多糖是构成生命的四大物质之一，广泛存在于植物、动物和微生物中，具有免疫调节、抗氧化、降血脂、抗菌、抗病毒等多种生物学功能[1-7]，其作为一种绿色环保的新型饲料添加剂越来越受到人们的重视。苜蓿多糖是从苜蓿茎、叶中提取的水溶性杂多糖，属非淀粉多糖，浅黄色粉末，不含鞣质和淀粉，为酸性多糖[8]。经毛细管电泳法检测，苜蓿多糖主要含木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸[9]，是苜蓿的主要生物活性物质之一。已有研究表明，在饲粮中添加一定剂量的苜蓿多糖可以促进动物生长[10]、改善肉品质[11]、提高动物机体免疫力[12-13]、降脂[14]、抗氧化[15]、调节肠道微生物区系、促进有益菌的增殖[16]等。虽然苜蓿多糖对动物生产性能的影响已有相关报道，但是由于苜蓿多糖的提取工艺各异、纯度差异较大，其在畜禽饲粮中的适宜添加量也不尽相同。欧阳克蕙等[11]和刘大林等[17]研究发现饲粮中添加1%的苜蓿多糖效果最佳，能显著提高肉仔鸡的体重和日增重，显著降低料重比。然而刘晴雪等[18]研究表明肉仔鸡饲粮中添加200或500 mg/kg苜蓿多糖可达到较好的促生长及免疫效果。加之国内外关于苜蓿多糖对产蛋鸡生产性能和蛋品质影响的研究未见报道。因此，本研究以海兰褐产蛋鸡为研究对象，通过在玉米-豆粕型基础饲粮中添加不同水平的苜蓿粗多糖，研究其对产蛋鸡生产性能和蛋品质的影响，同时拟找出最适宜的添加水平，为苜蓿粗多糖在蛋鸡生产中的合理应用，进一步开发新型绿色饲料添加剂提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所用苜蓿粗多糖采用水提、醇沉、脱蛋白法提取得到。以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测得样品中多糖含量为24.28%；以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测得样品中黄酮含量为2.90%；以齐墩果酸为标准品，采用5%香草醛-冰醋酸显色法测得样品中皂苷含量为3.47%；按照《GB/T 6432—94饲料中粗蛋白质的测定方法》测得样品中粗蛋白质含量为15.55%；按照《GB/T 6438—2007饲料中粗灰分的测定方法》测得样品中粗灰分含量为24.35%。
1.2 试验动物及基础饲粮试验动物选用540只27周龄海兰褐产蛋鸡。试验基础饲粮以玉米、豆粕为主要原料，参考NRC(1994)推荐的蛋鸡营养需要量确定营养水平，基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
采用单因子完全随机试验设计，选用27周龄体重为(1.63±0.10) kg，产蛋率相近、健康的540只海兰褐蛋鸡，随机分为6组，每组6个重复，每个重复15只鸡。对照组饲喂基础饲粮；试验组分别饲喂在基础饲粮中添加250、500、1 000、2 000和4 000 mg/kg苜蓿粗多糖的试验饲粮。试验期为24周。在试验第6周，肌肉注射0.5 mL新城疫-禽流感二联灭活疫苗进行免疫。
饲养试验在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平畜禽试验基地进行，采用3层层叠式笼养，每笼3只鸡，每日喂料3次，自由采食和饮水。采用自然加人工补光，恒定光照时间为16 h(鸡舍照明控制器)，自动控温、供暖、通风，每天记录舍内温度、湿度，观察鸡只健康状况，并随时记录病死鸡。每隔1 d清粪1次，保持舍内清洁卫生。
1.4 测定指标 1.4.1 生产性能试验期间，以重复为单位记录每天产蛋数、蛋重、破软蛋及畸形蛋数，记录病死鸡只，称重并解剖拍照，分析死因；每周结料1次，记录各重复的耗料量，计算出每8周及全期的产蛋率、平均蛋重、采食量、料蛋比和总产蛋重量。
1.4.2 蛋品质于试验开始及第1、3、5、6、7、8、9、10、12、16、20和24周末，采集当天所产鸡蛋，12 h内测定蛋品质。采用蛋壳颜色测定仪(QCR，TSS公司，英国)测定蛋壳颜色；采用蛋壳强度测定仪(Model-Ⅲ，Robotmation公司，日本)测定蛋壳强度；采用蛋壳厚度测定仪(Model P-1，Ozaki MFG公司，日本)测定蛋壳厚度；采用蛋品质测定仪(EMT-2 500，Robotmation公司，日本)测定蛋白高度、哈夫单位和蛋黄颜色；采用卵形系数测定器(NFN384，FHK公司，日本)测定蛋形指数。
1.5 数据处理与分析试验数据用Excel 2010进行处理，采用SAS 9.2软件ANOVA程序进行方差分析，用Duncan氏法进行组间多重比较，以P < 0.05为差异显著水平。试验结果以“平均值±标准差”来表示，其中产蛋率经反正弦转换后进行方差分析。
2 结果 2.1 苜蓿粗多糖对蛋鸡生产性能的影响由表 2可知，饲粮中添加苜蓿粗多糖能提高蛋鸡产蛋率。与对照组相比，试验1~8周，饲粮中添加500、2 000和4 000 mg/kg苜蓿粗多糖显著提高了产蛋率(P < 0.05)；试验9~16周、17~24周和1~24周，饲粮中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖均显著提高了产蛋率(P < 0.05)；试验1~24周，250、500、1 000、2 000和4 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组产蛋率较对照组分别提高了5.72%、7.55%、4.22%、6.90%和3.30%。就各苜蓿粗多糖添加组而言，500 mg/kg苜蓿粗多糖添加组在试验9~16周和1~24周产蛋率显著高于4 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组(P < 0.05)，试验17~24周250、500和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组产蛋率均显著高于4 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组(P < 0.05)，且3组之间无显著差异(P>0.05)。
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表 2 苜蓿粗多糖对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of crude polysaccharides isolated from alfalfa on performance of laying hens (n=6) |
与对照组相比，试验9~16周、17~24周和1~24周，饲粮中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖显著降低了料蛋比(P < 0.05)。试验17~24周，250、500和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组料蛋比均显著低于4 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组(P < 0.05)；其余各阶段各个苜蓿粗多糖添加组间均无显著差异(P>0.05)。
各阶段各个苜蓿粗多糖添加组的总产蛋重量均高于对照组。与对照组相比，试验17~24周和1~24周，饲粮中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖均显著提高了总产蛋重量(P < 0.05)。试验17~24周，250和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组总产蛋重量显著高于4 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组(P < 0.05)。
与对照组相比，饲粮中添加苜蓿粗多糖对蛋鸡平均蛋重、采食量无显著影响(P>0.05)，且仅在试验17~24周，500 mg/kg苜蓿粗多糖添加组平均蛋重较对照组低2.10%(P < 0.05)。
2.2 苜蓿粗多糖对蛋鸡蛋品质的影响 2.2.1 苜蓿粗多糖对蛋壳颜色的影响由表 3可知，与对照组相比，试验第6、16和20周，饲粮中添加250、500、1 000 mg/kg苜蓿粗多糖显著加深了蛋壳颜色(P < 0.05)；试验第8、12、24周饲粮中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖显著加深了蛋壳颜色(P < 0.05)。250、500和1 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组在试验第8、12和16周蛋壳颜色显著深于4 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组(P < 0.05)。
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表 3 苜蓿粗多糖对蛋鸡蛋壳颜色的影响 Table 3 Effects of crude polysaccharides isolated from alfalfa on shell color of laying hens (n=6) |
由表 4可知，与对照组相比，试验第6周，饲粮中添加250、500、1 000、2 000和4 000 mg/kg苜蓿粗多糖显著提高了蛋壳强度(P < 0.05)；试验第20周，饲粮中添加500和2 000 mg/kg的苜蓿粗多糖显著提高了蛋壳强度(P < 0.05)；试验第24周，饲粮中添加2 000 mg/kg的苜蓿粗多糖显著提高了蛋壳强度(P < 0.05)。
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表 4 苜蓿粗多糖对蛋鸡蛋壳强度的影响 Table 4 Effects of crude polysaccharides isolated from alfalfa on shell strength of laying hens (n=6) |
由表 5可知，随着饲喂时间的延长，对照组和各个苜蓿粗多糖添加组的蛋壳厚度均不同程度增加。与对照组相比，试验第7、8、12、16、20和24周饲粮中添加250 mg/kg苜蓿粗多糖，试验第8、12、16、20和24周饲粮中添加500 mg/kg苜蓿粗多糖，试验第7、8、12、16、20和24周饲粮中添加1 000和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖及试验第8、20、24周饲粮中添加4 000 mg/kg苜蓿粗多糖均显著增加了蛋壳厚度(P < 0.05)；且试验第12周500 mg/kg苜蓿粗多糖添加组的蛋壳厚度显著高于4 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组(P < 0.05)。
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表 5 苜蓿粗多糖对蛋鸡蛋壳厚度的影响 Table 5 Effects of crude polysaccharides isolated from alfalfa on shell thickness of laying hens (n=6) |
由表 6可知，与对照组相比，试验第10、12和24周饲粮中添加2 000 mg/kg苜蓿粗多糖显著提高了蛋白高度(P < 0.05)；试验第10周饲粮中添加500 mg/kg苜蓿粗多糖，试验第12周饲粮中添加250和1 000 mg/kg苜蓿粗多糖及试验第24周饲粮中添加4 000 mg/kg苜蓿粗多糖均显著提高了蛋白高度(P < 0.05)。各苜蓿粗多糖添加组间，试验第7、10、12周2 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组蛋白高度显著高于1 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组(P < 0.05)。
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表 6 苜蓿粗多糖对蛋鸡蛋白高度的影响 Table 6 Effects of crude polysaccharides isolated from alfalfa on albumen height of laying hens (n=6) |
由表 7可知，与对照组相比，试验第10、12、24周饲粮中添加2 000 mg/kg苜蓿粗多糖，试验第12周饲粮中添加1 000、4 000 mg/kg苜蓿粗多糖及试验第24周饲粮中添加4 000 mg/kg显著提高了哈夫单位(P < 0.05)；而试验第7周1 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组哈夫单位显著低于对照组(P < 0.05)。各苜蓿粗多糖添加组间，试验第10、12、24周饲粮中添加2 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组，试验第10周500 mg/kg苜蓿粗多糖添加组及试验第24周4 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组哈夫单位均显著高于250 mg/kg苜蓿粗多糖添加组(P < 0.05)；其余各组间无显著差异(P>0.05)。
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表 7 苜蓿粗多糖对蛋鸡哈夫单位的影响 Table 7 Effects of crude polysaccharides isolated from alfalfa on haugh unit of laying hens (n=6) |
此外，蛋形指数和蛋黄颜色测定结果显示各组间无显著差异(P>0.05)，数据未附于本文。
3 讨论 3.1 苜蓿粗多糖对蛋鸡生产性能的影响苜蓿多糖对蛋鸡生产性能的影响研究目前未见报道。本试验结果中，试验1~8周，饲粮中添加500、2 000和4 000 mg/kg苜蓿粗多糖均显著提高了产蛋率；添加250、500、1 000和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖在试验9~16周、17~24周和1~24周均显著提高了产蛋率。产蛋是禽类在神经内分泌系统调节下的复杂生理过程，蛋鸡卵泡发育、排卵及蛋形成过程均与生殖激素有关，蛋鸡卵泡的生长发育主要受垂体促性腺激素卵泡刺激素和黄体生成素的控制，还受其自身卵巢激素的(雌激素、雄激素和孕酮)的调控[19]。因此，饲粮中添加适量的苜蓿粗多糖提高蛋鸡产蛋率可能是由于苜蓿多糖调节生殖激素水平，改善母鸡的卵巢功能，促进卵泡发育与排卵[20-21]，从而提高蛋鸡产蛋率。
已有研究表明，植物多糖能够通过增强机体免疫力[22-23]、抗氧化[24]、抗炎[25-26]、抗感染[27-28]，促进肠道有益微生物乳酸杆菌、双歧杆菌的增殖[29]，并促进粗蛋白质代谢率、加快蛋白质的合成[30]及减少动物应激反应[31]等，最终影响动物机体的生长发育、生产性能及畜产品品质。本试验结果中，饲粮中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖在试验9~16周、17~24周和1~24周均显著降低了料蛋比，在试验17~24周和1~24周，显著提高了总产蛋重量，对采食量无显著影响。植物多糖改善动物生产性能的作用在很多研究中也已得到了证实。Han等[32]研究表明，饲粮中添加刺五加多糖能够显著提高脂多糖应激下断奶仔猪日增重和平均日采食量，且通过调节仔猪肝脏中促炎性细胞因子的释放，从而改善仔猪的生产性能。左兆云[33]研究表明，饲粮中添加黄芪多糖可提高蛋鸡总产蛋量，提高血清及蛋黄抗氧化能力，降低蛋黄胆固醇浓度。Yuan等[34]研究表明，饲粮中添加黄芪多糖能显著提高断奶仔猪的平均日采食量，白细胞、淋巴细胞数量，CD4+淋巴细胞比率及血清中白细胞介素-2的含量，主要通过细胞免疫增强机体免疫力，提高生产性能。
Liu等[35]对热应激状态下的新西兰雄兔研究表明，饲粮中添加0.5%苜蓿多糖能够显著提高试验1~21 d平均日采食量、平均日增重，降低饲料转化率。欧阳克蕙等[11]研究表明，饲粮中添加1.0%和1.5%的水溶性苜蓿多糖，均能够显著增加肉仔鸡的平均体重、平均日增重，降低料重比，且1.0%添加组的效果要优于1.5%添加组。张慧辉[12]研究表明在肉仔鸡饲粮中添加1%苜蓿多糖能提高生长性能，而添加剂量增加到8%可抑制动物机体的生长。刘晴雪等[18]研究报道，饲粮中添加200或500 mg/kg苜蓿多糖能够显著提高肉仔鸡的平均采食量、平均体重和日增重，显著降低料重比。江振莹等[36]研究表明，肉仔鸡早期饲粮中添加苜蓿多糖对生产性能无显著影响。而本试验结果中，饲粮中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖对蛋鸡产蛋率、料蛋比和总产蛋重量有影响，与前述研究结果不尽一致。这可能与苜蓿多糖的来源、提取工艺、纯度及动物种类、动物的年龄及饲养环境有关。
张慧辉[12]研究表明在肉仔鸡饲粮中添加1%苜蓿多糖能提高生产性能，而添加剂量增加到8%可抑制动物机体的生长。本试验结果中，试验9~16周、17~24周和1~24周4 000 mg/kg苜蓿粗多糖组的产蛋率、总产蛋量均低于其余各苜蓿粗多糖添加组，而料蛋比高于其余各苜蓿粗多糖添加组。这可能是由于苜蓿粗多糖中的半乳糖醛酸等物质作为一种非淀粉多糖，具有抗营养作用，过高的添加水平对蛋鸡的生产性能产生了负面影响。
3.2 苜蓿粗多糖对蛋鸡蛋品质的影响蛋壳颜色通常被消费者作为一种衡量蛋品质量的指标。蛋壳颜色是子宫中腺体分泌和色素沉积的结果。褐壳蛋蛋壳中的色素主要是原卟啉-Ⅸ，来源于血红蛋白的分解物，即与衰老、受损及形态异常的红细胞的破坏有关。当红细胞在肝、脾和其他部分的网状内皮系统被吞噬破坏后，释放出血红蛋白，并很快被分解为珠蛋白、胆绿素和铁。只有胆绿素被还原为胆红素，经血液转运至肝脏后生成葡萄糖醛酸胆红素，随胆汁排入十二指肠，其中一小部分在十二指肠重新吸收，经血液运送入肝或转运至输卵管等部分，作为合成蛋壳色素的原料[37]。而后，再经子宫腺体细胞内多种酶的作用，上皮细胞开始合成并积累色素。已有的研究表明，胆绿素具有较强的抗氧化性，其能清除机体产生的自由基[38]，而苜蓿多糖亦具有抗氧化作用。本试验结果中，试验第6、8、12、16、20和24周饲粮中添加250、500和1 000 mg/kg苜蓿粗多糖显著加深了蛋壳颜色，且2 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组在试验第8、12和24周显著提高了蛋壳颜色。这可能与饲粮中添加苜蓿粗多糖后使机体因清除自由基所消耗的胆绿素减少，合成蛋壳色素的原料增多，从而调节蛋壳色素的沉积有关。
王翠菊等[39]研究表明，蛋鸡饲粮中添加150~250 mg/kg黄芪多糖能够增强蛋壳厚度。而本试验结果中，试验第6、20和24周，饲粮中添加2 000 mg/kg的苜蓿粗多糖显著提高了蛋壳强度；试验第8、12、16、20和24周饲粮中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖亦显著增加了蛋壳厚度。已有研究表明，植物多糖能够促进细胞外钙离子的内流和细胞内释放钙离子来影响胞浆内钙离子浓度[40]及增强肠道功能[41-42]。因此我们可以推测苜蓿粗多糖可能主要通过以下2个方面影响蛋壳质量。一方面，苜蓿粗多糖可能是通过调节钙离子浓度，使得形成蛋壳的钙源增加，有利用钙的沉积，从而增强蛋壳质量；另一方面可能是由于饲粮中添加苜蓿粗多糖有利于改善肠道环境和功能，促进肠道钙离子的吸收，从而增强蛋壳质量。但其具体的作用机制有待进一步研究。
蛋白质和哈夫单位是鸡蛋新鲜程度的重要指标。蛋白高度越高，哈夫单位越高，蛋白质越黏稠，蛋白质品质越好[43]。本试验结果中，试验第10、12、24周饲粮中添加2 000 mg/kg的苜蓿粗多糖均显著提高了蛋白高度和哈夫单位。这可能是由于苜蓿粗多糖增强了鸡蛋蛋白质代谢，从而使蛋白高度和哈夫单位提高，但作用机理还有待进一步研究。
4 结论①产蛋期蛋鸡饲粮中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖均能提高蛋鸡产蛋率、总产蛋重量，降低料蛋比。
②产蛋期饲粮中添加250、500和1 000 mg/kg苜蓿粗多糖显著增加了蛋壳颜色；饲粮中添加250、500、1 000和2 000 mg/kg苜蓿粗多糖显著提高了蛋壳强度和蛋壳厚度；且2 000 mg/kg苜蓿粗多糖添加组的蛋白高度和哈夫单位较好。
③综上，产蛋鸡饲粮中推荐添加250 mg/kg苜蓿粗多糖，即可达到较好的效果。
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