蜜蜂作为一种重要的经济昆虫，与畜禽等动物一样也存在营养需要。研究蜜蜂营养需要，制订科学合理的饲养标准，不但有利于蜜蜂的生长发育，增强蜜蜂抗病能力，而且有利于维持蜂群最佳生产状态，提高蜂产品的产量和质量^[1]。群势强是获取蜂产品高产的基础，而强群意味着蜜蜂(工蜂)多。强群需要2个基本要素，即蜜蜂繁殖快和寿命长，达到个体的高积累^[2]。因此，人工改善蜜蜂的营养条件，使蜜蜂的生存寿命加以延长，必然会给蜂农带来更高的经济收益。近年来，蜜蜂营养研究取得了阶段性成果，主要包括蜜蜂不同发育时期蛋白质、维生素A、维生素C、氨基酸、矿物质等营养需要，为养蜂饲料生产提供了重要参考资料^[3-17]。核黄素(riboflavin)又称维生素B₂，在动物机体内转化为黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，参与构成各种黄素酶的辅基，在生物氧化过程中作为递氢体，与糖、脂肪和蛋白质的代谢密切相关^[18]，是机体组织代谢和修护的必需营养元素。本研究旨在分析维生素B₂对中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂寿命及学习记忆能力的影响，为合理配制蜜蜂饲粮提供一定的理论数据。

1 材料与方法 1.1 试验动物

试验动物为江西农业大学蜜蜂研究所饲养的中华蜜蜂工蜂。

1.2 主要试剂及器材

维生素B₂(纯度≥98%，美国Supelco公司)，柠檬香精和香草香精(食品级，澳大利亚皇后食品公司)，蔗糖和氯化钠(分析纯，西陇化工股份有限公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC)水(索莱宝公司)，Trizol总RNA提取试剂盒和RNA酶抑制剂(北京全式金公司)，dNTP Mixture和Oligo(dT)由上海英杰公司合成，M-MLV反转录酶和荧光染料SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ购自TaKaRa公司。自制小木箱(11 cm×13 cm×15 cm)，生化培养箱(GZ-250-GSI型，韶关市广智科技设备发展公司)，定量PCR仪(iQTM2型，美国Bio-Rad公司)，核酸蛋白测定仪(NanoPhotometer^TM P300，德国Implen公司)。

1.3 试验设计 1.3.1 工蜂饲养试验

选取群势相同的中华蜜蜂4群，隔王控制蜂王产卵。将快要出房的封盖子放入恒温恒湿箱(34 ℃，相对湿度75%)中羽化。将刚羽化的1日龄工蜂平均分成3组，每组5个重复，每个重复约200只，放入恒温恒湿箱(34 ℃，相对湿度75%)中继续饲养。其中对照组(Ⅰ组)饲喂1：1的糖水，2个试验组在1：1糖水的基础上分别添加100(Ⅱ组)、400 mg/kg (Ⅲ组)的维生素B₂，各组糖水现用现配。每24 h更换1次食物，保证足够的食物。首次饲喂24 h后清除死亡的蜜蜂，之后统计每天死亡的蜜蜂数量并及时清除，直到蜜蜂全部死亡^[14]。

1.3.2 工蜂学习记忆试验

分组方法同工蜂饲养试验，并按照工蜂饲养方法对1日龄工蜂喂养7 d后，用干冰进行冷冻处理并固定在U型管中，放入恒温恒湿箱(37 ℃，相对湿度75%)中饥饿2 h。之后取出工蜂，剔除状态不佳的蜜蜂，再进行蜜蜂学习记忆训练与检测。蜜蜂训练时，分别用含有柠檬气味的糖水和香草气味的盐水对每只蜜蜂进行正刺激和负刺激，使蜜蜂将柠檬与糖水和香草与盐水联系起来。每只蜜蜂每隔6 min重复训练1次，共3次。蜜蜂训练后6和24 h分别进行短时记忆和长时记忆能力检测。先给予负刺激，再给以正刺激，检测蜜蜂伸吻情况，每只蜜蜂检测3次，并进行统计分析^[19-20]。

1.3.3 工蜂记忆相关基因相对表达量的测定 1.3.3.1 样品采集

采集工蜂学习记忆试验中正确伸吻的蜜蜂，每组采集20只，分别装入1.5 mL RNase-free的EP管迅速放入液氮中，用于后续检测。

1.3.3.2 总RNA的提取与cDNA的合成

每个组取4只蜜蜂，放入含液氮的坩埚中进行研磨，研磨成粉末后转入装有1 mL Trizol的1.5 mL的EP管中，然后对样品总RNA进行提取，提取的总RNA用核酸蛋白测定仪测定OD260/280值和RNA浓度，每个组测3次，取平均值。

用反转录试剂盒对总RNA进行反转录，反应体系为50 μL：8 μL总RNA，10 μL Buffer，8 μL dNTP Mixture，1.5 μL M-MLV反转录酶，3 μL Oligo(dT)，1 μL RNA酶抑制剂，18.5 μL DEPC水。反转录反应条件如下：体系混匀后，42 ℃反应60 min，75 ℃灭活5 min。反转录产物保存于-80 ℃。

1.3.3.3 荧光定量PCR引物的设计及荧光定量PCR

引物设计：参照从东方蜜蜂大脑组织中克隆的多巴胺受体基因2(Acdop2，登录号KC814691)、多巴胺受体基因3(Acdop3，登录号KC814692)和cAMP反应元件结合蛋白(AcCREB，登录号KC814690)的mRNA序列，用Primer 5.0软件设计引物序列(表 1)，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)和β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因。

荧光定量PCR反应体系(10 μL)：cDNA 1 μL，SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ 5 μL，上游、下游引物各0.4 μL，超纯灭菌水3.2 μL，混匀，放入定量PCR仪中进行扩增。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40个循环；之后50 ℃加热到90 ℃(每6 s升高1 ℃)建立熔解曲线，利用Bio-Rad CFX 2.1软件收集目的基因与内参基因的Ct值^[12]，通过qPCR package和Ct值计算每个技术重复的扩增效率，每个生物学样本包括3～5个技术重复，并参考Huang等^[21]的方法计算各个目的基因的相对表达量。

1.4 数据处理

用SPSS 20.0软件对试验数据进行统计分析，以P < 0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果 2.1 维生素B₂对中华蜜蜂工蜂寿命的影响

试验结果如表 2所示，工蜂的平均寿命随着维生素B₂添加量的升高而增加，而且试验组(Ⅱ组和Ⅲ组)的平均寿命显著高于对照组(P < 0.05)，但2个试验组之间差异不显著(P>0.05)。工蜂寿命的中位数也随着维生素B₂添加量的升高而增加。

2.2 维生素B₂对中华蜜蜂工蜂学习记忆能力的影响

试验结果如图 1所示，Ⅲ组工蜂的短时学习记忆和长时学习记忆能力均显著高于对照组和Ⅱ组(P < 0.05)，而且Ⅱ组工蜂的长时记忆能力也显著高于对照组(P < 0.05)。

2.3 维生素B₂对中华蜜蜂工蜂学习记忆相关基因相对表达量的影响

试验结果如图 2所示，Ⅲ组工蜂的Acdop3和AcCREB相对表达量均显著高于对照组和Ⅱ组(P < 0.05)，而且Ⅱ组的Acdop3相对表达量也显著高于对照组(P < 0.05)。2个试验组的Acdop2相对表达量与对照组差异不显著(P>0.05)。

3 讨论

蜜蜂营养对于蜜蜂正常生长与繁殖起着重要的作用，也一直受到广大蜂农的关注。蜂农经常在饲粮中添加各种维生素，其中包括维生素B₂。维生素B₂是自然界分布广泛的一种维生素，它能够参与构成各种黄素酶的辅基，在生物氧化过程中作为递氢体，与糖、脂肪和蛋白质的代谢密切相关。当蜜蜂生命周期中缺乏维生素B₂时，必然影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。本试验通过在饲粮中添加不同浓度的维生素B₂来分析维生素B₂对中华蜜蜂工蜂寿命及学习记忆能力的影响，结果发现中华蜜蜂工蜂的平均寿命随着维生素B₂添加量的增加而升高，主要原因在于维生素B₂参与了蜜蜂体内的生物氧化，提高体内糖、脂肪和蛋白质的代谢能力，有利于蜜蜂个体的生长发育，延长蜜蜂个体的寿命，从而增加了蜜蜂的群势，提高了蜜蜂的生产力。

蜜蜂的学习记忆能力与蜜蜂出巢试飞以及采集花蜜、花粉后的归巢能力密切相关。蜜蜂的记忆能力越强，其出巢后正确归巢能力就越强，从而能提高获取天然原料的能力，增加蜂产品的产量。本研究发现：Ⅲ组工蜂的短时学习记忆和长时学习记忆能力均显著高于对照组和Ⅱ组，而且Ⅱ组工蜂的长时学习记忆能力也显著高于对照组，说明维生素B₂能提高蜜蜂的学习记忆能力，而且以高浓度维生素B₂的效果更好。另外，学习记忆是一种行为过程。AcCREB的主要功能是调节特定基因的转录，增强细胞间的联系，影响神经元的发育和再生，并参与机体内记忆能力^[22]。多巴胺是动物中枢神经系统内重要的神经递质，参与调控昆虫的多种行为和生理过程，包括学习记忆等，其中，Acdop3激活后能引起脑部环磷酸腺苷(cAMP)的变化，引起记忆的产生^[23]。本研究发现：Ⅲ组工蜂记忆相关基因Acdop3和AcCREB的相对表达量均显著高于对照组和Ⅱ组，而且Ⅱ组的Acdop3相对表达量也显著高于对照组，说明维生素B₂影响着蜜蜂习记忆相关基因的表达，而且饲喂高浓度维生素B₂饲粮的蜜蜂的记忆相关基因的相对表达量最高，这与蜜蜂学习记忆能力结果一致，进一步说明蜜蜂饲粮中维生素B₂的浓度影响着蜜蜂学习记忆相关基因的表达以及其学习记忆能力。另外，2个试验组和对照组蜜蜂的Acdop2相对表达量差异不显著，可能是该基因的表达与蜜蜂的运动行为有关，具体原因有待于进一步研究与分析。

4 结论

维生素B₂影响中华蜜蜂工蜂的寿命及学习记忆能力，在日常饲喂蜂群时需要提供适量的维生素B₂。