2. 湖南农业大学, 动物科学技术学院, 畜禽遗传改良湖南省重点实验室湖南农业大学动物科学技术学院 畜禽遗传改良湖南省重点实验室, 长沙 410128
, JIE Hongdong2, LUO Ling2, WANG Kaijun2, ZHOU Chuanshe1
, ZHANG Peihua2, KONG Zhiwei1, TANG Shaoxun1
2. Hunan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal, College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
氧化应激(oxidative stress, OS)是断奶家畜常见的机体状态，是导致断奶家畜生产遭受损失的重大原因之一[1]。近年，畜牧业集约化生产程度虽不断提高，但是由于家畜断奶后采食量的迅速下降后再上升，导致胃肠道内血流量大量减少后再升高，进而出现“缺血再灌注”的现象，并伴随产生大量的过氧化氢(H2O2)，H2O2再通过Fenton反应和Haber-Weiss反应产生大量的氧化自由基，对胃肠组织细胞造成损伤[2-5]。同时饲粮中多饱和脂肪酸含量过高、矿物元素(硒、锌、锰等)缺乏、环境冷热变化、电离辐射、药物和疫苗大量使用等都会使组织细胞内抗氧化防御系统受损，使断奶家畜处于氧化应激状态[6]。
H2O2可使细胞发生氧化应激，导致细胞进入内源性凋亡和/或线粒体凋亡途径。如Bcl-2家族的Bax、Bak凋亡前体蛋白被激活，导致线粒体膜发生易位，但同时Bcl-2抗凋亡蛋白与被激活的凋亡前体蛋白形成异聚体，进而抑制线粒体膜的损伤[7-8]。此外，Bcl-2可抑制细胞色素C(Cty C)的释放[9]，阻止脱氧三磷酸腺苷(deoxyadenosine triphosphate, dATP)和凋亡蛋白酶激活因子(apoptosis totic protease activating factor-1, Apaf-1)在胞质内形成混合物[10]，进而抑制半胱天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9的激活，并阻止下游的caspases-3和caspases-7的激活，最终抑制凋亡的发生[11]。
随着畜牧业集约化生产和动物保健意识的不断成熟，一些实际生产问题有了深入认识。因此，了解氧化应激的概念、机制、内外因素作用的机理等，可使营养物质[如谷胱甘肽(GSH)、维生素E、谷氨酰胺(Gln)、镁(Mg)、硒(Se)、维生素C及活性物质二氢杨梅素和茶多酚等外源性抗氧化活性物质]得到更好的应用[12-13]。
饲料中适量添加Gln、丙氨酰谷氨酰胺(alanyl-glutamine, Ala-Gln)和甘氨酰谷氨酰胺(glycyl-glutamine, Gly-Gln)的对过氧化应激损伤具有一定的保护作用[12]。但在饲料工业化生产过程中，Gln的添加量较大、吸收率较低、水溶性较低、稳定性较差和易产生有害物质(焦谷氨酸和氨)，所以Gln未在实际生产中得到广泛的应用[14]。但随着人们对二肽及动物胃肠道对二肽消化吸收特点认识的不断提高，作为Gln供体物质的Ala-Gln和Gln替代品的Gly-Gln可弥补Gln单体的缺陷[15]。此外，已成为人类营养研究领域研究热点的Ala-Gln和Gly-Gln，在临床医学的全肠胃外营养(TPN)中的研究逐渐成熟，为Ala-Gln和Gly-Gln二肽在饲料生产中广泛的应用提供了理论支撑[16]。
因此, 本试验以H2O2诱导山羊瘤胃上皮传代细胞氧化应激，研究Gln、Gly-Gln和Ala-Gln对细胞凋亡及Bcl-2、Bax基因表达的影响，为研究山羊瘤胃上皮细胞营养代谢和氧化应激机制之间相互关系提供一定的试验参考。
1 材料与方法 1.1 山羊瘤胃上皮传代细胞试验动物为3只60日龄健康的湘东黑山羊，体重为(6.4±0.8) kg。颈静脉放血致死，取出瘤胃组织，去掉内容物后用生理盐水反复冲洗干净，待用于样品采集。
当山羊瘤胃上皮原代细胞长满培养皿的80%~90%时，弃去DMEM/F12完全培养液[含5%胎牛血清(FBS)、10%双抗、0.1 mg/mL庆大霉素、2.5 μg/mL两性霉素B]，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞1~2次后，加入1 mL的含0.25%胰蛋白酶(trypsin)+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的消化液，放入含5% CO2的37 ℃培养箱中消化2~3 min。放在倒置显微镜下观察细胞开始变亮、变圆时，迅速用含DMEM/F12完全培养液终止消化。将贴壁的细胞吹打为悬液，转移到15 mL离心管中，在4 ℃离心机中94×g离心5 min，弃去上清液，加入1 mL的DMEM/F12完全培养液重悬细胞，以1 : 2进行传代。在含5% CO2的37 ℃培养箱中培养30 min后，转移含细胞的DMEM/F12完全培养液至培养皿中继续培养，重复1次，此步为纯化过程。
1.2 主要试剂与设备细胞培养试剂：胎牛血清(FBS)、DMEM/F12、0.25% trypsin+0.02% EDTA、青霉素均购自Gibico公司；两性霉素B+庆大霉素(gentamicin/amphotericin solution)购自Thermo公司；Gln、Gly-Gln和Ala-Gln均购自Abcam公司。
PCR相关试剂：逆转录试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；EDTA、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、二溴乙烷(EB)购自Sigma公司；Trizol购自Invitrogen公司；Taq酶、DL2000 DNA marker、dNTP购自Genstar公司；引物购自南京金斯瑞生物科技公司；SYBR Green PCR Mix购自Invitrogen公司；常规化学试剂购自北京化学试剂公司。
台式冷冻离心机购自Eppendorf公司；实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)仪购自Thermo公司；电泳仪购自Bio-Rad公司；水平琼脂糖电泳槽购自北京六一仪器厂；精密pH计购自雷磁仪器厂；电动玻璃匀浆器购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 主要溶液与配制主要溶液有：还原型5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液；电泳液缓冲液；转膜缓冲液；TBS缓冲液；TBST缓冲液；5×TBE溶液；RNase A母液(10 mg/mL)；Agarose凝胶；无酶水。
H2O2的稀释：H2O2用无菌、无霉水稀释至终浓度分别为100、400、800 μm/L。
1.4 试验设计 1.4.1 H2O2诱导凋亡瘤胃上皮细胞的凋亡率取第4代后对数期生长细胞，消化后按1×106个/孔接种于6孔板中，培养12 h后，吸弃培养基，PBS洗2次，加入2 mL不含PBS的新鲜培养基，分为4组，分别添加0(对照)、100、400和800 μmol/L H2O2，继续培养24 h。
1.4.2 Gln及其二肽对H2O2诱导凋亡瘤胃上皮细胞Bcl-2、Bax基因表达量的影响细胞选择和前期处理同1.4.1，细胞分为5组，对照组和1组分别添加0、800 μmol/L H2O2，2组、3组、4组均添加800 μmol/L H2O2，同时分别添加17.28 mmol/L Gly-Gln(2组)、16.0 mmol/L Gln(3组)、16.0 mmol/L Ala-Gln(4组)。
1.5 试验方法 1.5.1 流式细胞(flow cytometry, FCM)技术检测瘤胃上皮细胞凋亡率[膜联蛋白-V(annexin V，AV)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)双染法]山羊瘤胃上皮传代细胞培养于含5% FBS的DMEM/F12中，收集培养24 h的传代细胞进行凋亡检测，每组重复3次。步骤如下：1)用不含EDTA的trypsin消化液消化，并收集山羊瘤胃上皮传代细胞；2)用PBS洗涤细胞2次，每次376×g离心5 min，收集1×105～5×105个细胞；3)加入500 μL的结合缓冲液(binding buffer)悬浮细胞；4)加入5 μL细胞凋亡检测试剂[AV-异硫氰酸荧光素(FITC)凋亡检测试剂盒]混匀后，加入5 μL PI，混匀；5)室温、避光，反应5～15 min；6)1 h内，上BD FACSCalibur流式细胞仪观察检测。
1.5.2 Gln及其二肽对H2O2诱导凋亡瘤胃上皮细胞Bcl-2、Bax基因表达的影响 1.5.2.1 总RNA提取 1.5.2.1.1 试验前准备将所有提取总RNA所需器械及耗材浸泡于提前配制好的1% DEPC水中过夜，第2天将器械和耗材用报纸包好，121 ℃ 60 min湿热灭菌。
1.5.2.1.2 Trizol提取细胞总RNA总RNA提取步骤如下：1)向细胞中加入1 mL Trizol充分吹打，混匀后室温裂解3 min；加入0.2倍体积的三氯甲烷，振荡，室温静置3~5 min。2)12 000×g低温离心15 min，取上层液相，加入等体积的异丙醇，-20 ℃静置20 min。3)12 000×g低温离心15 min，去上清，沉淀中加入1 mL 75%乙醇(无菌1% DEPC水配制)，振荡混匀。4)12 000×g低温离心5 min，去上清，空气干燥5~10 min。加入40 μL无菌1% DEPC水溶解沉淀得到总RNA溶液。5)紫外分光光度计测定总RNA浓度，吸取2 μL总RNA溶液于石英比色皿中，用无酶水定容至100 μL，在260与280 nm处测其吸光度值(A)，并计算其浓度及纯度(要求达到1.8~2.0), 公式如下：
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将配制好的1%变性琼脂糖凝胶加热至琼脂糖溶解，再冷至60 ℃, 加入0.5 μL EB(10 mg/mL)，混匀后倒入事先用灭菌1% DEPC水处理的电泳槽中；取2 μL提取的总RNA，按1 : 5的比例与上样缓冲液混匀，170 V恒压电泳，溴酚蓝前沿迁移至凝胶总长2/3处停止电泳；凝胶成像系统下观察。
1.5.2.1.4 反转录PCR反转录PCR体系(30 μL):dNTP(2.5 mmol/L) 6 μL、Primer Mix 3 μL、总RNA 6 μL、5×RT Buffer 6 μL、二硫苏糖醇(DTT)0.1 mmol/L 3 μL、HiFiScript(200 U/μL) 1.5 μL、无RNA酶水4.5 μL。
1.5.2.2 FQ-PCR 1.5.2.2.1 引物设计在NCBI上搜索目的基因的序列，运用Primer 5软件设计引物，由南京金斯瑞生物科技公司合成引物，引物参数见表 1。
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表 1 引物参数 Table 1 Primer parameters |
FQ-PCR体系(30 μL)：模板(反转录产物)1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，水13 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 15 μL。每个样品3个重复，每孔(10 μL)为1个重复。
1.5.2.2.3 FQ-PCR扩增程序扩增程序如下：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45个循环。
1.6 数据统计与分析细胞凋亡应用BD FACSCalibur流式细胞仪采集数据，并用Flowjo软件进行图像分析。试验数据用SAS 9.2统计分析，统计差异显著性水平定义为P＜0.05，P＞0.05则无显著差异。
2 结果与分析 2.1 H2O2诱导凋亡瘤胃上皮细胞的凋亡率由表 2可以看出，与对照组相比，当H2O2浓度增加到800 μmol/L时，早期凋亡的凋亡率显著增加(P＜0.05)；而晚期凋亡的凋亡率随着H2O2浓度的增加呈现增加后减少的趋势，但试验组相对于对照组，都呈显著增加(P＜0.05)。结果说明，H2O2可以诱导山羊瘤胃上皮细胞凋亡加剧。
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表 2 H2O2诱导凋亡瘤胃上皮细胞的凋亡率 Table 2 Apoptosis rate of ruminal epithelial cells with apoptosis induced by H2O2 (n=3) |
由表 3可以看出，与对照组相比，4组晚期凋亡的凋亡率显著增加(P＜0.05)，1组、3组晚增加，2组降低，但差异均不显著(P>0.05)；与对照组相比，试验组早期凋亡的凋亡率均显著增加(P＜0.05)，而2组为试验组中最低。结果说明，Gly-Gln可缓解H2O2对山羊瘤胃上皮细胞造成早期凋亡。
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表 3 Gln及其二肽对H2O2诱导凋亡瘤胃上皮细胞的凋亡率的影响 Table 3 Effects of Gln and its dipeptides on apoptosis ratio of ruminal epithelial cells with apoptosis induced by H2O2 (n=3) |
总RNA提取结果如图 3所示，提取的总RNA条带清晰，可用于FQ-PCR操作。
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图 3 部分总RNA电泳图 Figure 3 The electrophoretogram of partial total RNA |
由表 4可以看出，与对照组比较，试验组Bax、Bcl-2表达量分别显著升高和降低(P＜0.05)。与1组相比较，对照组、2组、3组和4组Bax表达量均显著降低(P＜0.05)；2组和4组Bcl-2表达量均显著增加(P＜0.05)；2组、3组和4组Bcl-2/Bax均显著增加(P＜0.05)，且2组显著高于3组、4组(P＜0.05)，试验组显著低于对照组(P＜0.05)。
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表 4 Gln及其二肽对H2O2诱导凋亡瘤胃上皮细胞Bcl-2、Bax基因表达量的影响 Table 4 Effects of Gln and its dipeptides on Bcl-2 and Bax gene expressions of ruminal epithelial cells with apoptosis induced by H2O2 (n=3) |
高浓度氧直接损伤瘤胃上皮细胞，促使细胞凋亡或使胃部疾病恶化。大量氧化自由基是引起细胞损伤的重要原因之一，缺血再灌注、药物代谢、金属中毒等会诱导细胞产生大量氧自由基[17]，而H2O2作为氧化自由基的主要成分，得到广泛的应用[18-20]。H2O2可导致细胞损伤的机制包括：损伤线粒体和耗竭ATP，氧化细胞内蛋白质和细胞脂质及引起DNA损伤，引起细胞凋亡等[21]。
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图 1 H2O2诱导凋亡瘤胃上皮细胞流式细胞技术检测结果 Figure 1 FCM results of ruminal epithelium cells with apoptosis induced by H2O2 |
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图 2 Gln及其二肽影响H2O2诱导凋亡瘤胃上皮细胞的流式细胞技术检测结果 Figure 2 FCM results of Gln and its dipeptides affected ruminal epithelial cells with apoptosis induced by H2O2 |
Gln及其二肽是具有特殊药理学、无毒副作用的非必需氨基酸[22]。Gln及其二肽可为胃肠上皮细胞、免疫细胞等分裂较快的组织细胞，提供合成氨基酸及蛋白质所需的氮源[23-24]，为维持黏膜细胞完整性和功能稳定性方面起重要作用[25]。现己发现Gln及其二肽具有减少疾病或应激状态下的过氧化损伤，其可能是通过减少氧化应激下的细胞凋亡，增强抗氧化酶防御作用、热休克蛋白的表达及诱导细胞自噬来发挥作用[26]。Gln及其二肽在是近20年来外科研究的热点，虽然在临床中已获得广泛应用[27-31]，但其对于H2O2诱导的山羊瘤胃上皮细胞凋亡的影响却鲜有报道。
减少H2O2诱导凋亡细胞凋亡率，对减轻过氧化应激对机体损伤，改善机体功能与状态具有非常重要的意义。因此，本试验对于山羊瘤胃上皮传代细胞的凋亡率进行检测，流式细胞技术检测结果说明，添加Gly-Gln可使H2O2对山羊瘤胃上皮细胞氧化应激损伤得到缓解。其机制可能是：1)具有添加量较小、吸收率较高、水溶性较高、稳定性较好和不易产生有害物质(焦谷氨酸和氨)等优点的Gln替代品Gly-Gln，更有助于提高与维持山羊瘤胃上皮细胞组织中GSH的含量，具有更强的抗氧化、抗凋亡的作用[32-33]。2)Gly-Gln比Gln和Ala-Gln更多地抑制活性氧群的移位，由于活性氧会直接或间接诱导山羊瘤胃上皮细胞凋亡，因此Gly-Gln一定程度上缓解了H2O2诱导山羊瘤胃上皮细胞凋亡。但Gln、Ala-Gln和Gly-Gln之间对山羊瘤胃上皮细胞氧化应激缓解机制有待进一步研究。
3.2 Gln及其二肽对H2O2诱导凋亡山羊瘤胃上皮细胞Bcl-2、Bax基因表达量的影响有研究发现，Bcl-2家族中促凋亡(Bcl-2)和抑凋亡基因(Bax)的比率决定了线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放程度，形成调控细胞凋亡的枢纽，因此认为调控细胞死亡的“可变电阻器(rheostat)”是Bcl-2/Bax[34]。在内外因素刺激下，Bcl-2和Bax 2种调控因子的平衡决定细胞了生命，而Bcl-2/Bax是决定细胞凋亡发生及凋亡程度的重要因素[35]。
本试验从细胞凋亡角度出发，在细胞传代培养试验的基础上，利用FQ-PCR针对Gln及其二肽对H2O2诱导凋亡山羊瘤胃上皮细胞Bcl-2、Bax基因表达情况进行检测，结果说明，H2O2能诱导山羊瘤胃上皮细胞凋亡，Gly-Gln可降低促凋亡基因Bax表达量，而抑制凋亡基因Bcl-2的增加，这与凋亡率的结果相一致。但是对于Gln、Gly-Gln和Aln-Gln影响Bcl-2和Bax基因表达的机制尚不清楚，有待进一步研究。可能由于Gln、Gly-Gln和Aln-Gln能增加GSH的含量[36]，或是Gln、Gly-Gln和Aln-Gln能增加细胞膜的稳定性，减轻H2O2过氧化损伤作用[37]。本试验结果显示，Gly-Gln和Aln-Gln二肽使H2O2诱导凋亡细胞的Bcl-2基因表达显著增加，这可能是一种机体代偿性反应。如果大量的细胞膜性结构被破坏，不能维持Bcl-2蛋白结构，机体代偿性反应不充分，而添加Gly-Gln和Aln-Gln二肽将使细胞膜性结构的破坏减轻，有助于膜上Bcl-2蛋白结构的稳定，促进代偿反应的发生。
4 结论Gly-Gln对H2O2引起山羊瘤胃上皮细胞早期凋亡具有一定的保护作用。
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