在现代集约化牛养殖业中，生产者为追求较高的经济效益，常在动物饲粮中使用高比例精料。研究发现，当奶牛等反刍动物长期采食含高比例易发酵碳水化合物饲粮后，动物可能发生慢性瘤胃酸中毒[1]，导致动物上皮屏障受损，引发消化道内源性脂多糖(LPS)移位，进而引发宿主炎症[2]。最近有报道显示，慢性炎症可显著降低奶牛产奶量，降低奶牛生产效益，而采用抗炎处理则可逆转炎性反应对奶牛生产性能的不利影响[3]。此外有报道表明，高精料饲粮还可导致奶牛体内氧化与抗氧化作用失衡，使动物处于氧化应激状态，造成氧化损伤[4-5]。由此，研究可缓解高精料饲养模式引起炎症反应及氧化应激的营养措施对于提高奶牛健康意义重大。槲皮素是一类广泛存在于植物 的花、叶、果实中的多羟基黄酮类化合物[6]，具有抗氧化[7]、抗癌[8]、抗炎[9-11]和舒张血管[12-13]等作用；此外，Shu等[14]发现，槲皮素等对变异链球菌、血链球菌、嗜酸乳杆菌和远缘链球菌等的生长具有抑制效应。因此，槲皮素可能具有潜在的改善高精料饲粮模式下瘤胃发酵、抗炎及防止氧化应激的效应。
基于饲喂高精料饲粮对动物瘤胃与机体健康的危害以及槲皮素在抗炎、抗氧化应激及影响瘤胃发酵方面的潜力，本试验研究了高精料饲粮条件下，添加槲皮素对山羊瘤胃发酵、菌群数量及血清指标的影响，以期为槲皮素在反刍动物养殖中的应用提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验于2015年4—5月在南京农业大学动物房进行。槲皮素以二水化槲皮素(quercetin dihydrate)形式添加,购自Adamas公司，纯度≥98%。
试验选用12头体重[(28.4±3.0) kg]相近、安装有永久性瘤胃瘘管的健康波杂山羊(波尔山 羊×长江三角洲白山羊)，单栏饲养，自由饮水。采用随机区组试验设计，将12只山羊随机分为对照组(不添加槲皮素)以及试验组(添加槲皮素100 mg/kg BW)，每组6头。试验期42 d。基础饲粮供给量按体重3.5%计算，饲粮精粗比65 ∶ 35，精料和粗料分开饲喂，每天饲喂2次(分别为08:00和17:00)，2次等量饲喂。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
分别在试验期第35、38、41天晨饲后0(08:00)、2、4和8 h采集瘤胃液，经4层纱布过滤后，立即测定瘤胃液pH；同时取样冻存于-20 ℃冰箱，备测瘤胃发酵相关指标。在试验期第36、39和42天晨饲后0、6 h通过颈静脉采集血液，常规法分离血清后，分装冻存于-20 ℃冰箱保存备用。
1.3 指标测定瘤胃液挥发性脂肪酸(VFA)浓度的测定参照秦为琳[15]的方法，氨态氮(NH3-N)浓度的测定参照冯宗慈等[16]的比色法。血清抗氧化指标采用试剂盒测定，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。血清生化指标在江苏省中西医结合医院测定。
1.4 细菌总DNA提取及实时定量PCR(real-time PCR)定量分析取瘤胃液1 mL，采用珠磨法，参照Murray等[17]的方法提取瘤胃细菌总DNA。使用ABI 7500实时定量PCR仪(Applied Biosysterm)对瘤胃液中拟杆菌门和厚壁菌门细菌进行定量。分别以化脓拟杆菌(Bacteroides pyogenus)和厚壁菌的16S rRNA基因作为模板，模板菌落浓度分别为3.29×109和7.48×109 CFU/μL。 模板按照10倍梯度向下稀释，在标准曲线上使用5个点，每个点3次重复检测，制作相应细菌定量的标准曲线。实时定量PCR反应体系为20 μL：10.4 μL SYBR Green Supermix(TOYOBO公司)，10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL，2 μL样品总DNA以及6.8 μL无菌水。实时定量PCR引物信息见表 2，引物Bact934F/Bact1060R和Firm934F/Firm1060R分别用于定量山羊瘤胃液中拟杆菌门和厚壁菌门。PCR反应程序为：95 ℃ 10 min，而后95 ℃ 30 s，60 ℃下退火及延伸1 min，40个循环。
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表 2 实时定量PCR引物信息 Table 2 Informations of primers for real-time PCR |
试验数据经Excel 2010初步整理后，应用SPSS 18.0统计软件中GLM程序进行分析，P<0.05为差异显著，0.05≤P<0.10为具有显著趋势。
2 结果与分析 2.1 瘤胃发酵参数由表 3可见，与对照组相比，试验组显著升高了瘤胃液pH(P=0.047)及戊酸浓度(P=0.034)和异丁酸浓度(P=0.001)，丁酸浓度有升高的趋势(P=0.074)。添加槲皮素未显著影响瘤胃液乙酸/丙酸及乙酸、丙酸、异戊酸、总挥发性脂肪酸及氨态氮浓度(P>0.10)。但不同的采样时间对瘤胃液pH(P=0.024)及乙酸(P=0.003)、异丁酸(P=0.001)、丁酸(P=0.023)、异戊酸(P=0.015)、戊酸(P=0.016)、总挥发性脂肪酸(P=0.008)、乙酸/丙酸(P<0.001)和氨态氮浓度(P<0.001)有显著影响。在对瘤胃液pH(P=0.001)及丙酸(P=0.021)、氨态氮浓度(P=0.004)的影响方面，采样时间与槲皮素之间存在显著的互作效应。
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表 3 高精料饲粮添加槲皮素对山羊瘤胃发酵参数的影响 Table 3 Effects of quercetin supplemented in high-grain diet on rumen fermentation parameters of goats |
由表 4可见，添加槲皮素、采样时间及二者交互作用对厚壁菌门和拟杆菌门细菌数量均没有显 著影响(P>0.10)，对厚壁菌门/拟杆菌门也无显著影响(P>0.10)。
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表 4 高精料饲粮添加槲皮素对山羊瘤胃液厚壁菌门和拟杆菌门细菌数量的影响 Table 4 Effects of quercetin supplemented in high-grain diet on bacterium counts of Firmicutes and Bacteroidetes in rumen fluid of goats |
由表 5可见，试验组总抗氧化能力(P=0.031)和还原型谷胱甘肽含量(P=0.002)显著高于对照组，但2组间在丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性上未有显著差异(P>0.10)。采样时间对 丙二醛含量(P<0.001)、超氧化物歧化酶活性(P<0.001)和还原型谷胱甘肽含量(P<0.001)有显著影响。采样时间与槲皮素对上述指标无显著互作效应(P>0.10)。
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表 5 高精料饲粮添加槲皮素对山羊血清抗氧化指标的影响 Table 5 Effects of quercetin supplemented in high-grain diet on serum antioxidant indices of goats |
由表 6可见，试验组山羊血清钾离子的浓度显著低于对照组(P=0.042)，而尿素氮浓度则显著高于对照组(P=0.006)。添加槲皮素对血清钠离子、氯离子、钙离子和葡萄糖浓度无显著影响(P>0.10)。但采样时间对血清钠离子(P=0.001)、氯离子(P<0.001)和葡萄糖浓度(P=0.008)有显著影响。在对上述指标的影响上，采样时间与添加槲皮素之间无显著互作效应(P>0.10)。
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表 6 高精料饲粮添加槲皮素对山羊血清生化指标的影响 Table 6 Effects of quercetin supplemented in high-grain diet on serum biochemical indices of goats |
由表 7可见，添加槲皮素对山羊采食量无显著影响(P>0.10)。
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表 7 高精料饲粮添加槲皮素对山羊采食量的影响 Table 7 Effects of quercetin supplemented in high-grain diet on feed intake of goats |
瘤胃液pH是反映瘤胃代谢与影响瘤胃健康的重要指标之一，瘤胃液pH的高低受瘤胃液总挥发性脂肪酸浓度、唾液分泌量、瘤胃上皮对挥发性脂肪酸吸收能力及瘤胃内食糜流出等因素的综合 影响[1]。本试验结果显示，添加槲皮素显著提高了瘤胃液pH，暗示槲皮素可能具有缓解反刍动物瘤胃酸中毒的潜力。但本研究中，试验组总挥发性脂肪酸浓度与对照组并没有显著差异。作者推测，试验组瘤胃液pH增高可能与动物唾液分泌量增加有关，但由于本项目未检测2组山羊唾液分泌量，因此，有关槲皮素提高瘤胃液pH的作用机理尚待进一步研究。
钠离子、钾离子和氯离子是体液调节酸碱平衡和渗透压的主要离子，常被用来检测动物体水盐代谢和酸碱平衡状态[19]，血清钠离子是细胞外液最重要的阳离子，正常浓度为135～145 mmol/L。血清钾离子是细胞内主要阳离子，研究已证实，当瘤胃液中挥发性脂肪酸浓度提高时，挥发性脂肪酸的氢根离子可弥散入细胞内，而瘤胃细胞内的钾离子则可逸出细胞外，以维持瘤胃液pH的相对恒定。研究发现，动物酸中毒常伴随高血钾[20]。本试验结果显示，试验组显著降低了血清钾离子的浓度，该结果提示槲皮素可能具有促进氢离子吸收，进而维持瘤胃液pH稳定的能力。
血液中尿素氮是蛋白质代谢后产生的废物，血液尿素氮浓度的高低往往作为动物体内蛋白质代谢和饲粮氨基酸平衡状况较为准确的反映指标。反刍动物血液尿素氮来源于瘤胃壁吸收的氨态氮和机体组织蛋白质分解，与瘤胃内氨态氮浓度相关。本试验结果显示，添加槲皮素显著升高了血清尿素氮浓度，说明槲皮素可能具有影响山羊体内氮代谢的作用。
异位酸是异丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸和戊酸的总称，瘤胃内浓度的升高具有提高奶牛产奶量的作用[21]。本试验发现，槲皮素可显著提高瘤胃液异丁酸和戊酸的浓度。而Cui等[22]研究证明，槲皮素可显著提高奶牛产奶量。因此，槲皮素提高奶牛产奶量可能与其提高异位酸浓度的作用有关。
离体与动物试验均表明，槲皮素具有抗氧化作用[23-27]。本试验发现，试验组显著提高了血清总抗氧化能力、还原型谷胱甘肽的含量，该结果说明槲皮素具有缓解饲喂高精料饲粮对动物的氧化应激。此外，虽体外试验发现，槲皮素具有抑制变异链球菌、血链球菌、嗜酸乳杆菌和远缘链球菌等微生物生长的作用，但本试验发现，添加槲皮素并未显著影响瘤胃菌群中的主要2类菌群的数量，说明槲皮素可能不具有影响瘤胃微生物的作用效果。
4 结 论高精料饲粮条件下，添加槲皮素可提高山羊瘤胃液pH，增强机体抗氧化能力，对山羊健康具有潜在的保护效应。
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