氧化应激是指机体在需要清除体内老化的细胞或在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)产生过多，氧化程度超出机体对氧化物的清除能力，氧化系统与抗氧化系统失衡，使机体处于氧化应激状态，并最终导致组织损伤，引起疾病、衰老、甚至死亡。处于泌乳期的奶牛代谢旺盛，尤其在围产期和泌乳高峰期，由于机体产生较多的自由基而超过机体的防御能力，破坏蛋白质、核酸等生物大分子，使机体正常的代谢发生紊乱，即产生氧化应激[1]。奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells，BMEC)发生氧化应激不仅会影响健康，还会因为氧化产物的积累导致乳品质降低[2]。建立可靠的氧化应激模型, 是揭示氧化应激机制的重要措施之一，对改善奶牛健康和改进乳品质也具有重要意义。
一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种结构简单、分子质量小的生物自由基，研究证实，机体产生的NO具有双向调节功能。一方面，巨噬细胞产生的NO在体内和体外都有抗菌及抗肿瘤的作用，保护动物免除外界环境的感染[3]。另一方面，过高含量的NO还会导致活性氮的产生、细胞信号通路的阻断以及全身性不可控制的炎症，对机体产生氧化应激[4]。二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(diethylenetriamine/nitric oxide adduct，DETA/NO)是一种人工合成的一氧化氮/核苷化合物，其特点在于它无需酶的催化作用，能够快速释放NO。同时，DETA/NO也是目前所获得的半衰期最长的一氧化氮/核苷化合物之一，有利于体外试验的长时程观察。因此，DETA/NO是较为理想的诱导细胞损伤的外源性NO供体[5]。
然而，目前大多数细胞氧化损伤模型是以过氧化氢(H2O2)作为应激源构建的，关于以DETA/NO作为外源性NO供体构建细胞氧化损伤模型的报道鲜见，而针对BMEC构建NO损伤模型的研究尚未见报道。鉴于此，本试验采用DETA/NO作为外源性NO供体，摸索造成体外培养的BMEC氧化损伤的适宜作用浓度和作用时间，建立DETA/NO氧化损伤模型，为进一步深入探讨BMEC氧化应激机制及抗氧化机理奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料DMEM/F12(货号：12400-024)、胎牛血清(货号：10099-141)、胰岛素转铁蛋白溶液(货号：51500-056)、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(货号：25300054)、双抗(货号：15140-122)、胶原酶Ⅱ(货号：17101-015)、表皮生长因子(货号：E4127)、氢化可的松(货号：H0135)、催乳素(货号：L6520)、两性霉素B(货号：AE437)、DETA/NO(货号：146724-94-9)购自美国Sigma公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Amresco公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国HyClone公司。
1.2 试剂配制DETA/NO培养液的配制：取10 mg DETA/NO溶于612.8μL的超纯水中，配制成浓度为0.1 mol/L的母液。再将DETA/NO母液按试验要求配制成不同浓度的DETA/NO贮备液(0、0.001、0.003、0.010、0.050、0.100 mol/L)。在试验开始前，用不同浓度的DETA/NO贮备液配制成含不同浓度DETA/NO的细胞培养液(0、10、30、100、500、1 000μmol/L)，保证各浓度培养液中加入的DETA/NO溶液体积相等，使细胞培养液中除DETA/NO浓度不同外，其他成分都相同。配制好的细胞培养液用0.22μm的过滤器过滤除菌，每次换液时现配现用，并且避光保存。
1.3 BMEC的制备BMEC培养参照王新朋等[6]研究中所用的胶原酶消化法。于内蒙古呼和浩特市北亚清真屠宰场挑选采集健康的奶牛乳腺组织，迅速带回实验室，去除乳腺外层组织，取数块深层组织放入含3×双抗的PBS中，转入超净台中，依次经含有3×双抗的PBS清洗3遍、75%酒精(30 s)清洗1遍、含有1×双抗的PBS清洗3遍。在深层腺泡多的地方剪取约1 mm3大小的组织块块装入5 mL离心管中，进一步充分剪碎后加入等体积的0.5%胶原酶Ⅱ。置于CO2恒温培养箱(37℃、5% CO2)中消化1 h，为使组织块充分消化，期间每隔20 min拿出离心管轻轻摇晃1次。乳腺组织消化液用80目的细胞滤网过滤，收集滤液于15 mL的离心管中，1 300 r/min离心5 min后，弃上清。培养液重新悬浮细胞后接种于25 cm2的培养瓶中，置于CO2恒温培养箱中培养。待原代细胞的贴壁率达到80%~90%时，纯化BMEC并进行传代。
本试验采用第3代传代细胞进行研究，细胞经荧光免疫细胞染色法鉴定为BMEC[7]。连续培养到第3代时，将BMEC接种于96孔细胞培养板和60 mm细胞培养皿中，加入完全培养基(含0.5%胰岛素转铁蛋白硒钠、1μg/mL氢化可的松、5μg/mL催乳素、10 ng/mL表皮生长因子)培养至细胞贴壁率80%~90%时，弃去旧培养基，加入无血清培养基饥饿培养24 h，之后进行后续测定试验。
1.4 试验设计该试验分为2部分。试验1采用单因子完全随机试验设计，将第3代贴壁生长的BMEC随机分为36个组，每组6个重复，组细胞培养基中分别添加0、10、30、100、500、1 000μmol/L的DETA/NO，使之分别作用2、4、6、8、12和24 h。其中，0μmol/L为对照组。通过测定其对细胞存活率的影响，初步筛选DETA/NO适宜的作用时间。
试验2采用单因子随机试验设计，将第3代贴壁生长的BMEC随机分为4个组，每组6个重复，每组细胞培养基中分别添加0、10、30、100、500、1 000μmol/L的DETA/NO。其中，0为对照组。DETA/NO作用时间以试验1筛选得出的时间为准，以抗氧化指标为依据，进一步筛选出适宜的DETA/NO作用浓度。
1.5 样品采集细胞培养液的采集：BMEC经不同浓度的DETA/NO培养基培养6 h后，以处理和重复为单位，分别收集细胞培养液于1.5 mL Eppendorf管中，12 000 r/min离心10 min，收集上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)活性及NO、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的测定。
细胞样品的采集：BMEC经不同浓度的DETA/NO培养液培养6 h后，弃上清，将培养皿置于冰上，加入1 mL PBS清洗2遍，加入1 mL动物细胞裂解液冰上裂解30 min，之后用细胞刮板刮取贴壁细胞，收集于到1.5 mL Eppendorf离心管中，4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液用于细胞中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性和丙二醛(MDA)含量的测定。
1.6 测定指标与方法BMEC存活率采用MTT法测定。将BMEC悬液接种于96孔培养板中，按照上述试验设计培养，向各培养孔中加入20μL的MTT(5 mg/mL)；培养4 h后，弃去上清液，甩板并拍干液体，再向每孔加入100μL DMSO，使用全自动酶标仪振荡10 min后，在490 nm波长下检测各孔吸光度值(OD490 nm)。吸光度值反映细胞的存活数量，吸光度值越高，说明细胞的存活数量越多。
细胞存活率(%)=(试验组OD490 nm/对照组OD490 nm)×100。
细胞培养液中SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，CAT活性采用比色法测定。细胞中GPx活性采用二硫代二硝基苯甲酸法测定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定，操作步骤按照试剂盒说明书进行。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
细胞培养液中iNOS活性和NO、炎症细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)含量均采用双抗体夹心法测定，具体操作按照说明书进行。试剂盒购自美国R&D公司。
1.7 试验数据处理本试验数据用Excel进行初步整理及计算，采用SAS 9.0统计软件中的ANOVA程序进行单因素方差分析，并采用Duncan氏法检验进行多重比较。
2 结果 2.1 DETA/NO作用浓度与作用时间对BMEC数量的影响由表 1可见，在不同的作用时间下，DETA/NO的作用浓度对BMEC数量有显著的影响(P＜0.05)，随着DETA/NO浓度的增加，细胞数量呈不同程度的降低，当DETA/NO浓度为10μmol/L时，作用时间为2、4、6 h时，DETA/NO对细胞数量无显著影响(P＞0.05)，当作用时间延长到8、12、24 h时，与对照组相比，细胞数量显著减少(P＜0.05)，存活率分别为95.32%、92.54%、88.98%。当DETA/NO浓度增加到30~500μmol/L时，作用时间为2~6 h时，虽然细胞数量显著低于对照组(P＜0.05)，且细胞存活率均在80%以上。当DETA/NO浓度增加到1 000μmol/L时，所有作用时间的细胞数量均显著低于对照组及其他各浓度组(P＜0.05)。
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表 1 DETA/NO作用浓度与作用时间对BMEC数量的影响(以OD490 nm表示) Table 1 Effects of action concentration and time of DETA/NO on BMECs count (expressed as OD490 nm) |
随着DETA/NO作用时间的延长，DETA/NO各组的细胞数量均呈先降低又升高的趋势。与作用2 h相比，作用4 h的各组细胞数量均呈下降趋势，作用6 h，所有浓度组细胞数量均增加；但作用时间在6~24 h时，除500、1 000μmol/L外，其他浓度组的细胞数量波动较小。其中，细胞存活率在70%~80%内的DETA/NO作用浓度与时间分别是：1 000μmol/L DETA/NO作用细胞6 h，细胞存活率为74.27%；500μmol/L DETA/NO作用细胞8 h，细胞存活率为78.94%；100μmol/L DETA/NO作用细胞24 h，细胞存活率为76.60%。
2.2 DETA/NO作用浓度对BMEC抗氧化指标的影响由表 2可见，DETA/NO浓度对细胞SOD活性有显著的降低作用(P＜0.05)。与对照组相比，10、30μmol/L组SOD活性无显著差异(P＞0.05)。其中，浓度为1 000μmol/L的组SOD活性最低，显著低于对照组和10、30、100μmol/L组(P＜0.05)，与500μmol/L组相比，虽无显著差异(P＞0.05)，但在数值上低于500μmol/L组。随着DETA/NO浓度增大，细胞CAT活性也显著下降(P＜0.05)。与对照组相比，10μmol/L组CAT活性无显著变化(P＞0.05)，其余各组均显著低于对照组(P＜0.05)，其中，1 000μmol/L组最低。细胞GPx活性也呈现相似的变化规律，对照组GPx活性最高，且与10μmol/L组组间差异不显著(P＞0.05)。当DETA/NO浓度增加到30μmol/L，GPx活性显著低于对照组。1 000μmol/L组显著低于其他各组(P＜0.05)。细胞MDA含量则呈现与GPx活性相反的变化规律。与对照组相比，10μmol/L组无显著变化(P＞0.05)，但随着DETA/NO浓度的进一步增加，MDA含量逐渐升高。当DETA/NO浓度增加到500~1 000μmol/L时，MDA含量较高，显著高于其他组(P＜0.05)。500与1 000μmol/L组之间差异不显著(P＞0.05)，但在数值上1 000μmol/L组MDA含量高于500μmol/L组。
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表 2 DETA/NO作用浓度对BMEC抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of action concentration of DETA/NO on antioxidant parameters of BMECs |
由表 3可见，随着DETA/NO浓度的增加，细胞IL-1、IL-6、TNF含量呈不同程度的升高趋势。与对照组相比，10μmol/L组的细胞IL-6、TNF含量在数值上有所提高，但组间差异不显著(P＞0.05)。细胞IL-1含量在10μmol/L组、IL-6和TNF含量在30μmol/L组开始显著高于对照组(P＜0.05)。100、500μmol/L组的细胞IL-1、TNF含量组间差异显著(P＜0.05)，同时显著高于对照组及10、30μmol/L组(P＜0.05)。1 000μmol/L组的细胞IL-1、IL-6、TNF含量最高，显著高于对照组(P＜0.05)，但与500μmol/L组相比，无显著差异(P＞0.05)。BMEC经不同浓度的DETA/NO处理后，细胞iNOS活性与NO含量变化规律相似。与对照组相比，10μmol/L的DETA/NO对iNOS活性与NO含量无显著影响(P＞0.05)。之后随着DETA/NO浓度的增加，iNOS活性逐级显著升高，当浓度增加到1 000μmol/L时，iNOS活性达到最大值，显著高于其他各浓度组(P＜0.05)。NO含量呈相似变化规律，100与500μmol/L、500与1 000μmol/L组间差异均不显著(P＞0.05)，但在数值上均随DETA/NO浓度的增加有所提高。
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表 3 DETA/NO作用浓度对BMEC炎症因子含量的影响 Table 3 Effects of action concentration of DETA/NO on inflammatory cytokine contents of BMECs |
NO是细胞内和细胞间重要的信号调节分子, 除了参与神经信息传递、机体防御免疫以及细胞凋亡等生理功能维系外，现代分子医学研究证明NO还与众多疾病的发生发展关系密切[8]。临床病理学研究显示过量一氧化氮合酶(NOS)、NO的产生和炎性介质的大量表达在各病理器官中呈明显相关性，这提示NOS及其合成的NO和次级产物活性氮等可引发炎症反应[9]。DETA/NO是一种人工合成的一氧化氮/核苷化合物，其特点在于它无需酶的催化作用，能够快速释放NO。同时，DETA/NO也是目前所获得的半衰期最长的一氧化氮/核苷化合物之一，有利于体外试验的长时程观察，是较为理想的外源性NO供体[5]。因此，以DETA/NO为NO供体，诱导BMEC建立氧化损伤模型，可为科学调控奶牛乳腺抗氧化能力及机制研究提供了更好的试验平台。在关于氧化损伤模型的报道中，氧化应激判别标准也有所不同。在孙婧陶等[10]的报道中，建立延边奶山羊乳腺上皮细胞氧化损伤模型时，以细胞存活率为50%~60%作为筛选H2O2适宜作用浓度与时间的评判标准。齐晓龙等[11]以细胞存活率60%作为产蛋鸡肝细胞氧化损伤模型的评判标准。金鹿等[12]的研究指出，建立H2O2诱导的BMEC氧化损伤模型以细胞存活率70%~80%作为标准进行H2O2的初步筛选。不同种类的细胞对于氧化损伤的耐受力不同，对于细胞存活率判别标准的选择也不同。
由本试验结果可以看出，浓度为1 000μmol/L的DETA/NO作用细胞6 h、浓度为500μmol/L的DETA/NO作用细胞8 h、浓度为100μmol/L的DETA/NO作用细胞24 h，细胞存活率都在70%~80%，分别为74.27%、78.94%、76.60%。结果显示，DETA/NO作用4 h与2 h相比，细胞存活率均下降，但均在80%以上。500~1 000μmol/L的DETA/NO作用细胞8~12 h，除浓度为500μmol/L的DETA/NO作用8 h之外，其余组均对细胞造成严重的氧化损伤，细胞存活率下降至70%以下，最低达到49.28%。浓度为1 000μmol/L的DETA/NO作用细胞6 h、浓度为500μmol/L的DETA/NO作用细胞8 h，细胞存活率虽然均下降到70%~80%，但考虑到操作过程中的作用时间过长，将BMEC长时间暴露于高浓度的DETA/NO，会造成细胞大量死亡，以及不可逆的细胞损伤，这不利于氧化损伤建模进行后续试验。因此，根据细胞存活率初步确定：浓度为1 000μmol/L的DETA/NO作用细胞6 h即可发挥适宜的氧化损伤作用，细胞存活率为74.27%，符合筛选要求，并且可以在较短时间内观察到试验结果。
在正常生理情况下，自由基的产生和清除是处于动态平衡的。如果机体长时间处在病理状态下，体内产生大量自由基并在在体内蓄积不能及时被清除，就会对机体产生损伤。清除体内多余的自由基主要依赖于抗氧化损伤防御体系中的抗氧化酶, 如CAT、SOD、GPx等，它们发挥着重要的抗氧化防御作用，可以直接清除体内的多余的ROS，保护机体免受氧化损伤。MDA是自由基，是检测脂质过氧化反应的重要指标，能反映出氧化应激的程度[13-14]。因此，抗氧化指标是反映细胞是否发生氧化应激损伤及其损伤程度关键指标，因此确定细胞氧化损伤模型时，除考虑细胞存活率外，还必须考虑这些指标。本试验结果得出，与对照组相比，当DETA/NO的作用时间为6 h时，作用浓度达到100μmol/L即可引起SOD、CAT、GPx活性的显著降低，MDA含量的显著增加，说明DETA/NO引起了细胞的氧化应激损伤。此外，程广东[15]的研究指出，当机体的抗氧化酶含量或活性升高时, 机体往往也处于较高的免疫水平，表明氧化损伤与炎症关系密切。
如前所述，NO是一种结构简单、分子质量小的生物自由基，它具有双向调节作用，高含量状态下，可以激活核转录因子κB(NF-κB), 诱导促炎症细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6等的产生，IL-1、IL-6和TNF-α的产生又能激活iNOS，促使机体产生更多的NO，从而形成正反馈循环，使细胞因子的分泌以及其NO自身的合成得以持续，使炎症反应更持久，更剧烈，并最终引起DNA损伤，线粒体呼吸抑制等。其中重要的机制之一是超氧负离子的伴随产生，两者可以形成过氧亚硝酸盐阴离子等活性氮，对重要蛋白质进行氮化修饰，改变信号途径，直接和间接地介导了NO的细胞毒性效应[9, 16-17]。因此，NO与炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6均可反映细胞的氧化应激程度。本试验中，不同浓度的DETA/NO处理细胞后，在BMEC抗氧化能力下降的同时，各组的炎症因子含量、NO含量及iNOS的活性也呈现出与抗氧化酶活性相反的变化趋势；DETA/NO作用浓度达到30μmol/L即可引起活性氮NO和炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6的显著增加，说明DETA/NO作用浓度达到30μmol/L即可引起细胞不同程度的损伤。
建立氧化应激模型时，细胞存活率不宜过高或过低，既要引起足够的细胞损伤，同时还要考虑细胞存活率不可过低；若存活率过低，说明大量的细胞已经死亡，会造成细胞不可恢复的损伤，不利于后续试验研究；若存活率过高，说明细胞的长势较好，细胞的活力也较好，氧化后不会造成明显的损伤，也不利于后续试验的开展[11]。金鹿等[12]研究指出，BMEC存活率降低到70%~80%为宜。在本研究条件下，1 000μmol/L组作用6 h不仅引起了细胞抗氧化能力的显著降低与炎症因子含量的显著升高，又使细胞存活率保持在70%~80%。
综上所述，以1 000μmol/L的DETA/NO作为刺激源，作用细胞6 h，引起BMEC氧化损伤，这可以作为建立BMEC氧化损伤模型的适宜条件。
4 结论①细胞存活率、抗氧化指标及炎症因子含量都可以作为判别BMEC是否发生氧化应激的重要指标。
②经1 000μmol/L的DETA/NO处理细胞6 h后，SOD、CAT、GPx活性均显著降低，MDA、炎症因子及NO含量，iNOS活性均显著上升，使BMEC产生明显的氧化应激。以DETA/NO为应激源，作用浓度为1 000μmol/L作用时间为6 h，可以作为建立BMEC氧化损伤模型的适宜条件。
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