乳酸菌具有调节机体胃肠道微生态平衡、有益于畜禽健康、改善畜禽生产性能、减少环境污染、替代饲用抗生素等重要作用，在动物生产中的应用日益广泛。然而，乳酸杆菌为厌氧菌，抗逆性差、不耐氧、易失活，应用效果不稳定，而球菌较杆菌具有更强的抗逆性，菌株活性损失较低，未来球菌尤其是肠球菌的应用将更普遍。

γ-氨基丁酸(GABA)又称氨酪酸^[1]，分子式为C₄H₉NO₂，是哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，介导40%以上的抑制性神经传导^[2-3]。GABA对人具有调节血压、改善脑部机能、增强记忆力、抗焦虑、镇痛等生理活性，对畜禽具有促进采食、抗应激、镇静、改善生产性能等功效^[4]，尤其是抗热应激作用显著。GABA合成制备的方法主要有化学合成、微生物发酵等，目前畜禽生产上应用的GABA多为化学合成提纯品，成本昂贵，颇少见应用微生物发酵产生的GABA^[5]。

长期以来，学者致力于研究乳酸菌等单一功能的微生态制剂与化学合成提纯的GABA，已清楚乳酸菌和GABA均是重要的功能性添加剂^[6]。但有关能分泌GABA的乳酸菌的研究较少。屎肠球菌(Enterococcus faecium)属肠球菌属，又称屎链球菌，可分成许多群，屎肠球菌属于D群，D群链球菌中的肠球菌包括粪肠球菌、屎肠球菌和坚忍肠球菌。自然界存在的肠球菌所能分泌的GABA量很少或不能分泌，需要摸索适宜生长条件以提高其GABA产量，目前对产GABA屎肠球菌的研究颇少。为此，本试验开展高产GABA屎肠球菌的筛选与鉴定，既能应用绿色微生态和微生物发酵所产天然GABA，降低GABA添加成本，又能叠加发挥GABA抗应激与乳酸菌微生态平衡调控的双重功效，旨在为开发功能性微生态制剂及其在养殖中的应用提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 菌株及培养基

菌株来自泡菜(购自农贸市场)、酸奶(蚌埠市双华乳品有限公司产品)、土壤(取自安徽科技学院西校区)、新鲜牛奶(购自安徽科技学校畜牧科技园)。

MRS固体培养基制备^[7]：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖20 g、三水合醋酸钠5 g、柠檬酸二胺2 g、吐温80.1 g、磷酸氢二钾2 g、七水硫酸镁0.58 g、四水硫酸锰0.25 g、碳酸钙7.5 g、琼脂22.5 g，用去离子水定容至1 000 mL，pH 6.5，121℃灭菌40 min。

MRS液体培养基：除不含碳酸钙、琼脂外，其他成分与MRS固体培养基相同，再用蒸馏水定容至1 000 mL，pH 6.5。

分离培养基：牛肉膏10 g、酵母膏10 g、蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、吐温80.5 g、番茄汁200 g、溴甲酚绿0.1 g、碳酸钙20 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 6.5。

1.2 目的菌株的分离、纯培养与活化传代

取泡菜、酸奶、土壤、新鲜牛奶样品各1 g，分别接种于装有MRS液体培养基的150 mL三角烧瓶中，35℃静止培养48 h；无菌操作将培养液接种于分离培养基中，35℃条件下静止培养48 h；无菌操作挑取分离培养基中周围呈现黄色的疑似单个菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃静止培养48 h。

取1 mL MRS液体培养液与无菌生理盐水10倍梯度稀释成10^-6、10^-7、10^-8 3个浓度梯度，取100μL 10^-8浓度梯度溶液均匀涂布MRS固体培养基平板，37℃培养48 h。无菌操作挑取出现圆形乳白色并有溶钙圈的单个菌落，进行分离纯化。

将所筛菌株接种于MRS斜面培养基上，35℃培养48 h，4℃保存，菌株每20 d传代1次。将保藏菌株接种于MRS固体培养基中，35℃培养48 h，再转接至MRS液体培养基中培养22 h用作发酵种子菌株。

1.3 目的菌株的革兰氏染色鉴定

对目的菌株进行革兰氏染色，观察菌株的形态特征。

1.4 目的菌株的分子生物学鉴定

取10 mL菌株培养液，低速离心获得菌体。用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302，上海生工生物工程有限公司)提取细菌总DNA。以10 ng纯化的细菌总DNA作为模板，扩增16S rDNA基因。所用引物为原核生物16S rDNA基因的通用引物：上游引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物为5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增体系为50μL，包括：1.0μL DNA模板，5.0μL 10×Buffer，2.0μL dNTP，1.0μL上游引物(10 pmol/μL)，1.0μL下游引物(10 pmol/μL)，1.0μL Taq DNA聚合酶，1.4μL Mg²⁺，补重蒸水(ddH₂O)至50μL。扩增条件：94℃，5 min；94℃，1 min，56℃，1 min，72℃，2 min，30个循环；72℃延伸5 min，4℃终止反应。PCR产物全序列由上海生工生物工程有限公司测定。

1.5 序列分析及系统发育树的构建

根据16S rDNA基因测序结果，使用核算序列对比检索(nucleotide basic local alignment search tool，N-BLAST)比对初步确定菌种。结合GenBank中乳酸菌属(Lactobacillus)中其他菌种的16S rDNA基因序列，利用MEGA 3.0软件绘制系统发育树。

1.6 目的菌株所产GABA的定性测定

将上述所得种子液以3.5%接种量无菌操作接种于发酵培养基中，37℃恒温培养48 h，取发酵液5 mL，4 500 r/min离心5 min，取上清采用改良纸层析法检测发酵液中是否含有GABA。改良纸层析的测定方法是：按0.55%的比例将显色剂茚三酮加入展开剂中，展开剂组成为正丁醇:冰醋酸:水=5 : 3 : 1(体积比)，取待测液10μL进行点样，GABA配成浓度5 g/L做参比，展开后85℃显色8 min。若纸层析反应体系中存在与GABA标准品相对迁移率一致的茚三酮显色斑点，说明样品中含有GABA，则该菌即为筛选到的产GABA的菌株，将筛选得到的产GABA目的菌株进行保藏。

1.7 目的菌株所产GABA的定量测定

高效液相色谱(HPLC)法定量测定菌液中GABA含量的原理：在菌液中加β-巯基乙醇，使GABA与邻苯二甲醛迅速反应，生成邻苯二甲醛(OPA)衍生物；在紫外区338 nm处，根据OPA衍生物的吸收峰，通过测定其吸光度值精确测定样品中的GABA含量。

GABA标准溶液的配制：用电子天平准确称量GABA标准品，配制浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的标准GABA溶液。

HPLC检测条件如下：仪器型号为Waters-1525；色谱柱为Hypersil ODS-2 C18(150 mm×4.0 mm，5μm及相应的保护柱)；检测器为紫外检测器；进样量为20μL；流动相A为20 mmol/L醋酸钠缓冲液(醋酸钠2.72 g、三乙胺200μL，加超纯水至1 L，调节pH为7.3)，0.22μm滤膜过滤，脱气；流动相B为乙腈，流动相A :流动相B=4 : 1；流速为1 mL/min；柱温为40℃；衍生试剂为OPA 20 mg，加β-巯基乙醇20μL、乙腈5 mL混匀即可。衍生反应：取硼酸缓冲液100μL(硼酸24.7 g，加超纯水1 L，调节pH至10.4)，OPA衍生剂20μL，样品20μL，混合均匀后室温反应5 min后开始测定。

2 结果与分析 2.1 目的菌株的菌落特征

从泡菜、酸奶、土壤、新鲜牛奶中分离得到多个菌株，选取其中的1个菌株F6进行形态学观察鉴定。菌株F6菌落光滑、圆形、直径1~2 mm、边缘整齐、乳白色，表面细腻(图 1)。在分离培养基上培养生长的F6菌落使其周边的培养基变成黄色，菌落周围形成透明圈(图 1-A)，这是由于乳酸菌生长过程中产生乳酸，能使含有溴甲酚绿的分离培养基变成黄色，推测F6是一株乳酸菌。在MRS固体培养基上培养生长的F6菌落不透明，周围有透明圈(图 1-B)。

2.2 目的菌株所产GABA的定性测定

改良纸层析法分析结果显示，目的株菌F6具有与GABA标准品相同Rf值(即指比移值，斑点中心距原点的距离与溶剂展开前沿距原点距离的比值)的斑点，层析斑点较深，表明GABA产量较高，图 2为目的株菌的改良纸层析图谱。

2.3 目的菌株的形态特征

菌株F6的染色结果如图 3所示，菌体形态呈圆或椭圆形，直径0.5~1.0μm，大多数呈双或短链状排列，通常不运动，革兰氏染色呈阳性。

2.4 16S rDNA基因序列分析与系统发育树构建

菌株F6的16S rDNA基因测序后，提交到DNA序列数据库GenBank。将测得的菌株F6的16S rDNA序列在美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)主页上进行N-BLAST分析比对，结果如图 4所示。菌株F6的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中屎肠球菌的相似性大于99%，表明两者均为屎肠球菌的不同菌株。

菌株F6的16S rDNA基因序列与NCBI主页GenBank数据库中部分细菌的16S rDNA基因序列进行同源性比对，为显示菌株F6与相似菌种之间的亲缘关系及其系统地位，用MEGA 3.0软件构建系统发育树(图 5)。结果显示，菌株F6与屎肠球菌的亲缘关系最近，其次是坚忍肠球菌。由此确定菌株F6为屎肠球菌。

2.5 目的菌株所产GABA的定量测定 2.5.1 标准曲线绘制

采用HPLC法精确测定标准液中GABA含量^[8-9]，GABA标准液中的GABA峰形如图 6所示。以峰面积对GABA含量作图，准确绘制出标准曲线(图 7)。结果显示，峰面积和GABA含量呈强相关的线性关系，线性方程为：Y=7 080 733.139 5X-4 511.692 7(R²=0.999 4)。

2.5.2 目的菌株所产GABA的定量

采用HPLC法精确测定菌株F6发酵液的色谱图峰面积，如图 8所示。根据上述得到的线性方程Y=7 080 733.139 5X-4 511.692 7，计算出菌株F6发酵液中GABA含量为7.1 g/L，保留时间为7~10 min，峰面积为50 268 693.6，吸光度值为0.12。

3 讨论 3.1 产GABA屎肠球菌的筛选

从酸奶、土壤、牛奶、泡菜中均分离得到产GABA的菌株，其中自酸奶样品中筛选得到的一菌株产GABA量相对较高，命名F6，表明从自然界中筛选高产GABA目的菌株是可行的。本试验在对目的菌株传统表型特征、生物学特性等进行快速筛选的基础上，采用改良纸层析法对目的菌株代谢产物GABA进行定性检测，准确、快速确定了菌株产GABA的能力。改良后纸层析法为按0.55%的比例将显色剂茚三酮加入展开剂中，展开剂组成为正丁醇:冰醋酸:水=5 : 3 : 1(体积比)，展开后85℃显色8 min，相比一般纸层析法显色时间15~20 min有明显优势^[10]，对快速筛选高产GABA目的菌株有一定参考价值。本试验通过分子生物学方法，将菌株F6的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中部分细菌的16S rDNA基因序列进行同源性比对，其与屎肠球菌的相似性大于99%，确定目的菌株F6为屎肠球菌，这为通过基因工程菌大量制备GABA提供了目的菌株。

3.2 GABA的制备方法

GABA的制备方法有化学合成法和生物合成法2种^[10]。化学合成法成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂，因此化学合成法制备的GABA不能用于食品和饲料，也不能认为是一种天然的食品或饲料添加剂^[11-12]。生物合成GABA是应用纯的微生物技术，通过筛选优良高产的安全菌种发酵生产得到，是天然食品与饲料添加剂，公认使用的安全菌为乳酸菌，如短小乳杆菌^[10]，而筛选的产GABA屎肠球菌颇少。生物合成法获得的GABA虽然纯度不高，但动物的吸收率比高纯度化学合成法的GABA有较大提高，并且产GABA乳酸菌可不经提纯, 直接添加到动物饲粮中。本试验以屎肠球菌为目标菌株，较乳酸杆菌的抗逆性更强，因此可发挥乳酸菌的微生态平衡调控和GABA抗应激的双重作用，功效叠加。

3.3 乳酸菌的GABA产量

自然界中直接筛选的乳酸菌合成GABA产量一般都不高，为5~7 g/L^[13-14]，所用菌株多为乳酸杆菌类。冯志彬等^[15]研究短小乳杆菌A8菌株后发现，初始pH 4.5、温度33℃、接种量20%、发酵时间3 d为该菌株的最佳发酵条件，GABA产量最高可达19.2 g/L，并发现培养基的pH是影响GABA产量的主要因素。本试验目的菌株为屎肠球菌，发酵液中GABA含量为7.1 g/L；最佳发酵条件为发酵温度36℃、原始pH 6.4、接种量4.5%、种龄20~23 h、发酵时间60 h，在最佳培养、发酵条件下，屎肠球菌F6发酵液中GABA的含量可提高到9.5 g/L，这可能与不同培养条件影响目的菌株谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)的活性有关。

利用传统诱变技术筛选能够提高乳酸菌的GABA产量。夏江等^[16]先后使用紫外线和γ-射线对产GABA的短乳杆菌进行诱变处理，使GABA平均产量提高142.9%，经诱变处理的短乳杆菌虽然GABA产量提高，但乳酸菌的固有功能作用降低，并且因不确定性、盲目性和遗传不稳定性，利用诱变乳酸菌所产GABA尚有潜在安全风险。

近几年，有文献报道利用重组大肠杆菌表达提取GAD，以固定化酶的方式生产GABA，但是转化效率普遍不高^[17]。已清楚GABA的生物合成途径是谷氨酸脱羧酶将L-谷氨酸转化为GABA。本后续试验拟通过增加现有菌株F6中GAD基因表达盒的数量，提高菌株细胞内GAD的表达，进而提高GABA的合成量^[18-20]，这尚在研究中。

3.4 屎肠球菌所产GABA的定量测定

本试验首先对发酵液中GABA进行定性测定，即采用改良纸层析法检测发酵液中是否含有GABA。按0.55%的比例将显色剂茚三酮加入到展开剂中，展开后85℃显色8 min，通过观察斑点快速定性确定GABA的存在。

本试验采用HPLC法测定发酵液中GABA的含量，GABA在β-巯基乙醇存在条件下能与邻苯二甲醛迅速反应，生成OPA衍生物，而OPA不会干扰检测，色谱图基线较稳定，标准曲线的R²为0.999 4，因此本试验采用的HPLC法简单、快速、灵敏，得到的结果可靠。

4 结论

本试验筛选得到的菌株F6为屎肠球菌，是一株功能性乳酸菌，具有高产GABA的能力。