2. 中国农业大学动物科技学院, 动物营养学国家重点实验室, 北京 100193
2. State Key Lab of Animal Nutrition, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
膳食纤维在人类健康与畜牧生产中发挥着越来越重要的作用[1-2]，但是不同种类的纤维对机体的调控作用不尽相同。苜蓿常被当作优质青绿饲料补充给散养的猪，特别是常用作饲料纤维来源预防母猪便秘，而本研究的开展则有助于将苜蓿草开发为一种健康的和高附加值的不可溶膳食纤维产品，以改善人和猪的营养和健康。饲粮中的纤维可以在猪后肠道被厌氧菌发酵，并主要产生乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸(SCFA)等代谢产物[3-4]。到目前为止，关于膳食纤维的研究报道多集中在菊粉、瓜尔豆胶、阿拉伯木聚糖等可溶性纤维上[5-8]。养猪生产中苜蓿草粉常被用作猪饲粮中的纤维来源，但是苜蓿草粉中占总纤维94%的不可溶性纤维[9]，对猪结肠食糜微生物菌群结构及其发酵产物的影响尚未见报道。因此，本研究通过在饲粮中添加不同比例的苜蓿草粉，研究不可溶性纤维对生长猪生长性能、结肠食糜微生物区系及其代谢产物和血清脂肪酸组成的影响，旨在研究饲粮中的不可溶性纤维是否可以改变结肠微生物菌群和微生物发酵代谢产物。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计本试验在农业部饲料工业中心丰宁动物试验基地进行。试验选取24头60日龄、体重为(24.8±0.7) kg的杜×长×大三元杂交去势公猪，采用单因子完全随机区组设计，分为4个组，苜蓿草粉的添加量分别为0(对照组)、5%、10%和15%，每个组6个重复，每个重复1头猪。在正式试验开始前适应3 d，正试期为28 d。试验期间每头猪饲养于代谢笼中，每天08:00和16:00各饲喂1次，自由采食和饮水。猪舍每天清扫2次，定期消毒。
饲粮配方根据NRC(2012)标准中推荐的生长猪(25~50 kg)营养需要量设计和配制，饲粮中净能水平和所有必需氨基酸的回肠标准可消化氨基酸均满足生长猪的需要。对照组和试验组饲粮组成及营养水平见表 1。饲粮中不添加抗生素。
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表 1 饲粮组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the diets (as-fed basis) |
在正式试验的第28天，每头试验猪前腔静脉采血，制备血清，置于-20 ℃保存，用来分析其脂肪酸组成。将称重后的试验猪全部屠宰，打开腹腔，分离结肠，采取结肠食糜用来测定SCFA的浓度和微生物组成。
1.3 生长性能测定分别在正式试验开始时和第28天对每头试验猪进行称重，计算平均日增重(average daily gain,ADG)；并记录每头试验猪的采食量，计算平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)和料重比(feed/gain,F/G)。
1.4 结肠食糜SCFA浓度的测定将食糜样品解冻后取1 g，加入3 mL 50 mmol/L硫酸溶液，4 ℃静置30 min，20 000×g离心10 min，将上清液过滤到进样小瓶中，通过气相色谱对SCFA浓度进行分析。色谱柱长30 m，内径0.32 mm，膜厚度0.5 μm；进样器和探测器温度分别为260和280 ℃；载气为氦气，流速为2.5 mL/min。
1.5 结肠食糜微生物区系分析采用美国Mobio公司Power Soil DNA Islation Kit提取100 mg样品基因组DNA，具体步骤按说明书操作。将提取的DNA作为模板，PCR扩增16S rDNA V3高变区。引物序列为上游：338-CCTACGGGAGGCAGCAG-355；下游：502-ATTACCGCGGCTGCTGG-518。PCR扩增体系(25 μL)：2×Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板2.5 μL，无菌双蒸水7 μL。PCR扩增条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将纯化后的PCR产物进行Illumina MiSeq测序。
将测序数据与已有的16S rDNA数据库进行比对分析，去掉带接头的、低质量的序列。使用QIIME软件对每个样品的序列进行统计，然后使用UCLUST软件根据序列相似性水平97%进行聚类，得到操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)序列。基于OTU在门和属2个分类水平上统计样本的物种丰度。
1.6 血清中脂肪酸组成的分析取1 mL血清样品于水解管中，加入4 mL氯乙酰/甲醇溶液和1 mL C11：0内标溶液(1.0 mg/mL)，拧紧旋盖后80 ℃水浴2 h，待溶液冷却后加入5 mL 7%碳酸钾溶液中和反应，将脂相溶液吸取到进样小瓶中，通过气相色谱对脂肪酸组成进行分析。色谱柱长60 m，内径0.25 mm，膜厚度0.25 μm；进样器和探测器温度分别为260和270 ℃；载气为氦气，流速为2 mL/min。
1.7 数据统计分析SCFA和脂肪酸数据经过Excel 2013整理后，利用SAS 9.3统计软件中GLM模型进行方差分析。微生物相对丰度数据利用曼-惠特尼U检验进行分析。P＜0.05为差异显著，0.05≤P＜0.10为有差异显著趋势。
2 结果与分析 2.1 苜蓿草粉对生长猪生长性能的影响由表 2可知，本试验条件下饲粮中添加苜蓿草粉对生长猪末重、ADG和ADFI均无显著影响(P>0.05)，但与对照组相比，添加苜蓿草粉极显著降低了F/G(P＜0.01)，而各试验组之间F/G无显著差异(P>0.05)。
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表 2 苜蓿草粉对生长猪生长性能的影响 Table 2 Effects of alfalfa meal on the growth performance of growing pigs |
由表 3可知，苜蓿草粉可显著增加总SCFA(线性：P＜0.01)、乙酸(线性：P＜0.01)和戊酸(二 次：P＜0.01)的浓度，以及丁酸、异丁酸、异戊酸和 总支链脂肪酸(BCFA)浓度(线性：P＜0.01，二次：P＜0.01)；丙酸浓度也有增加趋势(线性：P=0.07)。当苜蓿草粉添加量为10%时，总SCFA、丙酸、丁酸、戊酸和总BCFA的浓度最高。
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表 3 苜蓿草粉对生长猪结肠食糜短链脂肪酸浓度的影响 Table 3 Effects of alfalfa meal on SCFA concentration in colonic digesta of growing pigs |
由表 4可知，厚壁菌门(Firmicutes)是最具有优势的菌门，其相对丰度在对照组中为79.84%，在10%苜蓿草粉添加组中为81.28%。第二优势菌门为拟杆菌门(Bacteroidetes)，其相对丰度在对照组中为8.33%，在10%苜蓿草粉添加组中为7.56%。然后相对丰度较高的菌门分别为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和软壁菌门(Tenericutes)，其相对丰度在对照组中依次为2.90%、2.67%、1.20%和0.97%，在10%苜蓿草粉添加组中依次为1.61%、1.65%、0.39%和2.90%。利用曼-惠特尼U检验对对照组与10%苜蓿草粉添加组的微生物菌群在门和属水平上的相对丰度进行统计分析后发现，相对丰度在0.1%以上的微生物菌群在门和属水平上均无显著变化(P>0.05)。
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表 4 苜蓿草粉对结肠微生物菌群在门和属水平上的相对丰度的影响 Table 4 Effects of alfalfa meal on relative abundance of colonic microbiota at the phylum and genus levels |
由表 5可知，与对照组相比，添加苜蓿草粉显著降低了试验猪血清中的豆寇酸(C14：0)、棕榈油酸(C16：1)、油酸(C18：1n-9)、二十碳三烯酸(C20：3n-6)和二十二碳六烯酸(C22：6n-3)的含量(线性:P＜0.01)，以及棕榈酸(C16：0)、花生酸(C20：0)、山萮酸(C22：0)和鲨油酸(C24：1)的含量(线性:P＜0.01，二次:P＜0.05)，但是显著提高了亚油酸(C18：2n-6)、亚麻酸(C18：3n-3)和二十碳五烯酸(C20：5n-3)的含量(线性:P＜0.01)。随着饲粮中苜蓿草粉含量的增加，饱和脂肪酸(SFA)(线性:P＜0.01，二次:P＜0.01)和单不饱和脂肪酸(MUFA)的含量显著降低(线性:P＜0.01)，而多不饱和脂肪酸(PUFA)、PUFA/SFA值显著升高(线性:P＜0.01)。
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表 5 苜蓿草粉对生长猪血清脂肪酸组成的影响 Table 5 Effects of alfalfa meal on composition of serum fatty acid in growing pigs |
如表 1所示，4个组饲粮中可溶性纤维的含量较低且基本一致，不可溶性纤维水平较高、约占总纤维水平的90%而且线性增加，因此苜蓿草粉中的纤维主要为不可溶性纤维，试验效应主要来源于饲粮中不可溶性纤维水平的差异。
3.1 苜蓿草粉对生长猪生长性能的影响适宜的纤维含量可以提高猪的ADG和ADFI[10]，但当饲粮中纤维含量过高时则会降低猪的全肠道营养物质消化率[9]，从而会影响其生长性能。徐向阳等[11]报道，饲喂5%和10%水平的苜蓿草粉可显著提高生长猪的ADG，显著降低F/G，但对ADFI无显著影响；当饲粮中添加15%和20%苜蓿草粉时，不影响猪的ADG和ADFI。
本研究结果显示，苜蓿草粉对生长猪ADG和ADFI均无显著影响，但改善了F/G，这与前人的研究结果相似。由此可见，虽然试验中苜蓿草粉替代了饲粮中的部分玉米和豆粕，其最大添加水平为15%，但只要饲粮的净能和回肠标准可消化氨基酸水平满足猪的营养需要，苜蓿草粉便不影响生长猪的生长性能。
3.2 苜蓿草粉对生长猪结肠食糜SCFA浓度的影响饲粮中的纤维在单胃动物的小肠中不能被消化，但在后肠中可以被肠道微生物发酵并产生大量的SCFA[3-4]。SCFA主要包括乙酸、丙酸和丁酸，三者约占总SCFA的95%[12]。SCFA参与宿主的能量代谢和营养物质转化，并发挥特定的生理功能，例如丁酸是结肠上皮的主要能量来源，其被结肠上皮吸收后，可以为猪提供5%~20%的能量需要[13]；丙酸被肝脏摄取后作为糖异生的底物；乙酸被肝脏摄取后，通过血液循环进入外周组织，被摄取利用[14]。另外，SCFA可以降低大肠内的pH进而防止病原菌的滋生[5, 15]、促进结肠上皮细胞增殖[3]。此外有报道提出，SCFA通过激活其游离脂肪酸受体(FFAR)2或FFAR3进而引发内分泌L细胞对酪酪肽和胰高血糖素样肽-1的产生和释放[16-17]，进而调节动物的饱腹感[18-19]。
SCFA的浓度是反映后肠发酵活动强弱的重要指标[20]。不可溶性纤维对后肠发酵活动与SCFA的产生和吸收有重要影响[21]。本试验中，随着饲粮中苜蓿草粉水平线性增加，其不可溶性纤维水平线性增加，结肠食糜的总SCFA、乙酸和丁酸浓度也线性增加，其中10%和15%苜蓿草粉添加组与对照组相比显著增加。这与Chen等[9]的研究结果类似。当苜蓿草粉添加量为10%时，产生的SCFA浓度最高；而当苜蓿草粉添加量提高到15%时，饲粮中的不可溶性纤维水平为16.8%，会影响后肠微生物菌群的发酵效率，导致丁酸浓度相比10%苜蓿草粉添加组显著降低。此外，苜蓿草粉添加量在5%时，其不可溶性纤维水平与对照组基本一致，因此不会影响结肠食糜中乙酸、丙酸和丁酸的浓度。
3.3 苜蓿草粉对结肠微生物区系的影响有观点认为，抗性淀粉在分类上也属于不可溶性纤维[22]，但因其具有较强的可发酵性，因此可以显著改变猪后肠微生物的菌群结构，并产生大量的SCFA[23-24]。目前关于苜蓿草粉对猪结肠微生物区系的影响未见报道。本研究发现，苜蓿草粉对生长猪结肠微生物区系并没有显著影响。不同来源的不可溶性纤维及其不同的理化特性，使其对动物机体后肠道微生物的发酵活动影响也不同。在本研究中，虽然微生物菌群结构没有显著差异，但试验组结肠食糜SCFA浓度相比对照组显著增加，提示苜蓿不可溶性纤维可增强结肠微生物菌群的代谢活性。
3.4 苜蓿草粉对血清脂肪酸组成的影响本研究发现，饲喂苜蓿草粉显著增加了猪血清中PUFA含量和PUFA/SFA值，同时降低了MUFA和SFA含量，这与前人在兔上的研究结果[25]相似。有研究认为，PUFA含量的升高可能是饲粮中某些抗氧化成分的一种保护作用[26]。苜蓿草粉中的不可溶性纤维可以通过提高机体超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性、降低丙二醛含量，从而提高机体的抗氧化能力[10]。除此之外，苜蓿草粉中含有微量的苜蓿皂苷和苜蓿黄酮等物质，对提高机体的抗氧化能力也具有积极作用[10]。饲粮纤维的抗氧化机制，可能是因为它可以干扰胆酸的吸收与合成，影响胆酸代谢，减少血清中油脂的积累，因而可以缓解体脂的过氧化作用[25]。
4 结 论① 来源于苜蓿草粉的不可溶性纤维可以显著降低生长猪的F/G，显著增加结肠食糜的SCFA浓度，但不影响结肠食糜微生物菌群结构。
② 当苜蓿草粉添加量在10%时，丁酸、戊酸、总SCFA和总BCFA浓度最高。
③ 苜蓿草粉来源的不可溶性纤维提高了猪血清中的PUFA含量、PUFA/SFA值，降低了MUFA、SFA的含量，这对调节猪机体脂肪酸组成具有重要意义。
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