规模化养殖中蛋鸡一般在70周龄时产蛋率下降，卵巢机能开始衰退^[1]。蛋鸡卵巢机能衰退不仅缩短产蛋周期，降低经济利益，也易引起卵巢炎，并由此导致沙壳蛋、软壳蛋等次蛋率增加；同时还易使蛋品因卵巢感染炎症而携带致病菌等，影响蛋品品质。蛋鸡卵巢机能的衰退与卵泡发育数量减少和闭锁卵泡数量增多有关，而黄体生成素(luteinizing hormone，LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)及卵巢分泌的孕酮(progesterone, P4)和雌二醇(estradiol，E2)等是蛋鸡维持生殖活动的基本要素^[2]。大豆异黄酮是一种健康安全的植物雌激素，研究证明，其可提高蛋鸡产蛋率，增强机体免疫力，降低鸡蛋和鸡肉胆固醇含量，提高动物抗氧化能力等^[2-5]。孟婷等^[6-7]研究证明，饲粮中添加大豆异黄酮可调控血液三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸和E2等激素水平，从而提高产蛋率；周振雷等^[8]研究表明，大豆黄酮可提高产蛋后期蛋鸡的生产性能，改善骨代谢，调控通过受垂体分泌的LH、FSH、P4和E2等生殖激素。卵巢是蛋鸡生殖过程、卵泡形成和发育以及蛋形成的关键部位，但目前关于大豆异黄酮对产蛋后期蛋鸡卵巢机能和卵泡发育的影响未有研究。因此，本研究通过研究大豆异黄酮对产蛋后期蛋鸡生殖激素分泌和卵泡发育的影响，初步探讨大豆异黄酮对产蛋后期蛋鸡卵巢机能的作用，为延长产蛋周期或提高蛋品质提供生产依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计

选70周龄海兰褐蛋鸡450只，随机分为3组，每组5个重复，每重复30只鸡。对照组饲喂基础饲粮，基础饲粮为参照NRC(1994)营养需要配制的粉状配合饲粮，其组成及营养水平见表 1。试验组分别在基础饲粮中添加10或15 mg/kg大豆异黄酮。

试验预试期7 d，饲喂基础饲粮，期间对照组和试验组的产蛋率和蛋均重均无显著差异(P>0.05，表 2)；正试期28 d。试验蛋鸡舍为普通规模化蛋鸡舍(窗式)，鸡舍内为3层笼养，每笼3只鸡。鸡舍室温控制在约22℃，自动控制光照，总光照时间每天保持16 h。鸡只自由采食、饮水，每天08:00和20:00分别饲喂。

1.2 试验材料

试验所用大豆异黄酮由四川新一美生物科技有限公司提供，纯度为95%。

1.3 指标测定 1.3.1 生产性能和蛋品质测定

每天记录每组采食量、产蛋数、破蛋数和鸡只死亡数等日常情况。取试验期第26~28天所产鸡蛋测定蛋均重、蛋壳重、蛋壳色泽、蛋黄色泽、蛋壳强度和哈夫单位等指标。所用仪器为Egg Force Reader和Egg Analyzer，均来自Orka Food Technology Ltd.(香港)。

1.3.2 卵巢切片的制作及苏木精-伊红染色

于试验第28天，每重复取3只鸡屠宰，取血后摘取卵巢，置于提前放入人抗角蛋白丝聚集素抗体(AFA)缓冲液的10 mL离心管中，待制组织切片。将卵巢迅速放到配制好的Davidson’s AFA固定液(95%乙醇330 mL、福尔马林220 mL、冰醋酸115 mL、蒸馏水335 mL，溶液总体积为1 000 mL)中，固定24 h，中途更换1次固定液。用自来水冲洗干净，放入Leica ASP200S全自动组织脱水机中脱水和透明→取出后石蜡包埋→切片(每隔180μm切1张厚度为6μm的切片)→贴片→60℃烘箱烘36 h后染色→二甲苯脱蜡10 min→100%、95%、80%、70%各级酒精脱水各2 min→蒸馏水冲洗→苏木精染色10 min→自来水冲洗→1%盐酸溶液分色→自来水蓝化40 min→蒸馏水冲洗→70%、80%、95%酒精依次脱水各2 min→95%醇溶伊红染色1 min→95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ冲洗伊红并酒精脱水各2 min→晾干，待酒精挥发后→二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明10 min→中性树脂封片。

光镜下观察切片，记录卵巢切片上正常和闭锁的初级卵泡、次级卵泡数量，并计算次级卵泡闭锁率。各级卵泡的判定标准：初级卵泡颗粒细胞为单层，次级卵泡颗粒细胞为多层，闭锁卵泡膜细胞层显著增厚，颗粒细胞层着色较深，呈现绒毛样褶皱突起，细胞内核固缩现象明显，颗粒层褶皱突起的多少和核固缩现象与闭锁程度呈正相关^[9-10]。

1.3.3 激素测定

于试验第28天每个重复中随机取3只鸡，颈静脉放血致死，收集血液，于2 500 r/min下离心，取血清待测相关激素指标。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中卵黄蛋白原(vitellogenin, VTG)分泌量，所用试剂盒为ADL公司提供的VTG双抗体夹心(Rat Anti-chicken VTG)ELISA试剂盒，测定程序按试剂盒说明书进行；血清中LH、生长激素(growth hormone，GH)、FSH分泌量采用ELISA法，试剂盒由上海天根生化科技有限公司提供，所用酶标仪为Thermo Labsystems Multiskan MK3全自动酶标仪(日本)。采用放射免疫法，并用上海核所日环光电仪器有限公司生产的Sn-69513型免疫计数器测定血清中E2、P4和β-内啡肽(β-endorphin, EP)分泌量，分析步骤依照放射性免疫试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免研究所，北京)说明书操作。

1.3.4 氧化指标

于试验第28天每个重复中随机取3只鸡，颈静脉放血后，离心血清与血浆，摘取肝脏和卵巢，测定血浆、肝脏和卵巢中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力，方法为黄嘌呤氧化酶法，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 数据统计分析

采用SAS 9.0进行单因素方差分析，Duncan氏法进行多重比较。各组数据均以平均值±标准差表示，P < 0.05、P < 0.01分别为差异显著和极显著。

2 结果与分析 2.1 大豆异黄酮对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响

由表 2可见，饲粮添加大豆异黄酮可显著提高蛋鸡产蛋率、蛋壳色泽、蛋壳重和哈夫单位(P < 0.05)，但对蛋均重、蛋黄色泽、蛋黄重和蛋壳强度影响不显著(P>0.05)。

2.2 大豆异黄酮对蛋鸡相关生殖激素的影响

由表 3可见，饲粮添加大豆异黄酮对蛋鸡血清中LH、GH、FSH和P4分泌量影响不显著(P>0.05)，但显著或极显著提高EP(P＜0.05)、VTG(P＜0.05)和E2(P＜0.01)的分泌量。

2.3 大豆异黄酮对蛋鸡卵泡发育的影响

由表 4可见，饲粮添加大豆异黄酮显著或极显著提高等级卵泡(P < 0.05)、小黄卵泡(P < 0.05)、大白卵泡(P < 0.01)和初级卵泡(P < 0.01)数量，同时显著降低了小黄卵泡、大白卵泡和次级卵泡的闭锁率(P < 0.05)。与对照组相比，10 mg/kg大豆异黄酮添加组对等级卵泡、小黄卵泡、大白卵泡数量以及各级卵泡的闭锁率影响不显著(P>0.05)，但15 mg/kg大豆异黄酮添加组显著提高各卵泡数量(P < 0.05)，且极显著提高大白卵泡和初级卵泡数量(P < 0.01)，同时极显著降低小黄卵泡、大白卵泡、次级卵泡的闭锁率(P < 0.01)。

2.4 大豆异黄酮对蛋鸡SOD活力的影响

由表 5可见，饲粮添加大豆异黄酮显著提高蛋鸡血浆、肝脏和卵巢SOD活力(P < 0.05)。与对照组相比，15 mg/kg大豆异黄酮添加组显著提高蛋鸡肝脏SOD活力(P < 0.05)，极显著提高卵巢SOD活力(P < 0.01)，但10 mg/kg大豆异黄酮添加组对上述指标影响则不显著(P>0.05)。

3 讨论

卵巢健康程度是决定蛋鸡产蛋周期和蛋品品质的重要指标之一，鸡体内生殖激素的分泌和卵泡的发育以及闭锁率是衡量蛋鸡卵巢健康状态的重要指标。卵泡根据形态和发育时间可分为：原始卵泡、小白卵泡、大白卵泡、小黄卵泡以及等级卵泡^[11]。颗粒细胞在卵泡的生长发育过程中发挥重要作用，其增殖、分化和凋亡直接决定了卵泡的生长、选择和闭锁^[12]，而颗粒细胞的发育又与其处于不同阶段时垂体分泌的FSH、LH和卵巢分泌的E2、P4等生殖激素相关^[13]。蛋鸡卵巢机能的衰退时表现为：不同发育阶段的卵泡数量减少，闭锁卵泡数量增多，卵泡闭锁主要发生在初级原始卵泡、大白卵泡和小黄卵泡阶段^[14]。

大豆异黄酮具有微弱的雌激素活性，可与下丘脑、垂体等的E2受体协同作用，促进垂体GH生成和释放增加，刺激肝脏GH受体发育和胰岛素样生长因子的生成，促进机体营养物的代谢和利用，显著提高家禽生产性能^{[3, 15-16]}。本研究证明，饲粮中添加10或15 mg/kg大豆异黄酮，显著提高了产蛋率，且不同程度地提高了蛋均重，这与周振雷等^[8]、孟婷等^[17-18]、左伟勇等^[19]以及顾欢等^[20]的试验结果一致。通过测定与生殖激素相关的指标发现，大豆异黄酮组对LH、GH、FSH和P4的分泌量无显著影响，但显著或极显著提高了EP、VTG和E2这3种激素的分泌量。同时，大豆异黄酮显著提高初级卵泡数量，且添加量为15 mg/kg组较10 mg/kg组的影响更显著；而对等级卵泡、小黄卵泡和大白卵泡数量的影响，添加量为10 mg/kg时无显著影响，添加量为15 mg/kg时显著提高。与此相对应，添加量为15 mg/kg时极显著降低小黄卵泡、大白卵泡、次级卵泡的闭锁率，但添加量为10 mg/kg时对各级卵泡的闭锁率影响不显著。以上结果表明：大豆异黄酮促进了产蛋后期蛋鸡各级卵泡数目的增加和发育，但其作用原理并非由于大豆异黄酮促进了LH、FSH、P4等生殖激素的分泌而增加，而是通过提高E2、EP和VTG的分泌而增多的。

家禽的生殖活动主要受下丘脑-垂体-性腺构成的生殖轴调控，这种调控通过下丘脑分泌的促性腺激素释放激素、垂体分泌的LH和FSH及卵巢分泌的P4和E2共同起作用^[3]。大豆异黄酮可能首先直接影响性腺轴E2的分泌，进而影响P4的分泌，并通过负反馈调节刺激FSH和LH释放阿片类物质参与下丘脑-垂体-性腺轴的调控，EP就是其中的一种阿片肽，它对蛋鸡生殖内分泌的调节既可通过下丘脑和脑垂体直接作用，也可通过作用于卵巢和子宫等而产生^[21]。这与刘红云等^[22]的研究结果类似，该研究证明：高剂量大豆异黄酮明显干扰下丘脑-垂体-性腺轴的内分泌机能，主要表现为抑制下丘脑的促性腺激素释放激素，加强下丘脑EP的合成和释放，而EP能以一种旁分泌方式阻止卵巢颗粒细胞分泌过多的P4。这表明，EP发挥作用可以不通过下丘脑和脑垂体中枢的调节，而是直接作用于卵巢上。本试验结果中大豆异黄酮对LH和P4的分泌没有显著影响，但却提高了E2和EP的分泌水平，且最终增加了各级卵泡数量的结果也与此推断相吻合。该理论还可从大豆异黄酮对VTG的增加效果得以推断。VTG是最重要的卵黄前体物质之一，是蛋黄蛋白的主要来源，仅在激素的严格控制下才可诱导产生的。在E2的作用下蛋鸡在肝中可合成VTG，并通过血液运输到卵巢，经修饰后以卵黄蛋白形式储存于卵母细胞中，为卵黄的发育提供能量^[23]。

此外，大豆异黄酮对生殖激素分泌的影响及卵泡数目的作用受添加剂量的影响。本试验饲粮中添加10 mg/kg大豆异黄酮时，VTG分泌量与未添加组差异并不显著，所以，各级卵泡数目也无显著差异。这可能与大豆异黄酮仅具有微弱的雌激素活性有关，其作用效果与时效和蛋鸡所处的阶段有关，所以其作用大小可能受剂量的影响。孟婷^[6]的研究证明，在初产蛋鸡大豆异黄酮添加3或6 mg/kg即可提高蛋鸡的生产性能；而卢建等^[24]对45~58周龄如皋黄鸡的研究证明，大豆异黄酮并未提高排卵前卵泡指数，但可提高受精蛋孵化率。本研究中的试验蛋鸡是处于产蛋高峰期后的产蛋率下降期，蛋鸡卵巢机能衰老，因而可能需要更大剂量的添加才可对其卵巢机能产生作用。

氧化应激是蛋鸡卵巢机能衰退的主要诱因^[25-26]。本研究显示，与氧化性相关的SOD活力在各部位都所有提高，表明大豆异黄酮对蛋鸡抗氧化性的提高。SOD活力提高，蛋鸡氧化应激降低，从而卵巢机能得以改善，这与生殖激素E2、EP和VTG的变化趋势结果一致，同时也从抗氧化性证明了大豆异黄酮对卵巢机能的改善作用。这与其他关于大豆异黄酮对蛋鸡抗氧化性的研究结果一致^[27-29]。

4 结论

①饲粮添加大豆异黄酮显著提高了产蛋率，改善了产蛋后期卵巢的机能，增加了卵泡的发育和成活量。其作用原理可能为提高了生殖激素E2和EP的水平，这2种激素直接作用于卵巢，提高了VTG的贮备量，为促进卵泡数目的增加奠定了能量基础。

②不同剂量大豆异黄酮作用效果不一样，本研究中以15 mg/kg效果优于10 mg/kg。