人和动物的肠道中存在着数量庞大、种类繁多的微生物，它们与宿主的营养代谢和健康密切相关。单胃动物小肠中虽然具有很高的微生物多样性，但是大肠中微生物的数量远远多于小肠，如生长育肥猪的盲肠、结肠和直肠是微生物聚集的主要区段[1]。猪等单胃动物摄取的食物大部分在小肠被消化吸收，然而仍有一部分会进入后肠，被微生物发酵利用[2]。一般认为，盲肠和结肠中微生物发酵碳水化合物产生的短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)有益于宿主健康，而微生物发酵蛋白质主要产生氨、酚类、吲哚类等潜在有害物质[3]。单胃动物后肠微生物的发酵速度和产物含量主要受后肠食糜蛋白质和碳水化合物水平的影响[4]。虽然有很多学者研究了进入后肠的蛋白质种类及水平在大肠发酵中的作用，然而鉴于肠道环境的复杂性，蛋白质水平对猪后肠发酵模式的影响并不清晰[5]。
Morita等[6]在以小鼠为模型研究发现，提高蛋白质水平可以促进SCFA的产生；Htoo等[7]研究显示，将蛋白质水平从24%降低到20%时，显著降低了盲肠中SCFA的含量；然而Opapeju等[8]研究结果表明，降低蛋白质水平不影响猪后肠中SCFA的含量。随着我国养猪业的快速发展，生猪养殖造成的环境氮污染日趋严重，其中66%的氮污染来自养殖过程中粪尿等排泄物[9]。有研究发现，降低饲粮蛋白质水平同时补充晶体氨基酸，不影响生长性能，并且可以减少尿氮的排泄量[7]。因此，研究蛋白质在猪后肠的转化机制，提高蛋白质饲料的利用率，是促进动物健康、减少氮污染的有效措施。本文首先测定了正常饲喂条件下杜长大肥育猪大肠不同区段食糜养分组成，然后在体外条件下研究了不同蛋白质水平对猪盲肠微生物发酵特性的影响，以期为研究猪后肠蛋白质代谢提供参考。
1 材料与方法 1.1 底物、培养基及接种物的制备底物及培养基：蛋白质底物为酪蛋白水解物(北京索来宝科技有限公司，C8210，总含氮量约为13.1%)；培养基参考Dai等[10]的方法配制。
接种物的制备：试验选用体重60 kg左右的健康杜长大三元猪3头，饲喂基础饲粮，其组成及营养水平见表 1，自由饮水。屠宰后分离盲肠，立刻带回实验室，称取等量新鲜食糜，用灭菌的磷酸盐缓冲液(pH为7.4)1：5(质量体积比)稀释，振荡混匀，用4层灭菌纱布过滤，将滤液装进血清瓶后密封，放进37℃的水浴锅备用。全部操作过程通CO2保持厌氧环境。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
首先采集10头杜长大肥猪盲肠、结肠前段和结肠后段食糜，测定其中水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量，利用以下公式推算食糜中碳水化合物(包括粗纤维和无氮浸出物)的含量。
碳水化合物(%)=100-[水分(%)+粗蛋白质(%)+粗灰分(%)+粗脂肪(%)]。
然后根据食糜养分测定结果进行体外发酵试验，分为试验组(基础培养基+接种物+底物)和负对照组(基础培养基+接种物)，试验组蛋白质水平分别为1.00、1.75和2.50 mg/mL，每组4个重复。除负对照组外，试验组均以酪蛋白水解物作为唯一氮源。
1.3 体外发酵指标的测定产气量的测定参照Theodorou等[11]的方法；SCFA含量测定参照秦为琳[12]的方法；菌体蛋白(microbial protein, MCP)含量测定参照Makkar等[13]的方法；氨态氮含量测定参照梁剑光等[14]的方法。
1.4 数据处理试验数据经Excel 2007初步统计处理后，采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，数据以平均值±标准差表示，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 猪大肠食糜养分分析由表 2可知，猪大肠食糜中各养分含量变异性较大。盲肠粗蛋白质含量变化范围为1.40%～3.24%，平均含量为2.59%；碳水化合物含量变化范围为3.49%～8.49%，平均含量为6.81%；碳水化合物与粗蛋白质含量比(C/N)为1.86～3.24。结肠粗蛋白质含量相对于盲肠明显升高，结肠前段和结肠后段粗蛋白质平均含量分别为4.05%和4.96%；而碳水化合物与粗蛋白质含量比则与盲肠相似，平均值分别为2.57和2.78。根据食糜养分分析结果，确定体外发酵C/N＝1.60(小于1.86)为高蛋白质水平组；C/N=4.00(大于3.24)为低蛋白质水平组，C/N=2.28(1.86～3.24)为中蛋白质水平组。
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表 2 猪大肠不同区段食糜养分含量(鲜样基础) Table 2 The nutrient content of chyme in different extents of large intestine of pigs (fresh matter basis) |
由图 1可知，试验组产气量随时间延长呈逐渐上升趋势，前12 h发酵迅速，产气量在3和9 h之间产气量呈线性(R2=0.999)增加，24 h以后基本趋于稳定。3和6 h 3个试验组累计产气量差异不显著(P>0.05)；9、12、18和24 h低蛋白质水平组与中蛋白质水平组累计产气量差异不显著(P>0.05)，高蛋白质水平组相对于其他2组的产气量显著增加(P < 0.05)。
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*表示在此时间点高蛋白质水平组与低蛋白质水平组和中蛋白质水平组差异显著(P < 0.05)。 * indicated that the high protein level group was signifi-cantly different with low protein level group and middle pro-tein level group (P < 0.05). 图 1 不同蛋白质水平体外发酵24 h产气量动态变化曲线 Figure 1 Dynamic change curves of gas production of different protein levels during 24 h in vitro fermentation |
由表 3可知，氨态氮含量随着蛋白质水平的升高极显著增加(P < 0.01)，且呈线性变化(R2=0.998)。MCP含量随底物蛋白质水平的升高显著增加(P < 0.05)，高蛋白质水平组MCP含量显著高于低蛋白质水平组(P < 0.05)。底物蛋白质水平对pH没有显著影响(P>0.05)。
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表 3 不同蛋白质水平对体外发酵pH及氨态氮和MCP含量的影响 Table 3 Effects of different protein levels on pH, contents of NH3-N and MCP in in vitro fermentation |
由表 4可知，中蛋白质水平组和高蛋白质水平组总SCFA和乙酸含量显著高于低蛋白质水平组(P < 0.05)。丁酸、戊酸、支链脂肪酸、异丁酸和异戊酸含量随蛋白质水平的提高逐渐增加，且各组间差异显著(P < 0.05)。蛋白质水平对丙酸含量没有显著影响(P>0.05)。
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表 4 不同蛋白质水平对体外发酵SCFA含量的影响 Table 4 Effects of different protein levels on SCFA content in in vitro fermentation |
pH是反映底物发酵状况的综合指标之一，本试验中pH在6.80～6.83内变化，适合猪盲肠微生物生长。产气量是反映微生物对底物利用和发酵特性的重要指标，产气的快慢反映了微生物对底物的利用速度。本试验发酵的前3 h产气缓慢，可能是因为微生物适应底物和降解需要时间，减缓了微生物的生长速度；之后产气量迅速增加，表明微生物生长迅速，可能是因为发酵中使用的酪蛋白水解物和葡萄糖都溶于水且易于被微生物降解利用。产气量随蛋白质水平升高而增加，说明提高蛋白质水平可促进微生物的发酵作用。产气来源于微生物发酵底物生成SCFA的过程，故发酵过程中产气速度和累计产气量在一定程度上反映了微生物的总体活力和SCFA的产生情况[15]。
SCFA是单胃动物后肠微生物发酵的重要终产物，SCFA主要由碳水化合物发酵产生，但同时蛋白质也是产生SCFA的重要发酵底物[16]，90%以上的SCFA可以被迅速吸收[17]，为宿主肠上皮细胞和机体其他组织提供能量。在本试验中观察到低蛋白质水平组SCFA含量显著低于高蛋白质水平组，可能是因为在碳源充足的条件下，氮源成为限制微生物生长的主要因素。Morita等[6]在小鼠上的研究发现，以易消化的酪蛋白作为对照，增加饲粮抗消化蛋白质的水平，可以提高小鼠盲肠中总SCFA含量。Getachew等[18]在体外试验中也发现，产气量和SCFA含量随着氮源水平的升高而增加。这与本试验结果一致，说明氮源水平是影响微生物发酵的重要因素，提高氮源水平，可能会促进SCFA的产生。Liu等[19]研究显示，提高饲粮蛋白质水平可以增加盲肠与结肠食糜中乙酸含量，本试验结果与之印证。乙酸可以作为脂肪合成的前提物质或者肌肉组织的能源物质，并具有促进糖生成的作用，乙酸含量增加可以为动物机体提供能量。支链脂肪酸只能由支链氨基酸发酵产生[16]，可以作为蛋白质发酵的标志性产物。本试验观察到，异丁酸和异戊酸含量随蛋白质水平升高而增加，说明随着蛋白质水平的提高，微生物对蛋白质的利用加强。丁酸是肠上皮细胞优先利用的能源物质，Walker等[20]在一项以人的粪便为接种物的体外发酵试验中发现，提高蛋白质水平会升高丁酸含量，这与本试验结果相一致。说明以多肽作为氮源，在同等碳源条件下，提高氮源水平，可以显著增加丁酸含量。
3.2 不同蛋白质水平下盲肠微生物对含氮物的利用特性氮源是微生物生长所必须的营养元素，肠道微生物对蛋白质和多肽的利用是一个复杂的过程，多数微生物优先利用氨基酸和氨作为氮源，部分微生物可以利用蛋白质或多肽进行生长[5]。本试验以酪蛋白水解物作为氮源，氨态氮含量反映了微生物对蛋白质降解和对氨态氮摄取利用的综合能力。有研究显示，肠道食糜和粪样中氨态氮含量随蛋白质摄入量的增加而升高[3, 21]，本试验结果与之相符，说明微生物对蛋白质的降解作用随蛋白质水平升高而加强。在动物肠道中，高浓度的氨影响肠上皮细胞正常的能量代谢，增加肠上皮细胞间的通透性和减弱肠黏膜的屏障功能[22]，这被认为是高蛋白质饲粮引起仔猪腹泻的主要原因。
在瘤胃中微生物的生长活动受可发酵碳水化合物、氨基酸、核酸、肽、氨态氮、矿物质等多种因素的影响，其中碳水化合物和氮源是微生物生长所需的主要营养物质，体外发酵系统与瘤胃类似。Hristov等[23]研究发现，体外条件下瘤胃MCP的合成速率与氮源水平和蛋白质降解速率呈线性正相关，这与本试验结果一致。MCP含量增加，说明提高蛋白质水平促进了微生物的生长和对氨的利用，而将氨态氮转化为MCP有利于动物肠道健康，同时也降低了粪尿的氮，减少了氮污染。
4 结论①杜长大肥育猪大肠中碳水化合物和粗蛋白质含量比在一定范围内变化。
②体外条件下提高氮源水平，可以增加盲肠微生物发酵产生的SCFA。
③微生物对蛋白质的发酵作用会随底物蛋白质水平的升高而增强，但同时也会升高氨态氮含量。
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