2. 天津帝凯维动物营养有限公司, 天津 300457
, ZHANG Haijun1
, WANG Jing1, YUE Hongyuan1, WU Shugeng1, QI Guanghai1, GUAN Kun2, GERRITS Gert Jan2
2. Tianjin DKVE Animal Nutrition Co., Ltd., Tianjin 300457, China
球虫是寄生在家禽肠道细胞的原虫。球虫病已经成为治疗费用昂贵的疾病之一，全世界每年因球虫病造成的经济损失高达20亿英镑[1]，我国每年用于球虫病防治的费用高达6~18亿元[2]。目前，球虫的防治仍主要依赖于抗球虫药，但是近50年密集持续的药物使用已经使球虫产生了严重的耐药性[3]。因此，寻找安全可靠的抗球虫药替代物已经迫在眉睫。
葡萄原花青素(grape procyanidins，GPC)是一种天然存在的植物多酚，也是葡萄副产品中的主要活性物质。大量研究表明，GPC具有良好的抗氧化活性[4]，可有效抑制由盐酸阿霉素(DXR)造成的大鼠心肌氧化损伤[5]，显著削弱对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝中毒和肝细胞DNA损伤[6]，缓解二甲基亚硝胺(DMNA)诱导的小鼠脾细胞毒性[7]。研究也显示，球虫入侵家禽肠道后会引起严重的氧化应激[8]，而GPC可通过激活机体抗氧化酶系统抑制氧化应激，进而抵抗球虫损伤[9]。
研究表明，GPC在提高机体免疫功能方面也具有良好的作用[10]。Gessner等[11]发现饲粮中添加葡萄籽提取物和葡萄渣提取物可显著抑制仔猪十二指肠核转录因子kappa B的活性，降低仔猪肠炎发生率；Hogan等[12]研究发现葡萄渣提取物(富含GPC)可以明显降低高脂饲粮诱导的肥胖性炎症大鼠血浆C-反应蛋白的浓度；Magrone等[13]发 现葡萄酒多酚可促进白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-10(IL-10)及免疫球蛋白的分泌释放，缓解免疫紊乱；还可促进一氧化氮释放，保护感染组织。GPC的免疫调节功能是否有助于家禽对抗球虫感染目前尚不十分清楚。
球虫主要损伤家禽肠道，而肠道是家禽重要的消化吸收和免疫器官，因此球虫感染势必会引起生长抑制和免疫紊乱。Mcdougald等[14]研究发现，家禽饲粮中添加2%圆叶葡萄渣(MP)，可显著降低球虫引起的肠道损伤评分；Wang等[9]也发现GPC可以缓解球虫引起的肉鸡生长抑制，但其机制尚不明确。本课题组的前期研究表明，体外条件下，GPC可以促进淋巴细胞的增殖活化[15]；以小麦-豆粕型饲粮为基础饲粮时，GPC可提高肉仔鸡的免疫功能[16]，推测GPC可能通过提高免疫功能来抵抗球虫感染。此外，本课题组研究也表明，盲肠窦分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和上皮内淋巴细胞(IEL)在家禽机体抵抗球虫过程中发挥着重要作用[17]，但GPC是否可通过激活肠道免疫抵抗球虫，目前还知之甚少。
本试验旨在探究GPC对感染柔嫩艾美尔球虫肉仔鸡生长性能、肠道损伤程度、免疫器官指数、淋巴细胞增殖活化、盲肠黏膜sIgA水平和回肠IEL增殖的影响，初步揭示GPC抗球虫感染的相关机理，为其在肉仔鸡生产中的应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料GPC由天津市尖峰天然产物研究开发有限公司提供，原花青素含量99.47％，其中含寡聚原花青素(OPC)65.19％，原花青素单体9.88％，多聚原花青素24.93％。
1.2 试验设计与试验饲粮试验选用350只1日龄科宝-500(Cobb-500)健康肉仔鸡公雏，随机分为5个组，每组7个重复，每个重复10只鸡。空白对照组和负对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮基础上添加7.5、15.0和30.0 mg/kg GPC的试验饲粮。14日龄时，负对照组和3个试验组每只肉仔鸡经口腔攻毒5×104个柔嫩艾美尔球虫卵囊，空白对照组每只肉仔鸡灌服同体积的生理盐水。试验期42 d，分为前期(1~21日龄)和后期(22~42日龄)2个阶段。
在参照NRC(1994)和NY/T 33—2004的基础上，配制小麦-豆粕型基础饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) % |
单层网上笼养，自然光照加人工补光，光照强度为30 lx，1~7日龄每天光照24 h，8日龄后每天光照23 h、黑暗1 h。鸡舍温度第1周33~35 ℃，之后每周下降2 ℃，至21 ℃不再下降。肉鸡自由采食和饮水，常规免疫。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生长性能试验前称雏鸡初始体重，分别于试验的第14、21、42天09:00之前，以重复为单位称空腹体重，记录试验鸡每天的耗料量，统计肉鸡1~14日龄、15~21日龄、22~42日龄耗料量，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。
1.4.2 血便堆数、盲肠病变评分和球虫卵囊排出于19日龄(攻毒后第5天)测定柔嫩艾美尔球虫感染肉仔鸡的血便堆数。
于21日龄(攻毒后第7天)时，每个重复随机选1只鸡，处死，按Johnson等[18]的方法测定盲肠病变评分，盲肠病变评分标准如下。
0分：未见病变；
1分：盲肠壁有极少量散在出血斑，肠壁不增厚，内容物正常；
2分：盲肠内容物有极少量血液，肠壁增厚，可见多处出血斑；
3分：盲肠内有多量血液或盲肠核，肠壁增厚，有明显的盲肠变形和萎缩；
4~5分：盲肠显著萎缩，病变达直肠部位，肠壁极度增厚，肠内有血凝块或盲肠核。
若两侧盲肠病变不一致，则以病变重的一侧为准，进行病变评分。
参照Lillehoj[19]的方法测定球虫卵囊排出。于攻毒后第7~10天，采用全收粪法收集排泄物中的卵囊，用麦氏虫卵计数板(Mcmaster’s chamber slide)计数卵囊，测定攻毒球虫7~10 d后每天每只鸡每克粪便的卵囊数(OPG)，以4 d的平均值进行统计。
1.4.3 免疫器官指数、淋巴细胞转化率和γδ T细胞比例于21日龄(攻毒后7 d)测定免疫器官指数、淋巴细胞转化率和血液中γδ T细胞比例。
淋巴细胞转化试验参考Mosmann[20]的方法并略作改动，虽然该方法不失经典但材料较陈旧，故略有修改，具体如下：翅静脉采血，肝素钠抗凝，立即将抗凝血用D-Hanks液作1 ∶ 1稀释，离心管中加入1 mL淋巴细胞分离液(购自军事医学科学院)，之后慢慢加入2倍体积的稀释血液，使之平铺于分离液上，4 ℃ 1 800×g离心30 min，可见液体分层，上层为血浆，中层为分离液，下层为红细胞和粒细胞。在上层和中层之间的界面上可见一薄层混浊带，即为淋巴细胞和单核细胞的混合物，取约1 mL的中间白细胞层，加入3~5倍体积的RPMI-1640营养液(购自美国Gibco公司)，洗涤3次，每次4 ℃ 2 500 r/min离心10 min，弃上清。然后将细胞悬浮于RPMI-1640完全培养液，台盼蓝染色，计数活细胞数(>95%)，调整细胞浓度为1×107个/mL。将细胞植于96孔细胞培养板，每孔加入190 μL的细胞悬液，随后分别加入10 μL磷酸盐缓冲液(PBS)、刀豆蛋白(ConA)(美国Sigma公司，终浓度45 μg/mL)或脂多糖(LPS)(美国Sigma公司，终浓度25 μg/mL)，PBS作为对照组，ConA组作为T淋巴细胞转化组，LPS组作为B淋巴细胞转化组。培养体系为200 μL，将板置于5% CO2，40 ℃ CO2培养箱中，培养56 h，之后每孔轻轻吸弃上清100 μL，加入100 μL不含小牛血浆的RPMI-1640培养液，同时加入初浓度5 mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液(美国Sigma公司)10 μL，继续于培养箱中培养4 h。培养结束后，每孔加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)，待紫色结晶完全溶解后，酶联免疫检测仪570 nm波长下测定吸光度(OD)值。
外周血淋巴细胞中γδ T细胞比例的测定参照张海军等[21]的方法进行。
1.4.4 回肠IEL数量和盲肠黏膜sIgA水平于21日龄(攻毒后7 d)测定回肠IEL数量和盲肠黏膜sIgA水平，sIgA水平用覆盖有sIgA的阳性面积与整个视野面积的比值来表示，方法参照高俊[17]的报道。
1.5 数据分析数据经Excel 2010初步处理，采用SPSS 16.0软件的单因素方差分析(one-way ANONA)程序进行统计分析，并采用Duncan氏法进行多重比较，其中肠道损伤评分、血便堆数和卵囊排出数等非连续观察数据因不符合正态分布，采用非参数检验中的Kruskal-Wallis方法进行分析，显著性标准设为P＜0.05，结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。
2 结果与分析 2.1 GPC对柔嫩艾美尔球虫感染肉仔鸡生长性能的影响由表 2可知，饲粮中添加GPC对1~14日龄肉仔鸡的生长性能指标无显著影响(P>0.05)。15~21日龄时，与空白对照组相比，负对照组肉仔鸡的ADG显著降低(P＜0.05)；而饲粮中GPC的添加缓解了球虫攻毒引起的ADG下降，其生长性能指标与空白对照相比无显著差异(P>0.05)。22~42日龄时，与空白对照组相比，负对照组肉仔鸡的ADG显著降低(P＜0.05)，F/G显著增加(P＜0.05)；而饲粮中7.5和15.0 mg/kg GPC的添加显著改善了球虫攻毒引起的ADG的降低和F/G的增加(P＜0.05)；与空白对照组相比，饲粮中30.0 mg/kg GPC的添加显著降低了ADG和ADFI(P＜0.05)。1~42日龄时，负对照组和30.0 mg/kg GPC组肉仔鸡的ADG显著低于其他各组(P＜0.05)，负对照组的F/G显著高于其他各组(P＜0.05)。综上，球虫攻毒降低了肉仔鸡的生长性能，饲粮中7.5和15.0 mg/kg GPC的添加缓解了球虫攻毒引起的生长抑制。
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表 2 GPC对柔嫩艾美尔球虫感染肉仔鸡生长性能的影响 Table 2 Effects of GPC on growth performance of broiler chicks challenged with Eimeiria tenalla |
由表 3可知，与负对照组相比，饲粮中添加GPC显著降低了肉仔鸡的盲肠病变评分、血便堆数和球虫卵囊排出数(P＜0.05)，其中7.5、15.0和30.0 mg/kg GPC组的卵囊排出数分别降低了66.9%、80.8%和45.4%，以15.0 mg/kg GPC组的抗球虫效果最佳。
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表 3 GPC对柔嫩艾美尔球虫感染肉仔鸡盲肠病变评分、血便堆数和球虫卵囊排出的影响 Table 3 Effects of GPC on cecal lesion score,bloody stool piles and number of coccidial oocysts excretion of broiler chicks challenged with Eimeiria tenalla |
由表 4可知，与空白对照组相比，负对照组肉仔鸡的脾脏指数显著增加(P＜0.05)，而各GPC添加组与空白对照组相比无显著差异(P>0.05)。与空白对照组相比，负对照组和各GPC添加组的外周血T淋巴细胞转化率显著增加(P＜0.05)；与负对照组相比，7.5和15.0 mg/kg GPC组的外周血T淋巴细胞转化率分别增加了16.1%和5.4%(P>0.05)。7.5和15.0 mg/kg GPC组的外周血B淋巴细胞转化率显著大于30.0 mg/kg GPC组(P＜0.05)。与空白对照组相比，负对照组的外周血γδ T细胞比例显著增加(P＜0.05)，15.0 mg/kg GPC组的外周血γδ T细胞比例大于负对照组，但差异不显著(P>0.05)。各组间的胸腺指数和法氏囊指数未见显著差异(P>0.05)。
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表 4 GPC对柔嫩艾美尔球虫感染肉仔鸡免疫器官指数和外周血淋巴细胞的影响 Table 4 Effects of GPC on the immune organ indexes and peripheral lymphocyte of broiler chicks challenged with Eimeria tenella |
由表 5可知，与空白对照组相比，负对照组的回肠IEL数量增加了41.9%(P＜0.05)；7.5和15.0 mg/kg GPC组的IEL数量进一步增加，较空白对照组分别增加了69.3%和116.7%(P＜0.05)；而30.0 mg/kg GPC组的IEL数量与负对照组无显著差异(P>0.05)。与空白对照组相比，负对照 组的盲肠黏膜sIgA水平增加了36.3%(P＜0.05)；饲粮中添加GPC使sIgA水平进一步升高，7.5、15.0和30.0 mg/kg GPC组的sIgA水平比空白对照组分别升高了107.6%、149.6%和94.3%(P＜0.05)。综上，饲粮中添加7.5和15.0 mg/kg GPC均可有效调节肠道IEL数量和sIgA水平，以15.0 mg/kg GPC组效果最好。
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表 5 GPC对柔嫩艾美尔球虫感染肉仔鸡肠道免疫功能的影响 Table 5 Effects of GPC on intestinal immune function of broiler chicks challenged with Eimeria tenella |
球虫是寄生在家禽肠道上皮的一种原生虫，主要破坏肠道上皮细胞，影响正常的消化吸收，造成生长缓慢和饲料效率降低。本研究结果显示，1~14日龄时各组肉仔鸡的生长性能差异不显著，与之前的研究结果相一致[16]，原因可能是饲喂时间过短GPC还没有发挥作用；攻毒后，球虫损伤了机体肠道，引起消化吸收功能障碍，造成营养浪费，而饲粮中添加7.5和15.0 mg/kg GPC缓解了这一损伤，与Wang等[9]和Mcdougald等[14]的研究较为一致，提示饲粮中添加7.5和15.0 mg/kg GPC可保持鸡只的健康生长状态，抵抗球虫感染造成的生长抑制。球虫感染会引起氧化应激和免疫抑制，课题组的前期研究结果也揭示了GPC具有较好的抗氧化和促免疫作用[20-21]，这可能是GPC改善肉仔鸡生长性能的重要原因。
值得注意的是，尽管试验全期30.0 mg/kg GPC组的F/G显著低于负对照组，但ADG与负对照组差异不显著，这是由于30.0 mg/kg GPC组的ADFI较低造成的，提示饲粮中添加30.0 mg/kg GPC的抗球虫效果有限，可能是因为高剂量GPC对饲料的适口性有负面影响。
3.2 GPC对柔嫩艾美尔球虫感染肉仔鸡盲肠病变评分、血便堆数和球虫卵囊排出数的影响肠道是机体最重要的消化吸收器官，其健康程度直接影响鸡只的生长速度；球虫入侵肠道上皮细胞后，破坏肠道上皮的完整性，引起出血，出现血便；球虫寄生并在肠道上皮细胞内大量增殖，并随粪便排出体外。本试验结果表明饲粮中添加GPC显著降低了球虫攻毒肉仔鸡的盲肠病变评分、血便堆数和球虫卵囊排出数，这与Wang等[9]研究结果相一致。
本课题组前期试验研究显示，GPC对球虫并无显著的直接杀伤作用(未发表资料)，故可推测GPC可能通过激活机体自身免疫系统来抵抗球虫感染。
3.3 GPC对柔嫩艾美尔球虫感染肉仔鸡免疫器官发育和外周血淋巴细胞的影响与哺乳动物的淋巴结相似，脾脏是鸡最大的外周免疫器官，也是机体发生免疫反应、产生抗体的重要器官，其发育状况与机体的免疫状况密切相关。此外，脾脏直接与血液相通，极易受到血液中自由基的攻击发生氧化应激。有研究表明，球虫感染会破坏肉鸡脾脏的抗氧化体系，损害脾脏组织结构[22-23]。还有报道指出肉仔鸡感染球虫后脾脏实质细胞肿胀，红髓内血细胞增多，并伴有大量炎性细胞浸润[24]。本试验研究显示，感染球虫的负对照组肉仔鸡的脾脏指数显著增加，这可能与球虫感染引起的抗氧化失衡及炎症反应有关。本课题组前期研究显示，饲粮中添加7.5和15.0 mg/kg GPC对肉仔鸡的脾脏指数无显著影响，提示在正常饲养状态下GPC可能对脾脏指数无显著作用[16]。然而，本试验结果则显示饲粮中添加GPC可将感染球虫肉仔鸡的脾脏指数恢复至未感染时的正常水平，提示GPC对处于球虫感染状态肉仔鸡脾脏指数有较为显著的改善作用，这可能与GPC的抗炎作用[11-12]和缓解氧化应激作用[9]有关。GPC抑制球虫感染引起的脾脏指数升高的机制还有待于进一步研究。
T淋巴细胞转化率和B淋巴细胞转化率反映了机体T、B淋巴细胞的反应和增殖活性，而球虫感染后机体的细胞免疫起主导作用。本试验发现球虫感染肉仔鸡的T淋巴细胞转化率显著高于空白对照组，提示机体发生了应对球虫入侵的免疫反应；而饲粮中添加GPC提高了T淋巴细胞转化率，与之前的研究较为一致[15-16]。GPC激活细胞免疫，促进T淋巴细胞分泌细胞因子，抵抗球虫入侵，这可能是GPC抗球虫的机理之一。而球虫感染后机体的体液免疫作用相对较弱，本试验未发现球虫感染负对照组与空白对照组之间胸腺指数和法氏囊指数的显著差异。但饲粮中添加GPC提高了B淋巴细胞转化率，可能是因为球虫入侵破坏了肠道黏膜屏障，引起病原微生物的大量入侵，激活体液免疫，促进B淋巴细胞分泌抗体，有利于机体预防球虫感染引起的继发疾病。
Bessay等[25]和Swinkels等[26]的研究显示，球虫感染后鸡肠道γδ T细胞数量迅速增多。Yun等[27]比较了2个品系蛋鸡在球虫感染后肠道淋巴细胞亚群的变化，发现在球虫感染后高耐受鸡肠道γδ T细胞数量显著高于低耐受鸡。本试验研究发现球虫感染负对照组肉仔鸡外周血的γδ T细胞比例显著高于空白对照组，这与前人研究较为一致。γδ T细胞通过促进角化细胞生长因子和表皮生长因子(EGF)的生成，调节上皮细胞的增殖和分化等[28-30]，而球虫感染可活化机体γδ T细胞发挥自身免疫保护作用。本试验未发现饲粮中添加GPC具有显著提高肉仔鸡外周血γδ T细胞增殖的作用，可能是由于球虫感染后肠道γδ T细胞比例显著提高，但经过循环，到达血液中的γδ T细胞并未达到显著变化。
3.4 GPC对柔嫩艾美尔球虫感染肉仔鸡肠道免疫功能的影响黏膜内免疫细胞占机体所有免疫细胞的80％，黏膜免疫在机体的免疫保护中占有非常重要的地位。黏膜免疫系统是由集合黏膜相关淋巴组织和弥散黏膜相关淋巴组织组成，集合黏膜相关淋巴组织是捕捉抗原和产生免疫效应细胞与免疫记忆细胞的主要场所。盲肠扁桃体是集合黏膜相关淋巴组织的一部分，而IEL是弥散黏膜淋巴组织的一部分。IEL是一类独特的淋巴细胞群，在细胞介导的黏膜免疫和维持上皮的完整性中起着重要作用，具有胞内颗粒(如穿孔素、粒酶和丝氨酸酯酶等)，有细胞杀伤作用，也可以分泌淋巴细胞因子(如肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、白细胞介素-2等)，在防御肠道病原菌入侵方面也发挥着重要作用[31-32]。本试验显示饲粮中添加GPC显著提高了球虫感染后肉仔鸡回肠IEL数量，提示GPC通过促进IEL增殖活化，分泌细胞因子和胞内颗粒，直接或间接杀灭球虫。
黏膜相关淋巴组织中的B细胞多为sIgA的产生细胞，受抗原刺激后直接将sIgA分泌到附近黏膜，发挥局部免疫作用。郑明学等[23]发现，感染柔嫩艾美尔球虫鸡的盲肠黏膜局部淋巴细胞显著增生，盲肠黏膜局部致敏的B淋巴细胞产生sIgA，可将球虫阻留在肠腔，以便消化液和其他物质的作用将球虫杀灭，据此认为肠道局部分泌型抗体和细胞免疫共同协调发挥综合保护作用。刘晶[33]认为sIgA抗球虫感染的可能作用机制为：sIgA黏附在虫体表面，通过中和以及调理吞噬等空间阻碍作用降低虫体的活力，诱导宿主细胞受体分子构型发生改变，抗体依赖性细胞介导细胞毒性作用直接作用于子孢子和裂殖子，阻止其入侵及在细胞内的发育。本试验显示饲粮中添加GPC显著提高了球虫感染后肉仔鸡盲肠黏膜sIgA的分泌水平，进而通过空间阻隔效应减少了球虫与肠壁细胞的接触损伤。
4 结 论① 肉仔鸡饲粮中添加适量GPC可抑制球虫感染引起的生长性能下降。
② 肉仔鸡饲粮中添加适量GPC可提高球虫感染后外周血淋巴细胞转化率。
③ 肉仔鸡饲粮中添加适量GPC可提高球虫感染后回肠IEL数量和盲肠黏膜sIgA水平，维持肠道健康。
④ 在本试验球虫感染模型条件下，肉仔鸡饲粮中GPC的适宜添加剂量为7.5~15.0 mg/kg。
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