2. 沈阳爱地生物科技有限公司, 沈阳 110169
2. Shenyang Aidi Biotechnology Co., Ltd., Shenyang 110169, China
兔是单胃草食动物，发达的盲肠内含有大量的微生物，能够将难消化的纤维发酵分解成低分子有机酸等营养物质，被机体吸收。因此，研究探讨饲粮纤维源及粗纤维(CF)水平对肉兔消化生理和盲肠菌群的影响，对合理利用粗饲料资源、确定适宜的饲粮CF水平等具有重要实际意义。根据分析方法不同，生长兔全价配合饲料中纤维含量一般在15%～50%，其中CF水平在14%～18%[1]，范围为12.2%～24.4%[2]。兔对饲草、饲料中纤维性物质的消化利用能力一般在17%～25%，明显低于牛、羊和马等草食动物，但饲粮纤维对兔的生长和健康起着非常重要的作用。研究表明，低纤维饲粮(木质素与纤维素的比值＜0.4)会引起家兔生长率下降和食糜在消化道内存留时间过长[3]，并且在没有特定病原体感染的情况下，还会导致家兔采食和消化紊乱[4-5]，甚至腹泻。但是如果饲粮中CF水平过高，对家兔健康也会造成损害。同时，家兔对纤维的利用又受纤维来源(品质)、饲料形态及家兔品种、日龄等多种因素的影响。一般认为，兔对饲粮纤维的利用得益于盲肠微生物的发酵作用。因此，本试验分别以优质(苜蓿草粉)和低质(稻壳粉)2种粗饲料为主要纤维源，并分别设3个CF水平，配制6种试验饲粮，研究不同纤维源及CF水平对肉兔营养物质消化率、肠道消化酶活性的影响，同时从定性水平上探讨肉兔肠道菌群多样性与纤维源及CF水平的关系，为深入研究饲粮纤维对肉兔的营养生理作用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物和饲粮选择144只70～80日龄健康伊拉(Hyla)配套系商品代生长肉兔，初始平均体重(2 002±77) g，依据性别和体重随机分为6组，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组，每组4个重复，每个重复6只兔，在同一兔舍内单笼饲养，饲喂不同饲粮。试验饲粮采用双因子析因试验设计，在等能等氮条件下，设2种纤维源(苜蓿草粉、稻壳粉)、3个CF水平(12%、14%、16%)。苜蓿草粉和稻壳粉在配方中的比例分别为24.50%、31.50%、37.50%和14.00%、17.50%、22.00%。参照文献[6]中的家兔常用饲料原料化学成分数据，配制6种试验饲粮，其组成及营养水平见表 1，所有饲粮制成直径约4 mm的颗粒。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
饲养试验为期4周，饲养试验结束后，每个重复取1只兔(确保每组雌雄各2只)，采用全收粪法进行消化试验。之后进行屠宰，迅速取出空肠、十二指肠、盲肠食糜(2份)于10 mL的带盖离心管中，立即放入液氮罐速冻20 min，取出至-80 ℃冰箱保存待测。
1.3 测定指标和方法 1.3.1 营养物质表观消化率消化试验预试期1周，正试期4 d，记录和称量每只兔每天的实际采食量及收集全部新鲜粪便并称重。采集部分粪便样品，一份用10%盐酸溶液固定挥发性氮后用于测定粗蛋白质(CP)含量，另一份不固氮用于测定其他养分指标。粪便样品置65～70 ℃烘箱烘至恒重，取出在空气中回潮24 h后称重，测定初水分含量。将风干样品用研磨机粉碎并过40目筛(筛孔径为0.45 mm)，以重复为单位，将4 d的粪样混匀，取部分样品装入样品袋中密封保存备测。其中，干物质(DM)含量依据GB/T 6435—2006测定；CP含量采用KjelFlex K-360型自动凯氏定氮仪(Büchi，瑞士)测定；CF、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、酸性洗涤木质素(ADL)含量采用ANKOM A2000i全自动纤维分析仪(Ankom，美国)测定；总能使用IKA C2000全自动量热仪(IKA，德国)测定。
1.3.2 肠道消化酶活性应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定空肠和十二指肠食糜的淀粉酶、胰蛋白酶活性及盲肠食糜的纤维素酶活性。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按照操作说明进行。
1.3.3 盲肠菌群多样性 1.3.3.1 基因组DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)手提法[7]提取样品基因组DNA。
1.3.3.2 细菌16S rDNA片段的PCR扩增以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物GC-338F(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGGCCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和518R(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)扩增样品16S rDNA的V3区序列。PCR扩增体系(50 μL)为:10×PCR Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL、rTaq(5 U/μL)0.4 μL、 GC-338F(20 μmol/L)1 μL、518R(20 μmol/L)1 μL、模板DNA 50 ng，补ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最终72 ℃延伸10 min。
PCR产物采用Omega公司的DNA Gel Extraction Kit纯化回收。PCR仪为Biometra公司生产的T-gradient，凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统。
1.3.3.3 PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析取10 μL PCR的产物进行DGGE分析。采用变性梯度为35%～55%、浓度为7%的聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲液中150 V 60 ℃条件下电泳5 h。DGGE完毕后，采用银染法染色。
PCR-DGGE图谱采用Bio-Rad公司的Quantity one分析软件包对每个样品的电泳条带数目、条带密度进行数字化分析。
(1) 戴斯系数(Cs)为不同样品间菌群差异的两两比较，计算公式如下：
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式中：Cs为戴斯系数；Nx为x泳道条带数；Ny为y泳道条带数；j为2个泳道共有的条带数。
用MEGA 4.1软件构建系统发育树，进行聚类分析。
(2) 香农指数、丰富度和均衡指数的计算公式如下：
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式中：H为香农指数；pi为样品中单一条带的强度在该样品所有条带总强度中所占的比率；N为DGGE图谱单一泳道上所有条带的密度；Ni为第i条带的密度；S为丰富度，即某样品中所有条带数目总和；E为均衡指数；Hmax是H的最大值(最大均匀性条件下的多样性值)。
1.4 数据统计分析以重复为单位进行数据处理和统计，采用IBM SPSS Statistics version 22统计软件的GLM过程进行方差分析，纤维源和CF水平为固定因子。采用Duncan氏法进行多重比较检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2 结果与分析 2.1 饲粮营养物质消化率由表 2可知，消化试验期内以稻壳粉为纤维源的肉兔NDF、ADF、ADL的进食量极显著高于以苜蓿草粉为纤维源的肉兔(P<0.01)。16%CF水平组肉兔CF、NDF、ADF的进食量极显著高于12%和14%CF水平组(P<0.01)，纤维源及CF水平的交互作用极显著地影响肉兔各营养物质的进食量(P<0.01)。纤维源对饲粮中DM、CP、CF、ADF、ADL的消化率有显著影响(P<0.05)，以苜蓿草粉为纤维源时除CP的消化率极显著低于苜蓿草粉组(P<0.01)外，其他各营养物质的消化率均显著高于稻壳粉组(P<0.05)。CF水平对DM、NDF、ADF的消化率有显著影响(P<0.05)，12%CF水平组DM的消化率显著高于14%CF水平组(P<0.05)，NDF、ADF的消化率则呈现出“两端(12%、16%CF)高，中间(14%CF)低”的变化趋势。
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表 2 饲粮纤维源及CF水平对肉兔营养物质消化率的影响 Table 2 Effects of dietary fiber source and CF level on nutrient digestibility of meat rabbits |
14%CF水平的稻壳粉组(Ⅴ组)DM的消化率显著低于除Ⅵ组外的其余各组(P<0.05)。16%CF水平的苜蓿草粉组CF的消化率显著高于12%、14%CF水平的稻壳粉组(P<0.05)。16%CF水平的稻壳粉组NDF的消化率显著高于14%CF水平的苜蓿草粉组(P<0.05)。以苜蓿草粉为纤维源的3个组的ADF和ADL的消化率均高于以稻壳粉为纤维源的3个组。
纤维源对饲粮表观消化能(ADE)无显著影响(P＞0.05)，CF水平、纤维源与CF水平的交互作用对ADE有极显著影响(P＜0.01)。12% CF水平组的ADE极显著高于14%和16%CF水平组(P＜0.01)，以12%CF水平的苜蓿草粉组的ADE最高(12.99 MJ/kg)。纤维源、纤维源与CF水平的交互作用对能量消化率无显著影响(P＞0.05)，但CF水平对能量消化率具有极显著的影响(P＜0.01)。
2.2 肠道消化酶活性由表 3可知，纤维源对十二指肠胰蛋白酶活性有极显著的影响(P<0.01)。CF水平对空肠胰蛋白酶活性有显著影响(P<0.05)，对盲肠纤维素酶活性有极显著的影响(P<0.01)。而纤维源和CF水平的交互作用对十二指肠淀粉酶活性有极显著的影响(P<0.01)，对盲肠纤维素酶活性有显著影响(P<0.05)。以稻壳粉为纤维源的肉兔十二指肠胰蛋白酶活性极显著高于以苜蓿草粉为纤维源的肉兔(P<0.01)。
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表 3 饲粮纤维源及CF水平对肉兔肠道消化酶活性的影响 Table 3 Effects of dietary fiber source and CF level on intestinal digestive enzyme activities of meat rabbits |
12%CF水平组的空肠淀粉酶(1 053.96 U/g)、胰蛋白酶活性(35.54 U/mg)及盲肠纤维素酶活性(213.87 μg/g)均最低。16%CF水平的稻壳粉组空肠胰蛋白酶活性显著高于12%CF水平的苜蓿草粉和稻壳粉组(P<0.05)，12%CF水平的稻壳粉组的十二指肠淀粉酶活性(1628.16 U/g)极显著高于16%CF水平的稻壳粉组(P<0.01)，显著高于12%和14%CF水平的苜蓿草粉组(P<0.05)。12%和14%CF水平的苜蓿草粉组的十二指肠胰蛋白酶活性显著低于其余各组(P<0.05)。12%CF水平的苜蓿草粉组的盲肠纤维素酶活性极显著低于其余各组(P<0.01)。
2.3 盲肠菌群结构 2.3.1 菌群相似性分析图 1、图 2分别为24个盲肠菌群样本基因组DNA提取结果和16S rDNA PCR产物的DGGE分析结果。由图 2可知，兔盲肠总菌样品包含的微生物种类较多，图谱条带也较多。条带最多的是来自16%CF水平的稻壳粉组的样本6-1，有52条。条带最少的是来自14%CF水平的稻壳粉组的样品5-1、5-2、5-4，均为34条。依据各泳道的条带数目及所在位置，计算Cs，构建系统发育树(图 3)。由图 3可知，6个组的24个盲肠样本明显地聚为两大类，由上至下样本4-2至5-2聚为一类、2-4至3-3聚为一类。但每大类都有来自不同组的样本。相似性较高(Cs＞0.5)的有4簇，分别是样本1-2与6-1、样本6-2与5-2、样本5-4与6-3、样本4-3与3-3。总体看，组间及重复间无明显的聚类规律，如样本4-1、4-2、4-3、4-4为同一组的不同试验兔的盲肠内菌群样本，却很难同时聚到同一个分支上。
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图 1 4个盲肠菌群样本的基因组DNA提取结果 Figure 1 Genomic DNA extraction results of 24 samples of cecum microflora (M：DL2000) |
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样本1-1、1-2、1-3，1-4来自Ⅰ组，样本2-1、2-2、2-3、2-4来自Ⅱ组，样本3-1、3-2、3-3、3-4来自Ⅲ组，样本4-1、4-2、4-3、4-4来自Ⅳ组，样本5-1、5-2、5-3、5-4来自Ⅴ组，样本6-1、6-2、6-3、6-4来自Ⅵ组。下图同。 Samples 1-1,1-2,1-3 and 1-4 come from group Ⅰ,samples 2-1,2-2,2-3 and 2-4 come from group Ⅱ,samples 3-1,3-2,3-3 and 3-4 come from group Ⅲ,samples 4-1,4-2,4-3,4-4 come from group Ⅳ,samples 5-1,5-2,5-3 and 5-4 come from group Ⅴ,and samples 6-1,6-2,6-3 and 6-4 come from group Ⅵ. The same as below 图 2 16S rDNA PCR产物的DGGE图谱 Figure 2 DGGE fingerprints of 16S rDNA PCR products |
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图 3 依据戴斯系数构建的系统进化树聚类分析 Figure 3 Cluster analysis of phylogenetic tree on the basis of Cs |
由表 4可知，纤维源对盲肠菌群丰富度(即DGGE条带数)和香农指数无显著影响(P＞0.05)，但以苜蓿草粉为纤维源的肉兔盲肠菌群均衡指数极显著高于以稻壳粉为纤维源的肉兔(P＜0.01)。CF水平对盲肠菌群丰富度和香农指数有显著影响(P＜0.05)，其中16%CF水平组的数值均为最高。纤维源及CF水平的交互作用对盲肠菌群多样性无显著影响(P＞0.05)。
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表 4 饲粮纤维源及CF水平对肉兔盲肠菌群多样性的影响 Table 4 Effects of dietary fiber source and CF level on cecal microbial diversity of meat rabbits |
兔对纤维的消化主要取决于盲肠微生物活性、食糜在盲肠的停留时间及纤维的化学组成及结构[1]。李清宏等[8]表明，獭兔对以苜蓿草粉为主要纤维源的配合饲料的CF及CP的消化率(分别为28.77%、82.94%)显著高于以玉米秸和大豆秸秆为主要纤维源的配合饲料，但3种纤维源对獭兔粗脂肪(EE)、NDF和ADF的消化率无显著影响。本研究表明，除CP以外，苜蓿草粉组饲粮各主要营养物质的消化率均显著高于稻壳粉组，而稻壳粉组饲粮CP的消化率则极显著高于苜蓿草粉组，与以上报道不完全一致，推测可能与稻壳粉组肉兔空肠和十二指肠胰蛋白酶的活性高于或显著高于苜蓿草粉组有关。CF水平对DM、NDF、ADF的消化率有显著影响，低CF水平(12%)组肉兔DM、能量的消化率及ADE显著高于中、高CF水平(14%、16%)组，但NDF、ADF的消化率则呈现出“两端(12%、16%CF)高，中间(14% CF)低”的变化趋势。这与何仁春等[9]报道的12%CF水平对2月龄肉兔饲粮CF及能量的消化率显著高于10%、14%CF水平，即“两端低中间高”的结果不一致。此结果与兔的日龄和纤维源的化学组成有关，本试验中14% CF水平饲粮中的ADL含量高于12%和16%CF饲粮(表 1)，较高的ADL含量影响了食糜的通过率及纤维的发酵[1]。可见，不同纤维源由于其纤维的具体组成成分不同，即使CF水平相同，其消化率也有差别；同时也说明肉兔对饲粮养分，尤其是纤维的消化率并未随饲粮CF水平的提高呈线性变化。因此，对肉兔纤维营养的研究仍然有待深入，以确定组成纤维素和半纤维素基本单位对于其消化率的影响。本研究表明，提高饲粮中CF水平会降低能量的消化率，与乔建国等[10]的结果一致，主要是由于CF水平升高会加重消化道的负担，还可在盲肠内形成较多的乙酸及较少的丙酸和丁酸，丁酸抑制肠蠕动的作用降低，使得肠道兴奋性增强，蠕动加快，导致饲粮在盲肠内的停留时间短，营养物质消化率低[11]。另外，饲粮中的可溶性纤维具有增加食糜黏度、减少食糜与消化酶的接触、阻碍养分吸收等作用。因此，在配制饲粮时，应根据家兔品种、生理阶段、纤维品质等来调整CF水平。
3.2 饲粮纤维源及CF水平对肉兔肠道消化酶活性的影响兔肠道营养物质的消化主要依赖体内消化酶的作用。兔消化系统的酶谱与其他单胃动物相似，其自身能分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，但不能分泌纤维素酶。饲料中的纤维素只能靠肠道微生物产生的纤维素酶消化利用，纤维性物质在盲肠经细菌发酵，被分解为挥发性脂肪酸经肠壁吸收作为能量来源。
肠道内容物中胰蛋白酶活性被认为是反映机体蛋白质消化能力的一个较好的指标。崔文典[12]研究表明，幼兔肠道内容物中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性随饲粮CF水平(10%、12%、14%)的提高而降低。晁洪雨等[13]报道，随着ADF水平的增加，3月龄肉兔肠道胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶活性有先增加后降低的趋势。此外，肉兔盲肠纤维素酶活性随饲粮CF水平的提高而提高[12-13]。本研究表明，16%CF水平显著提高了肉兔空肠胰蛋白酶的活性，极显著提高了盲肠纤维素酶活性。而12%CF水平组肉兔空肠淀粉酶、胰蛋白酶活性及盲肠纤维素酶活性显著低于14%、16%CF水平组。可见，有关CF水平对盲肠纤维素酶活性的影响所有报道都一致，主要是因为纤维到达盲肠和结肠中，在肠道微生物作用下被分解成挥发性脂肪酸(VFA)，VFA为纤维素分解菌提供了能量，从而增加了盲肠内纤维素分解菌的数量和活性。因此，在配合肉兔饲粮时，可考虑适当提高饲粮的CF水平或选择使用更高纤维含量的饲料原料，以降低饲养成本。杨桂芹等[14]的关于纤维源及CF水平对肉兔生长性能的影响的研究结果也证实了这一点。而有关CF水平对肠道淀粉酶及蛋白酶活性的影响相关报道不完全一致，主要与各研究中所使用的纤维源和CF水平变异较大，其中的可溶性和不溶性纤维的比例存在差异有关。本研究表明，与苜蓿草粉相比，以稻壳粉为纤维源极显著提高了肉兔十二指肠胰蛋白酶活性，这可能与稻壳粉组饲粮中的不溶性纤维含量高，促进了消化液的分泌有关，也可能是兔肠道消化酶对饲料中的纤维表现出了“适应性的分泌”，这有待于进一步研究和证实。
3.3 饲粮纤维源及CF水平对肉兔盲肠菌群多样性的影响盲肠作为饲粮纤维消化的主要场所，是利用微生物产生的酶或微生物的代谢产物来分解CF。在正常状况下，有益菌占绝对优势，细菌间形成一种相当稳定的复杂生态系统。盲肠细菌的种类、数量及其平衡性是肉兔消化机能健康与否的重要标志，也是消化道结构和机能正常与否的重要体现。
PCR-DGGE技术是一种快速可靠的比较菌群多样性以及群落变化的方法，其中依据Cs构建的系统发育树能够直观形象地反映不同样本间菌群的相似程度，也可反映该样品中微生物群落组成相对于其他样品的特异性。本研究中各样本间盲肠菌群相似性很低，无明显的聚类规律，说明不同组间及重复间肉兔盲肠微生物群落结构组成差异较大。这与朱岩丽[15]测定的生长肉兔个体间肠道菌群结构有较大的差异的结果一致。因此，在今后有关兔的肠道菌群研究上需适当增大样品数量，以增强其代表性。Michelland等[16]研究表明，降低饲粮ADF水平(20.4% vs. 10.7%)会改变生长肉兔盲肠微生物组成和细菌种属的相对丰度，但不改变其多样性。本研究表明，高CF水平(16%)显著提高了肉兔盲肠菌群丰富度和多样性，与以上报道不完全一致，这与纤维源的组成有关；但与刘蓓一[17]报道的随着纤维水平的提高，鹅盲肠微生物的种类也增加的结果一致。
Awati等[18]研究表明，饲粮种类不同，兔肠道微生物区系组成不同，其中饲粮纤维起着重要的作用。De Filippo等[19]报道，吃富含纤维类食物的非洲儿童的粪便菌群中拟杆菌门(Bacteroidetes)比例高，厚壁菌门(Firmicutes)比例低，而摄入高蛋白质低纤维食物的欧洲儿童的粪便菌群中则缺乏Bacteroidetes。Matsui等[20]认为，含有Bacteroidetes丰富的盲肠，其发酵作用更强。谷子林等[21]研究表明，饲粮CF水平(7%、9%、12%、14%)对断乳仔兔盲肠微生物数量有较大影响，以12%CF水平组有益菌的数量占有绝对优势；过高和过低的CF水平，尤其是过低CF水平会导致有益菌数量大幅度降低，有害菌(大肠杆菌、沙门氏菌)数量增高。可见，在实际生产中可逐步提高饲粮中的CF水平，通过微生物区系对底物的适应能力来提高兔对纤维类饲料的利用率。
4 结 论① 苜蓿草粉组肉兔DM、CF、ADF、ADL的消化率显著或极显著高于稻壳粉组；12% CF水平组肉兔DM、NDF、ADF的消化率显著高于14%CF水平组，而能量的消化率及ADE极显著高于14%、16%CF水平组。
② 稻壳粉组肉兔十二指肠胰蛋白酶活性极显著高于苜蓿草粉组；CF水平越高，肉兔空肠淀粉酶、胰蛋白酶活性和盲肠纤维素酶活性越高。
③ 纤维源对肉兔盲肠菌群均衡指数有显著影响；16%CF水平显著提高了肉兔盲肠菌群的丰富度和多样性。
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谷子林, 李江, 张玉华, 等. 日粮粗纤维水平对断乳力克斯兔腹泻率、消化道pH和盲肠菌群的影响[J]. 中国农学通报, 2008 , 24 (2) :21 –25.
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