2. 国家粮食局科学研究院, 北京 100037;
3. 河南省食品原料工程技术研究中心, 洛阳 471023
2. Academy of State of Administration of Grain, Beijing 100037, China;
3. Henan Engineering Research Center of Food Material, Luoyang 471023, China
阿魏酸(ferulic acid,FA)化学名4-羟基-3-甲氧基-2-丙烯酸，是一种酚类化合物，普遍存在于中药、粮食、蔬菜、水果中[1-2]，其在谷物麸皮中含量较高[3]，在全麦粉中的含量为1.252 g/kg，在玉米面中的含量更高达2.317 g/kg[4]。多酚类物质如苹果多酚、茶多酚和葡萄籽多酚一般具有强抗氧化性，对高血脂、糖尿病等有一定的调节作用[5-7]。FA也有极强的抗氧化性[8]，并对Ⅱ型糖尿病、高血压和心脑血管疾病等有一定的治疗效果[9-12]。肥胖病主要表现在机体脂肪的过量积累，并且是Ⅱ型糖尿病、心脑血管疾病等的主要诱发因素之一[13]。多酚类物质及其衍生物，如富含FA的咖啡多酚、酒花多酚、没食子酸、没食子儿茶素和没食子酸酯均具有抑制脂肪积累的效果[14-17]。Son等[18]研究发现，在饲粮中添加FA或FA酯化物质谷维素可以显著抑制高脂饮食诱导的肥胖小鼠的体重增加，使总增重分别降低了47.50%和26.67%；Senaphan等[19]研究认为，大鼠每天口服30或60 mg/kg BW的FA可以改善高脂高碳水化合物诱导的代谢综合征，降低大鼠血清中甘油三酯(triglyceride,TG)和总胆固醇(total cholesterol,TC)的水平，并降低代谢综合征大鼠的体重。但是这些报道并未以脂肪变化为研究重点，只对体重、血脂水平等进行了检测分析，而FA对肥胖机体脂肪沉积和脂肪代谢等方面的影响尚未见系统报道。ob/ob小鼠是瘦素基因缺陷型小鼠，在青年时期即会严重超重，并形成肥胖病相关的体脂紊乱，如高血脂、肝脏脂质沉积等[20]。本试验以雄性ob/ob小鼠为研究对象，研究饲粮中添加不同量的FA(0.25%或0.50%)对ob/ob小鼠脂肪沉积和腹脂中脂肪酸组成的影响，旨在为进一步探明FA对预防和治疗肥胖病的功效提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器FA标准品：粉末状，纯度≥99%，购于上海晶纯生化科技股份有限公司。
TG和TC检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，脂肪酸标准品购于北京普析科技有限公司，其他常规试剂均为分析纯。
主要试验仪器如下：SynergyTM HT酶标仪(Biotek公司，美国)；海尔立式超低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)；Centrifuge-5810R型高速冷冻离心机(Eppendorf公司，德国)；罗氏生化分析仪(Roche公司，瑞士)；7890A气相色谱附氢火焰检测器(FID)，色谱柱为DB-23(Agilent公司，美国)；KD-BMⅢ生物组织包埋机、KD-3368AM切片机、KEDEE生物组织染色机(金华市科迪仪器设备有限公司)等。
1.2 动物饲养管理30只5周龄、体重相近的雄性ob/ob小鼠，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，为无特定病原体级(specified pathogen free,SPF)。ob/ob小鼠基础饲粮由南通特洛菲饲料科技有限公司提供，依照AIN-93M标准饲料配方设计，其组成及营养水平见表 1。ob/ob小鼠饲养在SPF实验动物房(国家粮食局科学研究院，北京)的独立送风笼具(individual ventilated cage,IVC)中。饲养室保持温度(23±2)℃，相对湿度50%，12 h/12 h光照日夜循环。配对饲喂，充足饮水，预饲1周。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
将30只ob/ob小鼠随机分成3组，每组10个重复，每个重复1只，分笼饲养。对照组(CON组)、低剂量FA添加组(L-FA组)和高剂量FA添加组(H-FA组)ob/ob小鼠分别饲喂在基础饲粮中添加0、0.25%和0.50% FA的试验饲粮。每周测定各组ob/ob小鼠体重、周采食量，称重前禁食12 h，试验期为9周。
1.3.2 样品采集采样前禁食12 h，称量ob/ob小鼠终体重。摘除小鼠眼球采集血样，分离血清，冻存于-80 ℃待测。采集血样后，ob/ob小鼠断颈处死，解剖分离肝脏和腹部白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)，称重后计算肝脏指数和腹脂率。取同一部位的肝组织，存于10%甲醛固定液中。剩余肝组织与WAT一并冻存于-80 ℃待测。
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用生化分析仪检测血清中TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平。
1.3.4 肝脂水平检测肝脏匀浆依照南京建成生物工程研究所提供的方法制备，按照检测试剂盒说明书采用酶联免疫吸附法检测肝脏中TG和TC水平。
1.3.5 肝脏病理学分析取固定24 h后的肝组织，包埋处理后，切片(厚度为5 μm)，经苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后在光学显微镜下以10×25倍视野观察肝组织中脂滴大小和密度变化。
1.3.6 腹脂脂肪酸组成检测按照GB/T 9695.7—2008操作，得到小鼠脂肪组织中的油脂，并按照GB/T 17367—2008的方法，用三氟化硼法对其脂肪酸进行甲酯化，利用气相色谱法(GB/T 17377—2008)分析其脂肪酸组成，主要包括棕榈酸(palmitic acid,C16 : 0)、棕榈油酸(palmitoleic acid,C16 : 1)、硬脂酸(stearic acid,C18 : 0)和油酸(oleic acid,C18 : 1)的含量(质量百分数)，并计算C16 : 1/C16 : 0和C18 : 1/C18 : 0。
1.4 数据统计分析试验数据用平均值±标准差表示，采用SAS 9.0统计软件中的ANOVA过程进行单因素方差分析，P<0.05为差异显著。
2 结果 2.1 FA对ob/ob小鼠体重、总增重和总采食量的影响由图 1可知，饲养期初始，各组ob/ob小鼠体重均呈稳定增长趋势，与CON组ob/ob小鼠相比，前4周L-FA组和H-FA组ob/ob小鼠的体重没有显著差异(P>0.05)。第5~6周，L-FA组和H-FA组ob/ob小鼠体重增长趋于平缓。第7周开始至饲养期结束，L-FA组与H-FA组ob/ob小鼠体重均显著低于CON组(P<0.05)。
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同一时间点，数据点无字母或有相同字母标注表示差异不显著(P＞0.05)，有不同小写字母标注表示差异显著(P＜0.05)。 At the same time piont, data points with no letter or the same letters mean no significant difference (P＞0.05), while with different small letters mean significant difference (P＜0.05). 图1 各组ob/ob小鼠每周体重变化 Fig. 1 Body weight change weekly of ob/ob mice in groups |
由表 2可知，各组总采食量无显著差异(P>0.05)，L-FA组与H-FA组ob/ob小鼠的总增重显著低于CON组(P<0.05)。
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表 2 各组ob/ob小鼠的总增重和总采食量 Table 2 Total weight gain and total feed intake of ob/ob mice in groups |
由表 3可知，L-FA组与H-FA组ob/ob小鼠的肝脏重和肝脏指数与CON组无显著差异(P>0.05)，但L-FA组和H-FA组ob/ob小鼠的肝脏重均有降低的趋势(P<0.10)。与CON组相比，饲粮中添加0.25%或0.50%的FA显著降低了ob/ob小鼠的腹部WAT重和腹脂率(P<0.05)。
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表 3 各组ob/ob小鼠的肝脏指数和腹脂率 Table 3 Liver index and abdomen lipid percentage of ob/ob mice in groups |
由表 4可知，饲粮中添加0.25%或0.50%的FA对ob/ob小鼠的血清TC和LDL-C水平均没有产生显著影响(P>0.05)。L-FA组与H-FA组ob/ob小鼠的血清TG水平显著降低于CON组(P<0.05)，只有当FA添加量为0.50%时，ob/ob小鼠的血清HDL-C水平才得到显著提高(P<0.05)，L-FA组ob/ob小鼠的血清HDL-C水平与CON组无显著差异(P>0.05)。
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表 4 各组ob/ob小鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平 Table 4 Serum TG, TC, HDL-C and LDL-C levels of ob/ob mice in groups |
由表 5可知，与CON组相比，饲粮中添加0.25%和0.05%的FA使ob/ob小鼠肝脏TG水平分别降低了50.00%和39.29%，肝脏TC水平降低了39.62%和43.72%，差异均达到显著水平(P<0.05)。
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表 5 各组ob/ob小鼠肝脏TG和TC水平 Table 5 Liver TG and TC levels of ob/ob mice in groups |
由图 2可知，同为10×25倍视野下，CON组ob/ob小鼠肝脏脂滴大而密集(图 2-A)，而L-FA组ob/ob小鼠肝脏脂滴明显减少(图 2-B)，并且大部分脂滴直径小于CON组，H-FA组ob/ob小鼠肝脏脂滴大小与密集程度相对于CON组也得到了明显改善(图 2-C)。
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A为CON组ob/ob小鼠肝脏组织切片，B为L-FA组ob/ob小鼠肝脏组织切片，C为H-FA组ob/ob小鼠肝脏组织切片。 A, liver section of ob/ob mice in CON group; B, liver section of ob/ob mice in L-FA group; C, liver section of ob/ob mice in H-FA group. 图2 各组ob/ob小鼠肝脏组织切片HE染色观察 Fig. 2 Observation on HE staining of liver tissue sections of ob/ob mice in groups (250×) |
由表 6可知，FA对ob/ob小鼠腹脂中C16 : 0和C18 : 0含量无显著影响(P>0.05)，但对C16 : 1和C18 : 1含量的增高有显著的抑制作用(P<0.05)。L-FA组与H-FA组ob/ob小鼠腹脂中C16 : 1/C16 : 0和C18 : 1/C18 : 0显著低于CON组(P<0.05)，且H-FA组C18 : 1/C18 : 0还显著低于L-FA组(P<0.05)。
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表 6 各组ob/ob小鼠腹脂脂肪酸组成 Table 6 Fatty acid composition in abdominal lipid of ob/ob mice in groups |
本试验通过在饲粮中添加一定量的FA，研究FA是否会对ob/ob小鼠的增重以及脂肪沉积和代谢有改善作用。本试验采用配对饲喂，使各组最终绝对总采食量无显著差异，各组ob/ob小鼠平均FA日摄入量分别为：CON组，0 mg/d；L-FA组，7.6 mg/d；H-FA组，15.5 mg/d，符合试验所设计的FA摄入梯度。
由试验结果可知，L-FA组和H-FA组ob/ob小鼠的总增重分别比CON组减少了23.01%和19.4%，Son等[18]的研究表明在饲粮中添加0.50% FA可以使总增重降低26.67%，与此相一致，但本研究结果说明更小的FA添加量也可达到减重的效果。与之类似的，饲粮中添加0.25% FA使ob/ob小鼠的脂肪重减少了24.66%，腹脂率降低了18.58%，而H-FA组ob/ob小鼠的脂肪重和腹脂率分别减少了21.97%和16.17%。各组ob/ob小鼠的肝脏指数无显著差异，饲粮中添加0.25%和0.50%的FA均使ob/ob小鼠的肝脏重降低了15.4%，有趋势但不显著，这说明FA对ob/ob小鼠脂肪沉积的抑制可能主要作用于脂肪组织。相对于CON组，L-FA组和H-FA组ob/ob小鼠肝脏中TG水平分别降低了50.00%和39.29%，TC水平分别降低了39.62%和43.72%，这与图 2显示出的FA具有改善肝脏脂滴积累的作用相一致，说明0.25%和0.50% FA虽未显著降低ob/ob小鼠的肝脏重，但可以抑制肝脏中脂质的积累。不同的是，Wang等[21]的研究发现口服FA虽可以降低高脂饲粮诱导的肥胖大鼠肝脏中TC水平，但是TG水平只有降低的趋势。其可能的原因是口服大量的FA与饲粮中含的FA在体内消化吸收的效率不同。在血液中，HDL-C的主要功能是促进血清中胆固醇的逆向转运[22]。本试验结果表明，H-FA组ob/ob小鼠的血清HDL-C水平相对于CON组显著提高，但血清TC水平没有显著变化。这与Marimuthu等[23]研究的结果并不相同，他们发现口服FA的代谢综合征大鼠的血清HDL-C水平比CON组升高了74.56%，血清TC水平则降低了35.37%。结果的差异可能是FA的摄入量和摄入方式不同导致。L-FA组与H-FA组ob/ob小鼠的血清TG水平相比CON组分别降低了10.56%和6.11%，而Marimuthu等[23]也报道高脂血症大鼠每天注射20 mL/kg FA可以显著降低血清与肝脏中的TG水平，与此结果类似。
Jeyakumar等[24]研究发现，饮食诱导肥胖大鼠模型中，大鼠脂肪组织的C16 : 1/C16 : 0和C18 : 1/C18 : 0会升高，但是该研究并未关注FA对脂肪酸组成的影响。在本试验中，相对于CON组，L-FA组ob/ob小鼠腹脂中C16 : 1/C16 : 0和C18 : 1/C18 : 0分别显著降低了15.59%和8.09%，H-FA组则分别降低了20.18%和13.62%，差异均达到显著水平。FA对脂肪组织中C16 : 0和C18 : 0的含量没有显著的改善作用，但是FA降低了C16 : 1和C18 : 1的含量，从而降低了ob/ob小鼠腹脂中C16 : 1/C16 : 0和C18 : 1/C18 : 0。硬脂酰辅酶A脱氢酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)是一种内质网酶，可以催化不饱和脂肪酸的合成[25]。在缺少SCD基因的ob/ob小鼠中，脂肪组织中C16 : 1和C18 : 1的含量及C16 : 1/C16 : 0和C18 : 1/C18 : 0有所降低[26]。因此，本试验中FA可能通过下调SCD基因的表达，有效减少不饱和脂肪酸的合成，抑制ob/ob小鼠的脂肪合成进程。
在本试验条件下，FA添加量为0.25%时较对ob/ob小鼠的总增重、腹脂、血清与肝脏的TG水平的改善作用都略高于添加量为0.50%时，但0.50%的FA对ob/ob小鼠的血清和肝脏TC水平有较好的改善效果。由此可知，若以减重降脂为目的，0.25%为较适宜添加量，若以降胆固醇为目的，则0.50%为较适宜添加量。FA等酚酸在人们日常饮食中含量丰富，在玉米等粗粮中的含量接近0.25%，这就鼓励人们在日常饮食中多以玉米、小米和糙米等富含FA等多酚类物质的谷物作为主食，提高对此类植物化学素的摄取，达到预防肥胖的保健效果。
4 结论本试验条件下，饲粮中添加0.25%和0.50%的FA均能够抑制ob/ob小鼠体重的增加，降低脂肪组织重量及腹脂率，降低血脂和肝脂水平，改善肝脏脂滴积累程度。以减重降脂为目的时，0.25%为较适宜添加量；以降胆固醇为目的时，0.5%为较适宜添加量。
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