MDA、UN、TG含量无显著差异(P>0.05)。
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表 5 含钒蛋黄粉对大鼠血浆生化指标的影响 Table 5 Effects of egg yolk powder including vanadium on plasma biochemical indices of rats |
从表 6可以看出，与处理1相比，处理2、3肝脏、肾脏钒残留量(鲜重基础)无显著差异(P>0.05)，但处理2和3之间肝脏钒残留量存在显著差异(P<0.05)。
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表 6 含钒蛋黄粉对大鼠肝脏、肾脏钒残留量的影响(鲜重基础) Table 6 Effects of egg yolk powder including vanadium on liver and kidney vanadium residual of rats (based on fresh weight) |
从图 1可以看出，图 1-A表现出肝索完整、清晰，细胞核完整，细胞无空泡化；图 1-B表现出肝索较完整，细胞核无变化，极少量肝细胞有空泡样出现轻微脂肪变性；图 1-C可以观察到血窦较明显，窦腔内可见较多枯否氏细胞和一些血细胞。
图 1-D、图 1-E、图 1-F为肾脏皮质结构，可以看出，3个处理的肾小球无显著变化；而从图 1-G、图 1-H、图 1-I可以看出，3个处理的肾小管也无明显差异。总得来说3个处理的肾脏无显著性变化，无发生病变的现象发生。
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图1 含钒蛋黄粉对大鼠肝脏和肾脏组织病理变化的影响 Fig. 1 Effects of egg yolk powder including vanadium on liver and kidney tissue pathological changes of rats (400×) |
从表 7和表 8可以看出，3个处理大鼠肝脏、肾脏SOD活性、MDA含量和T-AOC以及肝脏ALT、AST、GST活性和GSH含量无显著差异(P>0.05)。但与处理1相比，处理2、3显著降低了大鼠肝脏NQO1活性(P<0.05)。 2.7 肝脏NQO1、Nrf2 mRNA表达 从表 9可以看出，与处理1相比，处理2、3显著下调了肝脏NQO1和Nrf2 mRNA的表达(P<0.05)。
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表 7 含钒蛋黄粉对大鼠肝脏、肾脏氧化应激状态的影响 Table 7 Effects of egg yolk powder including vanadium on liver and kidney oxidative stress status of rats |
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表 8 含钒蛋黄粉对大鼠肝脏生化指标的影响 Table 8 Effects of egg yolk powder including vanadium on liver biochemical indices of rats |
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表 9 含钒蛋黄粉对肝脏NQO1、Nrf2 mRNA相对表达量的影响 Table 9 Effects of egg yolk powder including vanadium on mRNA relative expression levels of NQO1 and Nrf2 in liver of rats |
钒作为机体必需的微量元素[14]，低剂量时可以促进动物的生长与发育[1]。Daniel等[15]研究指出，当饲粮钒含量低于23 mg/kg时，大鼠的生长状态不受影响。前人研究表明，引起哺乳动物中毒的钒酸盐剂量为17 mg/kg BW[16]，而偏钒酸铵对大鼠的中毒剂量为11.2 mg/kg BW，钒对人体产生毒性伤害的临界值为3 mg/d[17]。本试验3个处理饲粮钒含量依次为0.107、0.137和0.164 mg/kg，钒含量都较低，试验发现3个处理大鼠的精神状态无变化，采食量正常，试验期末大鼠体重及体增重均无显著差异。本试验3个处理中大鼠单位体重钒摄入量最高为0.38 mg/kg，日均钒摄入量最高为1.49×10-3 mg/d，远小于中毒剂量，说明含钒蛋黄粉对大鼠生长不会产生负面影响。假设蛋鸡采食含钒10 mg/kg的饲粮后所产鸡蛋供人食用，每人每日吃1枚鸡蛋(60 g)，则可能摄入约0.001 mg钒，远低于产生毒性伤害的临界值。
3.2 含钒蛋黄粉对大鼠健康的影响器官指数能直观地表现动物机体器官的变化程度，反映动物的健康状况。Faulkner等[18]指出钒(偏钒酸铵)引起大鼠中毒的最低剂量为11.2~16.8 mg/kg。Domingo等[19]研究指出饲粮中添加钒的量在50 mg/kg以下，对大鼠的肝脏、肾脏、脾脏、心脏等器官指数都没有影响。本试验3个处理大鼠饲喂钒含量依次为0.107、0.137、0.164 mg/kg的饲粮，对肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肺脏均无显著影响，结果与前人报道一致，此结果说明给蛋鸡饲喂含钒5和10 mg/kg饲粮，其所得鸡蛋粉配制的饲粮钒残留量都较低，不足以引起大鼠器官指数的变化。
血浆中AST和ALT活性变化，可以反映动物体肝脏的健康状况，而UN含量变化可以反映肾脏结构的变化，TG含量能反映动物体肝脏脂肪代谢功能，MDA含量变化则能说明机体脂质过氧化的程度。孙素玲等[20]给大鼠以饮水形式每天饲喂5 mg/kg的钒(偏钒酸铵)，大鼠血清中ALT、AST活性与对照组无差异。Liu等[4]给1日龄肉鸡饲喂含钒5 mg/kg饲粮直到42日龄，发现在试验第14、28和42天肉鸡血浆SOD活性、T-AOC、MDA含量无显著性变化。本试验中大鼠血浆ALT、AST活性以及TG、UN、MDA含量均无显著性差异，与前人研究结果一致。
组织中钒的残留量的变化反映钒在组织中的沉积规律以及沉积部位，可以作为钒产生作用的参考指标，而组织形态观察则能直观了解组织器官的结构变化，从而反映动物组织的功能的变化。Daniel等[15]研究表明大鼠摄入较低剂量的钒(每天饮水摄入1 mg/L的钒酸钠)对大鼠的组织钒残留量无显著影响。本试验结果发现饲喂3种蛋黄粉后大鼠肝脏和肾脏钒残留量无显著差异。
Liu等[4]给肉鸡饲粮中添加5 mg/kg钒，观察肉鸡器官的组织形态，肉鸡肝肾形态结构无影响，说明低剂量的钒对动物机体的肝肾结构无明显影响。从本试验3个处理的肝肾切片可以看出，处理2、3对大鼠肝脏、肾脏的组织结构无明显的损伤影响，可能是钒含量较低，不足以引起组织损伤[4]。肝肾抗氧化能力的变化反映肝肾对抗外界氧化物的能力。GSH和GST是抗氧化系统中的重要物质，GSH含量和GST活性能反映机体抗氧化能力的变化。SOD活性、T-AOC以及MDA含量是抗氧化能力最基本的指标。高价的钒能引起机体的氧化应激，影响肝肾的抗氧化能力[21]，从而造成肝肾损伤。Liu等[4]给1日龄肉鸡饲喂含钒5 mg/kg饲粮，证实在试验第14、28和42天肉鸡肝脏SOD活性、T-AOC、GSH和MDA含量无显著性变化。本试验3个处理的肝脏、肾脏MDA含量、SOD活性和T-AOC以及肝脏GSH含量、GST活性无显著差异，说明蛋黄粉中的钒未达到影响大鼠肝脏和肾脏生化指标的水平。
在人和鼠上进行的体内和体外的大量试验证实了钒可诱导肺脏、肝脏、肾脏、小肠上皮细胞氧化应激和氧化损伤[7,21]。Nrf2是一个基本的碱性亮氨酸拉链转录因子，是调节机体活性氧平衡的关键核因子。NQO1属于Ⅱ相解毒酶，其受到Nrf2的调控，在氧化应激条件下，其活性会增加[22]。研究发现钒(NH4VO3)能降低人类肝脏细胞(HepG2和Hepa 1c1c7)中NQO1 mRNA的表达，加大氧化应激[22]。Nrf2还是抗氧化酶系统的调控因子，SOD、NQO1、GST活性均受其调节。本试验处理2、3显著降低了肝脏NQO1活性，降低了Nrf2和NQO1 mRNA的表达量，其生物学意义有待进一步研究。
4 结 论3种含钒蛋黄粉对大鼠生长性能、血浆生化指标及肝肾病理等影响无显著差异，但含钒0.137和0.164 mg/kg可显著降低大鼠肝脏NQO1活性，降低肝脏NQO1和Nrf2 mRNA的相对表达量。
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