2. 国家粮食局科学研究院, 北京 100037;
3. 甘肃农业大学理学院, 兰州 730070
2. Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China;
3. College of Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
我国是世界上最大的棉籽生产国，有巨大的植物蛋白质资源[1]，近年棉籽年产量均在4 000万t以上。棉籽粕是棉籽经脱绒、脱壳和仁壳分离后，经预压浸提或直接溶剂浸提取油后获得的副产品，或由棉籽饼浸提取油获得的副产品。棉籽粕中含有大量的蛋白质，是世界上仅次于大豆的重要植物蛋白质来源[2]。目前，实际生产中配制家畜饲料配方时，棉籽粕的常规营养成分需要主要是以NRC(2012)[3]及《中国饲料成分及营养价值表(2014年第25版)》所推荐的数值为基准，这些标准均提供的是棉籽粕常规营养成分的平均值。然而，受产地、品种、加工工艺、储存方式和种植年份等因素的影响，不同来源棉籽粕的营养成分存在较大的变异。为了在动物饲粮实际配制过程中更加有效地利用棉籽粕资源，在设计配方前有必要对每一批不同来源棉籽粕的营养成分含量进行检测，并以实测值配制饲粮，从而提高原料利用效率，以达到精准配制饲粮的目的[4-8]。
利用近红外反射光谱技术可以根据被测样品的近红外光谱特征求得样品特定成分含量、伪劣辨识、产地溯源等，该技术有测量过程快速高效、低成本、无污染和多组分同时检测等优点，已被广泛应用于动物饲料原料及饲粮营养成分的快速预测[9]。
本试验以棉籽粕为研究对象，在全国范围内广泛收集样品，测定常规营养成分含量，并通过蛋公鸡强饲试验测定表观代谢能和真代谢能，评价其营养价值及变异；同时，利用FOSS近红外光谱仪采集棉籽粕样品近红外光谱数据，构建棉籽粕近红外光谱量化数据与常规营养成分指标和代谢能的关联模型，以服务于饲料行业的品质监管和实时监测。
1 材料与方法 1.1 棉籽粕样品的收集和制备收集我国新疆、山东、北京、陕西和湖北等不同种植地区的76个色泽和气味正常的棉籽粕样品为试验材料，样品来源见表 1。每个样品使用低温粉碎机粉碎过40目筛(0.42 mm)，四分法进行缩分，将缩分后大约500 g样品分为4份，分别用于实验室化学分析、近红外光谱扫描、蛋公鸡强饲和留样。样品用自封袋密封，储存于-18℃冰柜中。样品常规营养成分分析及近红外扫描前，自冰柜取出，置于室温平衡约1 h。
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表 1 不同来源棉籽粕样品 Table 1 Different sources of cottonseed meal samples |
水分含量用智能温度控制仪(精宏XMTD-8222)按照GB/T 6435—2006方法测定；粗蛋白质含量用全自动凯氏定氮仪(FOSS-8400)按照GB/T 6432—1994方法测定；粗脂肪含量用全自动索氏抽提系统(FOSS SoxtecTM-2050)按照GB/T 10359—2008方法测定；粗纤维含量用全自动纤维分析系统(FOSS-2010)按照GB/T 6433—2006方法测定；粗灰分含量智能箱式电阻炉(天津中环SX2-5-12)按照GB/T 6438—1992方法测定；总能用全自动氧弹量热仪(Parr6300，美国)测定。
所有营养成分含量均以风干基础表示。每个样品平均分析2次，取平均值作为近红外光谱分析的参比值，严格按照国标的化学法进行测定。
1.2.2 试验鸡处理和饲养管理采用单因素笼养随机区组试验设计，选择健康、体重为(2.5±0.3) kg的28周龄海兰褐蛋公鸡72只，分成12组，每组6个重复，每组蛋公鸡测定1种棉籽粕的表观代谢能和真代谢能，试验分7期完成，每期留1组设为内源组。每2期之间留15 d恢复期，恢复期内自由采食和饮水，供给充足商品蛋鸡料。试验前剪尽蛋公鸡肛门周围羽毛，缝合带洞瓶盖，适应2周，正试前3 d准备相应的集粪袋收集排泄物。
1.2.3 试验方法和操作采用排空强饲法，排空期12 h，其间断料不断水，排空期后进行强饲，每只蛋公鸡强饲30 g风干棉籽粕，强饲后马上装上集粪袋收集排泄物36 h。内源组为对照组，除不强饲外，其他操作均相同。
1.2.4 排泄物处理排泄物收集后倒入相应培养皿中，并添加10%盐酸10 mL，置于105℃烘箱中15 min灭酶和微生物，调至65℃连续烘72 h后在实验室回潮24 h后称重，粉碎过40目(0.42 mm)分析筛，密封保存备用。
1.2.5 代谢能测定方法测定风干饲料样中的干物质、总能和排泄物中的总能。干物质按照GB/T 6435—2006方法测定；总能用全自动氧弹量热仪(Parr6300，美国)测定。
1.2.6 表观代谢能和真代谢能的计算方法表观代谢能＝(食入总能-排泄物总能)/食入总干物质；
真代谢能＝表观代谢能+内源排泄能。
1.2.7 近红外仪仪器参数及光谱采集使用FOSS XDS型近红外光谱分析仪进行棉籽粕的光谱采集，扫描范围400~2 650 nm，分辨率8 cm-1，扫描次数64次，波长间隔2 nm，每个样品重复装样及扫描2次，取平均值，并转化为log1/R形式记录光谱数据。仪器配备移动式样品池及标准盖片。
1.2.8 模型的建立使用仪器自带计量学软件WinISI4进行光谱数据分析。样品按照3：1的比例，随机分成定标集(n=56)和验证集(n=20)，分别用于定标模型的建立和外部验证。
使用改进偏最小二乘法建立定标模型。定标前，使用6种去散射方法(无散射、标准正态变量校正结合去除趋势校正、标准正态变量校正、去趋势校正、标准多元去散射校正和加权多元去散射校正)和3种导数处理(0, 0, 1, 1；1, 4, 4, 1；2, 4, 4, 1)相结合，共18种方法对原始光谱进行预处理，提高信噪比，进而优化模型的预测性能。其中，3种导数处理的4个数值依次代表导数处理的阶数、导数的数据间隔、一次平滑点数及二次平滑点数。
1.2.9 模型的验证使用全局距离(global hood, GH)和t检验进行2轮异常值的剔除，其中GH≥10作为剔除光谱异常值的标准，t＞2.5作为剔除化学异常值的标准。
模型的内部验证采用交互验证法。衡量定标效果的参数包括定标决定系数(coefficient of determination for calibration, RSQcal)、定标标准差(standard error of calibration, SEC)、交互验证决定系数(coefficient of determination for cross-validation, 1-VR)和交互验证标准差(standard error of cross-validation, SECV)，其中以RSQcal最高和SECV最低的模型确定为最佳定标模型[10]。
定标模型建立后，采用独立的验证集对模型进行外部验证。衡量模型预测效果的统计参数为验证决定系数(coefficient of determination for validation, RSQv)和预测标准偏差(standard error of prediction, SEP)。依据AACC[11]规定，本试验选择RSQv≥0.84[10]时认为模型适用于日常分析。
2 结果 2.1 棉籽粕常规营养成分含量及其变异由表 1、表 2和表 5可知，本试验中所采集的棉籽粕样品来源于不同年份、种植地区和加工工艺，常规营养成分和代谢能的含量分布范围较宽，变异较大，具有较强的近红外取样代表性。棉籽粕样品基本分为黄色、褐色、红色和黑色。山东的棉籽粕偏黄色，尤其是德州的脱酚棉籽粕；新疆产棉籽粕大部分都是棕红色，部分产地的棉籽粕棉绒较少，粗蛋白质含量较高；其他棉籽粕样品多为褐色，个别样品为红色，可能是加工过程中加热过度，棉酚变性所致；本研究未有采集到黑色棉籽粕样品。饲料生产企业主要通过粗蛋白质含量来评定棉籽粕品质。本试验中粗蛋白质含量最低、粗纤维含量最高的棉籽粕样品来自河北，且此样品棉绒、棉壳成分较多；粗蛋白质含量最高的样品来自新疆，棉绒、棉壳成分较少。
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表 2 棉籽粕全集营养成分含量及变异范围(风干基础) Table 2 Nutrient contents and variation ranges of all cottonseed meal (air-dry basis, n=76) % |
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表 3 棉籽粕定标集营养成分含量及变异范围(风干基础) Table 3 Nutrient contents and variation ranges of calibration set of cottonseed meal (air-dry basis, n=56) % |
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表 4 棉籽粕验证集营养成分含量及变异范围(风干基础) Table 4 Nutrient contents and variation ranges of validation set of cottonseed meal (air-dry basis, n=20) % |
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表 5 棉籽粕代谢能及变异范围(干物质基础) Table 5 Metabolizable energy and variation ranges of cottonseed meal (DM basis) |
由表 2和表 5可知，棉籽粕常规营养成分平均含量与《中国饲料成分及营养价值表(2014年第25版)》数据相比，粗脂肪、粗纤维和真代谢能的变异较大，粗蛋白质、粗灰分和表观代谢能的平均含量均在《中国饲料成分及营养价值表(2014年第25版)》中棉籽粕相关数据的范围内。所测棉籽粕常规营养成分和代谢能间变异系数为2.52%~84.75%。变异系数由小到大依次为总能、粗蛋白质、粗灰分、水分、真代谢能、表观代谢能、粗纤维和粗脂肪，其中水分、粗脂肪、粗纤维、表观代谢能和真代谢能的变异系数均大于10%。
由表 2、表 3、表 4和表 5比较可知，棉籽粕全集、定标集及验证集各指标的含量范围、平均值及变异系数相近，且外部验证的各常规营养成分含量均在定标集范围内，说明3个样品集具有相似的样品分布，有利于定标模型的建立和外部验证分析。
2.2 最优定标模型的建立和验证全集棉籽粕样品的原始近红外光谱如图 1所示，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。样品原始光谱在近红外区出现了明显的吸收峰，但其吸收峰较宽，基线漂移(垂直偏移)较为严重。如图 2所示，通过二阶导数处理后，样品吸收峰得到增强，光谱差异更加明显，基线漂移现象也得到了校正。76个棉籽粕样品的有机物中含有C—H、O—H、N—H和S—H等含氢基团的成分，这些成分含量的不同影响其吸收峰的大小，各个样品之间的光谱不完全重合，根据光谱间的差异可判断样品的化学成分和成分含量[12]。
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图1 棉籽粕样品原始图谱和二阶导数处理2, 4, 4, 1 Fig. 1 The original picture of cottonseed meal samples and second derivative processing 2, 4, 4, 1 (n=76) |
试验采用改进最小二乘法回归(MPLS)搭配不同光谱预处理方法建立定标模型，最优模型的定标、交互验证和外部验证结果分别如表 6、表 7和表 8所示。对于各常规营养成分而言，水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、粗灰分和总能的RSQcal为0.923 5~0.975 8，1-VR为0.824 7~0.930 3，取得了良好的定标效果。水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、粗灰分和总能的RSQv为0.879~0.896。表观代谢能和真代谢能的RSQcal分别为0.969 0和0.926 8，1-VR分别为0.917 0和0.905 7，RSQv分别为0.911和0.892。
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表 6 不同来源棉籽粕常规营养成分的最优定标模型(风干基础) Table 6 Optimal calibration models for common nutrients of cottonseed meal from different sources (air-dry basis) |
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表 7 常规营养成分最优定标模型的外部验证(风干基础) Table 7 Optimal calibration models of common nutrients for external validation (air-dry basis) |
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表 8 代谢能最优定标模型的内部交互验证和外部验证(干物质基础) Table 8 Optimal calibration models of metabolizable energy for internal cross validation and external validation (DM basis) |
本试验选用400~2 650 nm波长段建模，最优定标模型中，水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、总能、表观代谢能和真代谢能的波长均在408~2 492.8 nm。
图 2为验证集棉籽粕常规营养成分及代谢能实测值与近红外光谱预测值之间的相关图，图中纵坐标为化学实验室实测值，横坐标为近红外光谱预测值，应用所建近红外光谱模型对验证集棉籽粕样品进行水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、灰分、总能及代谢能的预测显示，所有预测结果均在回归线附近，在报警限以内。
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图2 验证集棉籽粕常规营养成分及代谢能实测值与近红外光谱预测值相关图 Fig. 2 The correlation picture between measured value of common nutrients & metabolizable energy in validation set cottonseed meal and predicted value by near infrared spectrum |
棉籽粕由于品种、产地、年份和加工工艺不同，其营养成分变异较大[4]。不同的种植环境，包括降雨量、温度、日照时长和土壤条件等的差异，都影响棉籽的饱满度，从而影响棉籽粕的质量。有研究表明，棉籽因品种和生长环境的不同会造成其品质差异较大，生长期的长短影响棉籽的成熟度，棉籽的成熟度好则棉籽粕蛋白质含量高[13]。
本研究中不同年份的棉籽粕均长期保存在4℃下，未有发热和霉变现象发生，干物质和粗蛋白质含量在试验期间变化不大，矿物质含量几乎不发生变化。不过，由于制油工艺的不同，本试验棉籽粕样品中粗脂肪和粗蛋白质含量相差较大，与前人研究结果[14]一致。此外，棉籽品质及加工工艺对棉籽粕品质影响较大[13]。高温压榨时严重破坏棉籽粕中的蛋白质，且出油率低，但作为饲料原料使用时消化能含量高。低温压榨时易造成棉籽粕中游离棉酚含量高；而膨化浸出法成功解决了传统压榨法生产的棉籽粕中棉酚高的问题，但蛋白质和氨基酸的消化率会受影响[15]。预榨浸出法生产的棉籽粕出油率高，呈棕黄色粉末状[5]。在棉籽加工中，棉籽蛋白质由棉籽或棉籽粕生产的粗蛋白质含量在50%以上的产品组成，是一类蛋白质含量较高的棉籽加工产品的总称[2]。本试验共计有13个棉籽蛋白质样品，大部分来自新疆。试验发现，蛋白质含量高的棉籽粕，棉绒棉壳和粗纤维含量则较低；蛋白质含量低的棉籽粕，棉绒棉壳和粗纤维含量则较高，这与侯彩云等[16]研究结果一致。棉籽粕中的纤维成分与有效能值呈高度负相关[17]。与王安平等[18]和与张铖铖等[19]研究报道相比，本试验得出棉籽粕水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量的变幅均较大，但粗纤维含量偏低。这可能是由于棉籽粕在生产过程中，棉籽的去壳与脱绒程度有差异，以及棉籽粕生产加工工艺(压榨法、预榨浸出法和浸出法)的不同而导致[5, 20]，具体影响因素还有待进一步研究。
近红外光谱除含有样品自身的化学信息外，还包含有其他无关信息和噪声，如电噪声、样品背景和杂散光等[10]，因此，要对光谱进行预处理，如图 1所示，通过二阶导数处理后，样品吸收峰得到增强，光谱差异更加明显，基线漂移现象也得到了校正。研究结果表明，在常用的3种近红外建模方法中，以MPLS建立的校正模型的预测效果较好，肖昕等[21]、舒庆尧等[22]采用MPLS、最小二乘法回归(PLS)和主成分分析回归(PCR)3种回归技术建立稻谷种子、精米粉直链淀粉含量的定标模型，发现采用MPLS建立的回归方程，其校正标准误差和检验标准误差明显小于其他2种方法，其决定系数大于其他2种方法。本试验同样采用MPLS搭配不同光谱预处理建立棉籽粕样品常规营养成分定标模型，水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、粗灰分和总能的RSQcal为0.923 5~0.975 8，1-VR为0.824 7~0.930 3，取得了良好的定标效果。目前，国外知名的近红外仪生产企业有FOSS、Bruker、Thermo和ABB等，国内的生产企业有聚光科技和尼尔光电等。以FOSS为例，商业化检测小麦和玉米粗蛋白质和水分的近红外仪，配套模型的相关系数均大于0.95，是分别采集相应样品近2万个基础之上得到的，但实际应用中企业之间基本不共享公共数据库，技术相对封闭。国内聚光科技股份有限公司与中国农业科学院和中粮集团等单位合作，已有检测大豆、菜籽粕和豆粕等营养价值模型，其中豆粕水分、粗蛋白质和粗纤维的预测模型相关系数均大于0.9，在中粮集团和益海集团等一些大型企业中已应用。目前未发现企业中棉籽粕的营养指标近红外定标模型，本研究中棉籽粕的定标模型数据库会继续更新和扩充，以应用于企业。本试验中，水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、粗灰分和总能的RSQv为0.879~0.896，外部验证结果理想，结果表明，应用近红外光谱技术快速分析棉籽粕中的常规营养成分含量是可行的，这为饲料原料的快速分析提供了技术借鉴。
在棉籽营养品质性状分析中，已成功构建了棉籽蛋白质、油分、水分和棉酚含量等成分的定标模型[23-25]。近红外光谱法与化学法测定棉籽粕的粗脂肪相对误差较大，粗蛋白质、粗灰分和水分的测定结果[26]均无显著差异。李静[27]采集60个棉籽粕样品，用傅立叶变换近红外光谱仪建立预测棉籽粕化学成分的定标模型，水分、粗蛋白质、粗脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和粗灰分含量的定标模型可用于定量分析，各项决定系数为0.852 1~0.997 2，但预测棉籽粕粗脂肪模型的效果较差，可能与样品量较少和含量偏低有关，但水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维和粗灰分的预测模型可用于日常分析，与本试验结果是一致的。本试验中粗脂肪模型的RSQv为0.892，可用于日常分析。近红外检测技术中相关组分含量不应低于0.1%，样品组分含量尽量宽[28]，相关组分含量高，样品分布均匀，变异度大等有利于模型的建立。本试验中样品来源范围广，各组分含量差异较大，除粗脂肪外，其余各组分检出量均大于1%；除总能外，其余各组分变异度均接近或大于10%，均有利于模型的建立。本试验粗纤维的外部验证相关系数最低，RSQv为0.879，其他指标的定标相关系数也均未大于0.9，这可能与试验棉籽粕样品数量相对较少有关，而增加定标样本数量，可改善定标效果[23]。在建立定标模型的过程中，样品集的数量和样品成分的含量范围，对模型的建立起着关键性的作用。同时，样品代表性和实验室化学分析误差是影响近红外分析准确性的主要因素。因此，在建立定标时，应严格按照标准方法的误差要求对样品的成分进行准确测定[29]。
目前还未见关于蛋公鸡棉籽粕代谢能近红外预测模型的研究报道。武洪慧等[30]采用排空-强饲法测定了29个棉籽粕样品的代谢能值，表观代谢能为7.89~12.02 MJ/kg，均值为10.25 MJ/kg，真代谢能为9.74~13.87 MJ/kg，均值为12.12 MJ/kg，均高于本试验所测值，这可能是本试验所采集的棉籽粕样本量更大、范围更广所致。蛋公鸡对棉籽粕的代谢能由各常规营养成分含量相互作用决定，所以其光谱信息更复杂。陈立业[31]用70个胡麻饼样品建立的肉仔鸡表观代谢能近红外预测模型的RSQv为0.964。李军涛[28]用小麦和玉米样品建立了猪的表观代谢能近红外预测模型，也得到了模型可用于日常分析的结果。Losada等[32]采用近红外光谱法对蛋公鸡能量饲料的氮校正表观代谢能进行评定，其RSQv为0.952，由此表明，近红外方法可用于饲料代谢能的评定。目前，在饲料行业中的应用评价标准，一般为相对分析误差≥2.5，即RSQv≥0.84时，模型可用于实际检测[25]。本试验中的棉籽粕样品尽可能涵盖了将来要分析的未知样品的范围，并且在该范围内分布均匀，具有较强的代表性，各指标的RSQv均大于0.84，因此各指标模型均可用于日常分析。
4 结论①不同来源棉籽粕的营养成分和蛋公鸡代谢能变异较大，常规营养成分和代谢能间变异系数为2.52%~84.75%，其中水分、粗脂肪、粗纤维、表观代谢能和真代谢能的变异系数均大于10%。
②棉籽粕近红外光谱模型对水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、粗灰分和总能的RSQcal为0.923 5~0.975 8，1-VR为0.824 7~0.930 3，RSQv为0.879~0.896；表观代谢能和真代谢能的RSQcal分别为0.969 0和0.926 8，1-VR分别为0.917 0和0.905 7，RSQv分别为0.911和0.892。定标效果较理想，定标方程均可用于日常分析。
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