反刍动物瘤胃微生物主要由细菌、原虫、古菌和真菌等组成[1-2]，其群体数量和结构与宿主动物机体的健康状况、饲料利用率、生产性能等密切相关[3]。油脂饲料可通过调控瘤胃微生物各群系的量、原虫吞噬细菌或古菌的互作等来影响瘤胃微生物群体数量及其结构，进而影响瘤胃发酵，最终影响宿主的饲料利用性能和生产性能。有研究报道，羊草底物条件下添加5%和10%的亚麻籽油显著降低了瘤胃微生物发酵的产气量和甲烷产量，提高了氢气产量[4]。而体外培养饱和度不同的植物油脂对培养液酶活、微生物活力[5]、瘤胃原虫、细菌蛋白及DNA[6]都有一定的影响。进一步对脂肪酸的研究表明，不同比例亚油酸与亚麻酸影响人工瘤胃体外发酵和其甲烷的生成，且随亚麻酸比例的升高效应增强[7]；而且不同的脂肪酸对瘤胃发酵所产生乙酸和丙酸的量也有不同的影响[8]。我们前期6种不同长链脂肪酸的试验表明，饱和程度对瘤胃微生物的发酵模式有一定的调控作用[9]，通过正交试验筛选出了对瘤胃微生物发酵模式(乙酸型发酵、丙酸型发酵、丁酸型发酵等)适宜的脂肪酸组合。但这些组合是否通过影响瘤胃细菌群体结构的机制来影响其发酵模式的尚不得而知。为此，本试验采用所筛选的脂肪酸组合进行瘤胃微生物的体外培养试验，通过检测不同瘤胃细菌种属的含量，以期为研究阐明脂肪酸影响反刍动物瘤胃微生态机理提供一些基础资料。
1 材料与方法 1.1 试验动物与饲养管理sa在扬州大学实验农牧场的奶牛场选取选3头体重为(560±18) kg、平均产奶量为(15.5±0.5) kg并安装有瘤胃瘘管的4岁龄荷斯坦奶牛以提供瘤胃液。试验期间瘘管牛饲喂给奶牛场提供的常规饲粮(精粗比为40∶60)，每日07:00和19:00等量饲喂，自由饮水。
1.2 试验设计与培养底物本课题组前期对于瘤胃微生物发酵调控具有代表性的4种脂肪酸(硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻油酸)进行体外模拟瘤胃发酵技术培养瘤胃微生物，研究获得了对于瘤胃乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸发酵最优的组合。根据得到最优脂肪酸组合比例，设计为5组。A组：对照组，培养底物含5%棕榈酸钙；B、C、D、E组培养底物采用硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的不同比例组合：B(1.5%、1.0%、0.5%和1.5%，乙酸型发酵)、C(1.5%、1.0%，1.5%和1.0%，丙酸型发酵)、D(1.0%、1.5%、1.5%和0.5%，丁酸型发酵)、E组(1.5%、0.5%、0.5%和1.0%，总挥发性脂肪酸型发酵)。其中不足5%者由棕榈酸钙补足5%。每组各设3个重复，另外设1个无底物的空白对照。培养底物组成见表 1。
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表 1 体外培养底物的组成 Table 1 Composition of in vitro culture substrates |
体外培养参照Menke等[10]的方法。晨饲前通过瘤胃瘘管从3头瘘管奶牛采集瘤胃液，按人工唾液盐∶瘤胃液=2∶1配制好培养液，通CO2 39℃水浴预热备用。准确称取各组1.50 g底物置于培养瓶中，分别加入150 mL培养液，通CO2 39℃50 r/min振荡培养。在培养后0、3、6、12、18、24 h分别采集培养液待测。
1.4 引物设计在GenBank上查找琥珀酸拟杆菌(Fibrobacter succinogenes)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)等不同菌株的16S rDNA序列，然后利用DNAStar中MegAlign进行序列比对，寻找种内保守区域，利用Primer express 5.0进行引物设计，并通过GenBank中Blast检测引物特异性。以细菌通用引物细菌U(Bacterial-U)为内参，对各细菌进行相对定量。细菌引物序列见表 2。
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表 2 细菌引物信息与序列表 Table 2 PCR primers sequence of bacteria |
采用上海雷磁pHS-3C型酸度计即时测定样品pH；采用冯宗慈等[11]的方法测定氨氮浓度。瘤胃细菌DNA参照Zoetendal等[12]的珠磨法提取，采用实时定量PCR(RT-PCR)法在7500型RT-PCR仪上进行定量检测。
1.6 微生物含量计算采用相对定量法定量各菌，根据如下公式计算：
目标菌含量=2-(Ct目标菌-Ct总细菌)。
式中：Ct目标菌为目标菌循环阈值；Ct细菌U为细菌U循环阈值。
1.7 统计分析数据结果采用Excel 2003建立数据库，采用SPSS 17.0软件中的General Linear Model的Univariate方法进行统计分析，以P < 0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果 2.1 不同脂肪酸组合对培养液pH的影响表 3表明，培养液pH在6.02～6.52的范围内变化。不同脂肪酸组合的影响不显著(P>0.05)；但时间的影响显著(P < 0.05)，以培养后3 h的pH最高。时间和脂肪酸组合对pH有显著的互作效应(P < 0.05)，表现为：各组pH都在0～3 h间上升、在3～12 h间下降，其变化趋势比较一致；但在12～18 h间除A组外皆有所下降，在18～24 h间A、B组下降，而C、D、E组上升。
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表 3 不同脂肪酸组合对培养液pH的影响 Table 3 Effects of different fatty acid combinations on pH of culture medium |
表 4表明，培养液氨氮浓度在7.91～17.05 mg/dL范围内变化。其中，脂肪酸组合的影响显著(P < 0.05)，以C组最高；时间的影响也显著(P < 0.05)，以0、3 h较低。时间和脂肪酸组合对氨氮浓度有显著的互作效应(P < 0.05)，表现为：在培养后0～3 h间，除A组下降外其他各组皆上升；在3～6 h间，除D组下降外其他各组皆上升；在6～12 h间，除B组上升外其他各组皆下降；在12～18 h间，除C组下降外其他组皆上升；18～24 h间，A、E组下降而B、C、D组上升。
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表 4 不同脂肪酸组合对培养液氨氮浓度的影响 Table 4 Effects of different fatty acid combinations on NH3-N concentration of culture medium |
表 5表明，除白色瘤胃球菌含量在组间没有显著差异(P＞0.05)外，其他种属细菌含量组间存在显著差异(P < 0.05)。其中，琥珀酸拟杆菌、生黄瘤胃球菌、蛋白溶解梭菌和嗜淀粉瘤胃杆菌的含量均以B组的较高。溶纤维丁酸弧菌和降解淀粉瘤胃球菌含量以C组较高，显著高于其他各组(P < 0.05)。而埃氏巨球菌含量以A组最低，显著低于最高的C组(P < 0.05)。
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表 5 不同脂肪酸组合对培养液瘤胃细菌含量的影响 Table 5 Effects of different fatty acid combinations on ruminal bacteria contents in culture medium |
各种所测定的细菌含量之间存在显著差异(P < 0.05)。其中，埃氏巨球菌含量最高(8.45)为优势菌属；而白色瘤胃球菌(0.27)和生黄瘤胃球菌含量(0.44)相对较低。以所测得的种属计瘤胃总细菌含量，则以C组最高，显著高于其他各组(P < 0.05)。
3 讨论 3.1 不同脂肪酸组合对瘤胃细菌体外发酵的影响本试验中，培养液pH的变化范围(6.02～6.52)不大且适宜于瘤胃微生物的生长。该结果与前人关于油脂或脂肪酸的试验结果有一定的一致性。体外培养瘤胃微生物，宋志刚等[13]在培养液中添加4%的饱和程度不同的4种油脂，没有显著影响pH；皮宇等[14]添加3%的饱和程度不同的6种脂肪酸，pH的差异也不显著。本试验中，氨氮浓度在7.91～17.05 mg/dL范围变化，也属于瘤胃微生物的发酵代谢与生长的适宜浓度范围[15]。但氨氮浓度在脂肪酸组合组间差异显著，并以C组较高而D组较低，C组>E组>B组>D组。由于本研究的脂肪酸组合处理B、C、D、E组的不饱和程度依次为0.92、1.00、0.50、0.71，即C组>B组>E组>D组，氨氮浓度高低顺序与处理的不饱和程度基本一致。其原因之一可能是随着不饱和程度的降低，其对瘤胃原虫群体量[16-17]和其吞噬细菌活力的抑制效应增加[18]，相应地，其细菌的数量将增加、发酵活力将增强，进而可能导致了氨氮浓度的升高。这也与本试验中所测得的总细菌含量的排序C组>B组>E组>D组基本一致。综合这些结果说明，不同的脂肪酸组合处理是通过影响了瘤胃细菌的群体进而影响其发酵的。另外，从时间的分析可见，C组氨氮浓度平均值较高主要归因于在3～12 h期间细菌发酵活力增强导致的氨氮浓度高于D组；相反，在18～24 h期间细菌生长活力增强利用氨氮也增加导致了氨氮浓度低于D组。
3.2 不同脂肪酸组合对体外培养瘤胃细菌的影响目前多数的报道是添加某种特殊的油脂或脂肪酸对瘤胃细菌的影响，系统探讨多种脂肪酸及其组合效应的研究并不多见，而本研究即是在前期筛选出对不同发酵模式最优的脂肪酸组合基础上再在进一步探讨其对瘤胃细菌的影响。本试验中，C组的总细菌含量最高，这与上述其不饱和度较高有关，也有可能和其脂肪酸间的组合效应有关。而与此同时，C组的溶纤维丁酸弧菌在组间也为最高。分析其原因，一方面是因为溶纤丁弧菌多栖居于液相[19]，而原虫也多吞噬为液相的0.2~1.0μm大小的杆菌和球菌，而该组的不饱和键又对原虫吞噬力有一定的抑制所致；另一方面，也可能是由于该组合适量不饱和油脂(亚油酸)的添加，促进了该菌的繁殖以及其氢化功能[20]。Lee等[21]也曾报道，添加不饱和油脂(鱼油)提高了亚油酸的生物氢化量。溶纤维丁酸弧菌在瘤胃中代谢底物广泛，主要发酵产物是丁酸和乳酸；同时该菌与埃氏巨型球菌、反刍兽新月单胞菌等交互饲喂，维持瘤胃液pH的稳定。其所产生的乳酸可由乳酸利用菌埃氏巨型球菌所利用，并通过丙烯酰辅酶A途径生成丙酸[22]。而本研究同时发现埃氏巨型球菌含量在C组也是最高的，为此可在一定程度上解释C组是发酵后丙酸含量最高的脂肪酸组合。
降解淀粉瘤胃球菌也多栖居于瘤胃液相，由于主要以淀粉为代谢底物，是高精料、低pH条件下相对活跃的菌属。如降解淀粉瘤胃球菌在瘤胃液pH较低的条件下含量较高[23]。关于饲粮，添加豆油和胡麻油的研究并没有发现肉牛瘤胃淀粉分解菌的变化[24]，但在本研究却发现C组的降解淀粉瘤胃球菌含量最高。这可能是由于该组不饱和程度较高使得原虫对液相菌的吞噬下降所致。同时，该菌的提高及其与其他菌属的交互饲喂也可能导致淀粉终代谢产物之一的丙酸含量的增加，而这在一定程度上说明，本组适合丙酸型发酵的脂肪酸组合可能是通过提高降解淀粉瘤胃球菌含量来实现的。嗜淀粉瘤胃杆菌也是瘤胃中淀粉降解菌之一，其主要产物为乙酸和琥珀酸[25]。本试验中该菌以B组最高，这在一定程度上解释了B组为乙酸型发酵的脂肪酸组合；同时，嗜淀粉瘤胃杆菌也是瘤胃中主要的蛋白质降解菌之一，可将蛋白质降解为氨氮和氨基酸，并成为其生长的底物[26-27]。结合氨氮浓度的结果发现，B组的氨氮浓度在培养后呈持续增长的趋势，这与该菌含量较高相吻合。这一结果同时也与王梦芝等[28]的研究中该菌在瘤胃液氨氮浓度高的豆粕饲粮中含量较高的结果相一致。
生黄瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌等降解纤维素类物质降解菌主要栖居于瘤胃固相，其发酵产物以乙酸为主。例如，高纤维素饲粮提高了牛瘤胃生黄瘤胃球菌和产琥珀酸拟杆菌数量[29]。本研究中，生黄瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌含量都在B组较高。其中，生黄瘤胃球菌含量在B组提高的结果与金龙等[30]体外发酵添加4%的棕榈仁油提高了生黄瘤胃球菌含量的结果一致；但产琥珀酸拟杆菌含量在B组提高的结果与乌日娜[31]添加6%的植物油脂时显著降低了瘤胃产琥珀酸丝状杆菌的结果有所不同。这可能是由于油脂添加超过一定比例时，因附着于瘤胃中纤维素和菌体表面，影响细菌的活动及其酶的分泌；或损害部分纤维素降解微生物的胞膜而抑杀微生物有关[32]。本研究中B组这2种菌属含量的提高，与上述该组嗜淀粉瘤胃杆菌含量较高等结果一致，这说明B组的脂肪酸组合可能是通过影响瘤胃细菌组成来进一步提高其乙酸发酵的。但在本研究中，B组白色瘤胃球菌含量并没有显著增加，这和金龙等[30]添加4%椰子油或棕榈仁油不影响白色瘤胃球菌含量结果一致。有研究认为，白色瘤胃球菌含量所产生的抗菌素可抑制生黄瘤胃球菌的生长[33]。进一步探讨本试验中试验组白色瘤胃球菌含量排序为D组>C组>E组>B组，而生黄瘤胃球菌含量为B组>E组>C组>D组，不难发现，2种菌属的含量排序相反，提示它们间可能存在一定的互抑作用，有关其互抑机制尚有待于进一步地探索。
4 结论①体外培养添加不同脂肪酸组合，培养液pH和氨氮浓度都在适宜范围内变化，但其瘤胃总细菌和部分细菌种属含量有显著变化，这与发酵模式有关。
②培养底物中硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸含量分别为1.5%、1.0%、0.5%和1.5%时，培养液琥珀酸拟杆菌、生黄瘤胃球菌、蛋白溶解梭菌和嗜淀粉瘤胃杆菌含量较高。
③培养底物中硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸含量分别为1.5%、1.0%，1.5%和1.0%时，培养液溶纤维丁酸弧菌、降解淀粉瘤胃球菌和埃氏巨球菌含量较高。
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