现代化养猪模式常因为粪尿及气体等排泄物的排放造成环境污染问题，这一现象已引起社会广泛关注。猪排泄物中含氮化合物的排放一方面浪费饲粮中氮源，另一方面形成污染源，其中含氮气体的释放会影响猪及饲养人员健康[1]。猪排泄物中的含氮化合物主要来源于饲粮中未消化的蛋白质和内源性含氮化合物。饲粮蛋白质大部分在胃和小肠消化吸收。随着饲粮中蛋白质添加水平的增加，消化道中未被前肠消化吸收的蛋白质经过水解作用常以肽或氨基酸的形式进入大肠，被大肠中栖息的微生物发酵利用，合成微生物蛋白(microbial crude protein, MCP)，同时生成大量气体及挥发性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)等代谢产物。
由于我国的优质蛋白质饲料资源相对缺乏，国内研究人员多关注饲粮中蛋白质水平对生产性能的影响，饲粮蛋白质水平不同程度降低后，对不同生长阶段猪的生产性能没有明显降低，并且对均日增重、平均日采食量、料重比等指标有一定程度改善[2-4]。如前所述，饲粮中不同水平蛋白质将影响进入大肠的未消化蛋白质或含氮化合物的浓度，并且饲粮变化会迅速影响肠道微生物菌群[5]，使其代谢产物及菌体合成能力发生改变，而微生物菌群代谢产物又与宿主的生理健康状况密切相关，因此使不同水平蛋白质对肠道微生物发酵特性及代谢产物的影响值得关注，但是目前关于不同蛋白质水平对猪大肠微生物发酵特性影响相关研究鲜有报道。本文拟在体外培养的条件下，研究不同蛋白质水平对结肠微生物发酵能力、主要代谢产物以及合成菌体能力的影响，探讨不同水平蛋白质对结肠微生物发酵特性的影响，了解猪结肠微生物对蛋白质的利用规律。
1 材料与方法 1.1 底物、培养基和接种物的制备底物：酪蛋白水解物(casein enzymatic hydrolysate)(北京索来宝科技有限公司，酶水解酪素C8210)；培养基：参照Longland等[6]方法配制培养基，去掉其中含氮化合物。厌氧分装至已装有底物的发酵瓶中，每瓶95 mL；结肠微生物接种液：5头杜×长×大商品猪屠宰采结肠食糜，磷酸缓冲盐溶液(PBS)1：5(w/v)稀释，混匀，4层无菌纱布过滤至血清瓶，接种至上述培养基中，每瓶5 mL。发酵体系为100 mL。
1.2 试验设计试验在结肠微生物发酵液中分别添加0(C组)、0.10(L组)、0.25 g/L(H组)酪蛋白水解物，每组20个发酵瓶(每个发酵瓶为1个重复)。接种后将发酵瓶迅速置于37℃恒温培养箱中发酵24 h。
1.3 测定指标及方法每组中4个重复在发酵3、6、9、12、18、24 h时，参照Theodorou等[7]方法，使用Reading Pressure Technique(RPT)装置测定产气量，并在24 h发酵终点采样，另外16个重复在0、3、9、12 h每组每个时间点冰浴终止发酵4个重复，采样测定pH及MCP、氨态氮(ammonia nitrogen, NH3-N)、VFA浓度。参照马艳艳等[8]方法，用pH计(德国, Schott)测定pH；取1 mL发酵液加入1 mL 0.2 mol/L盐酸保存，用靛酚方法测定氨态氮浓度[9]；参照Makkar等[10]，用NanoDrop2000c分光光度计(spectrophotometer)(美国, Thermo Fisher)测定MCP浓度。参照Mao等[11]，取1 mL发酵液加入200μL偏磷酸巴豆酸混合液保存，用GC-14B气相色谱仪(gas chromatograph, GC)(日本岛津)测定VFA浓度。
1.4 统计分析试验数据经Excel 2013初步处理，用SPSS 20.0单因子方差分析(one-way ANOVA)进行差异显著性分析，P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 不同蛋白质水平对猪结肠微生物发酵液中pH影响由表 1可见，发酵期间，对照组(C组)在发酵期间pH基本保持不变，蛋白质底物添加组(H组和L组)的发酵液中pH整体呈现先下降后增长的趋势，在3、6 h显著低于对照组(P < 0.05)，12 h时均上升，其中L组显著高于C组和H组(P < 0.05)，至24 h时，H组和L组pH上升至对照组水平，3组之间无显著差异(P>0.05)。
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表 1 体外发酵中各时间点pH变化 Table 1 Changes of pH at each time point during in vitro fermentation |
由图 1可见，在各个时间点，H组、L组累积产气量均高于C组，C组在12 h以后产气量不再增加，而H组与L组体外发酵产气量趋势基本一致，在发酵0～9 h之间产气量快速增加，之后缓慢增加，H组累积产气量从发酵6 h开始明显高于L组，终止发酵时H组累积产气量为(106.38±1.31) mL，高于L组的(104.13±2.51) mL。
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图1 体外发酵期间累积产气量 Fig. 1 Cumulative gas production of in vitro fermentation |
由表 2可见，在各个时间点，H组、L组发酵液中MCP浓度显著高于C组(P < 0.05)，其中在6 h时H组MCP浓度又显著高于L组(P < 0.05)。总体上，H组和L组在0～12 h之间缓慢上升，12～24 h基本保持不变。
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表 2 体外发酵期间MCP浓度变化 Table 2 Changes of MCP concentration during in vitro fermentation |
由表 3可见，H组和L组发酵液中的氨态氮浓度随着发酵的进行持续增加，并且，发酵液中氨态氮浓度随着酪蛋白添加水平显著增加，即在发酵3、6、12、24 h，H组显著高于L组(P < 0.05)，均显著高于对照组(P < 0.05)。
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表 3 体外发酵期间氨态氮浓度变化 Table 3 Changes of NH3-N concentration during in vitro fermentation |
从表 4可见，不同蛋白质水平对结肠微生物发酵液中总挥发性脂肪酸(total volatile fatty acids，TVFA)、总支链脂肪酸(total branched-chain fatty acid, TBCFA)及乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸浓度均有一定影响。TVFA：发酵3 h时各组TVFA浓度没有显著差异(P>0.05)，6 h开始3组之间TVFA浓度差异显著(P < 0.05)，H组>L组>C组。乙酸：H组乙酸浓度在发酵3 h时显著高于L组和C组(P < 0.05)，其他时间点3组之间差异显著(P < 0.05)，H组>L组>C组。丙酸：发酵3 h时H组和L组丙酸浓度显著高于C组(P < 0.05)，6、12 h时3组之间丙酸浓度差异显著(P < 0.05)，H组>L组>C组；24 h时H组和L组丙酸浓度显著高于C组(P < 0.05)。丁酸：发酵3 h时H组和L组丁酸浓度显著高于C组(P < 0.05)，6、12、24 h时3组之间丁酸浓度差异显著(P < 0.05)，H组>L组>C组。异丁酸：发酵3 h时异丁酸浓度在3组之间无显著差异(P>0.05)，6和24 h时3组之间差异显著(P < 0.05)，H组>L组>C组，12 h时H组和L组异丁酸浓度显著高于C组(P < 0.05)；异戊酸：3组之间异戊酸浓度在发酵0～24 h中均有差异显著(P < 0.05)，H组>L组>C组。TBCFA：发酵3 h时H组TBCFA浓度显著高于C组(P < 0.05)，但与L组无显著差异(P>0.05)，6、12、24 h时3组之间TBCFA浓度差异显著(P < 0.05)，H组>L组>C组。
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表 4 体外发酵期间各时间点VFA浓度变化 Table 4 Changes of VFA concentration at each time point during in vitro fermentation |
微生物利用未经宿主消化吸收的营养物质产生代谢产物的同时会产生大量气体。在发酵体系中，产气量是评定微生物发酵能力的重要指标[12]，气体产量的高低一方面取决于饲料可发酵成分的含量，另一方面取决于微生物的降解能力[13]。蛋白质作为一种微生物可利用的底物，经过前肠消化吸收后的蛋白质主要以氨基酸的形式被利用，并且微生物可以快速利用氨基酸[14]，产气量的不同，一定程度上反映微生物对蛋白质利用情况的差异。Jha等[1]认为，降低饲粮中蛋白质水平，增加粗纤维，可减少猪肠道气体排放。本试验结果与其观点相似，随着蛋白质水平的升高，发酵体系中累积产气量显著增加，显示在本试验条件下，微生物的发酵能力随着蛋白质水平的升高而增加。
3.2 不同蛋白质水平对猪结肠微生物代谢产物的影响进入结肠的蛋白质在水解作用下以氨基酸的形式被微生物利用，一方面合成微生物自身增殖所需的蛋白质，即MCP，另一方面代谢产生气体，如氢气(H2)、甲烷(CH4)、二氧化碳(CO2)、硫化氢(H2S)、VFA[包括短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)和支链脂肪酸(branched-chain fatty acids，BCFA)]，以及酚类、吲哚、胺类、硫化物、氨等物质[15]，这些代谢产物广泛参与机体的代谢[16]，共同作用使肠道内环境发生改变[17]。
MCP浓度反映着微生物利用底物为自身合成蛋白质的需要。本试验结果显示，添加外源的蛋白质显著增加MCP浓度，但是，除6 h外，在其他时间点，蛋白质水平的增加并不能显著增加发酵液中MCP浓度。这可能预示着，微生物利用氨基酸合成自身所需蛋白质的能力有限，肠道中含氮化合物的增加并不能进一步促进微生物菌体的合成。此外，氨态氮浓度变化反映微生物对蛋白质的降解能力的改变。Geypens等[18]研究发现，饲粮中蛋白质的添加可显著增加粪便中氨态氮浓度，本试验结果与其观点一致，在本试验条件下，氨态氮浓度显著受蛋白质水平影响。
微生物利用宿主未消化吸收的营养物质产生VFA，其中微生物利用碳水化合物及蛋白质水解产物(主要有天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸)生成SCFA，会为人体提供约10%的热量，并且其中丁酸与结肠上皮细胞的生理及代谢过程密切相关[19]。与SCFA不同，BCFA严格由微生物利用异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸生成，所以BCFA可以作为微生物利用蛋白质的标记[20]。Le等[21]将饲粮蛋白质水平从18%降至12%，显著降低了猪粪样中SCFA及BCFA浓度。Cho等[22]研究认为，饲粮蛋白质水平升高会显著增加猪粪样中SCFA及BCFA浓度。本试验结果与上述研究结果一致，随着蛋白质水平的升高，SCFA(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸)和BCFA(异丁酸、异戊酸)的浓度在试验不同时间点均有不同程度增加。
在本试验条件下，结肠微生物发酵液中MCP浓度在发酵6 h时基本已达峰值，而氨态氮和VFA浓度则随着时间及蛋白质水平增加而增加，这可能预示，结肠微生物可以快速利用蛋白质供自身需要并且其对蛋白质利用的能力有限，本试验添加0.10 g/L蛋白质时MCP浓度基本已经达到峰值，随着发酵的进行，更多的蛋白质会被微生物代谢产生氨态氮及VFA等代谢产物，并不会进一步促进MCP合成。
3.3 不同蛋白质水平对猪结肠微生物发酵液体系的影响微生物对蛋白质的发酵可改变肠腔中氨态氮、VFA及其他代谢产物的形成，最终改变肠腔内环境。Pieper等[23]认为，在饲粮中增加蛋白质水平，不改变粪样pH。Russel等[24]也认为饲粮中蛋白质水平不影响粪样pH。在本研究中，发酵体系中pH先下降后(3、6 h)又恢复至对照组水平，这提示，蛋白质的添加显著影响微生物发酵，进而降低pH，影响肠道内环境，但是随着时间延长，发酵体系趋于稳态，继而稳定环境，使pH恢复至正常水平。
4 结论①蛋白质的添加增加了结肠微生物的累积产气量。
②在体外发酵体系中，蛋白质的添加提高了MCP合成能力，并且在蛋白质水平为0.10 g/L时菌体合成能力达到峰值，但过量蛋白质不能进一步提高MCP合成能力。
③在体外发酵体系中，蛋白质的添加显著影响氨态氮浓度和VFA浓度，并且其浓度随着蛋白质水平和发酵时间增加而增加。
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