2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306
2. College of Fishers and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
圆斑星鲽(Verasper variegates)是我国北方的名贵海水鱼类，其肉质鲜美，营养价值高，富含人体必需的氨基酸及不饱和脂肪酸[1]，具有很高的经济价值。磷虾资源量丰富，是世界海洋生物储备量最大的生物之一，开发潜力巨大，被认为是地球上最大、也是最后一个蛋白质库[2]。南极磷虾粉氨基酸平衡性高，不饱和脂肪酸含量高，富含胡萝卜素和虾青素，对动物体的生长、免疫力[3]和体色[4-6]有积极的影响。近年来，有关饲料中添加南极磷虾粉的研究很多，主要集中在大西洋鲑(Salmo salar)[7-10]、大西洋鳕(Gadus morhua)[11-12]、大黄鱼(Larimichthy croceus)[6]、珍珠龙胆石斑鱼(♀Epinephelus fuscoguttatus×♂Epinephelus lanceolatu)[13]和点带石斑鱼(Epimephelus malabaricus)[14]上，而在鲆鲽鱼类中的应用仅在大菱鲆(Scophthalmus maximu)[15]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gunthe)[15]大西洋庸鲽(Hippoglossus hippoglossus)[12]和星斑川鲽(Platichthys stellatus)[13]中有报道，南极磷虾粉对圆斑星鲽的影响还未见报道。在之前的研究中，本课题组定性的评价了南极磷虾粉作为鲽形目鱼饲料蛋白质源的营养价值[16]，而圆斑星鲽作为鲽形目中的代表性鱼类，本试验着重定量的评价南极磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽幼鱼生长性能、肝脏和血清生化指标及血清非特异性免疫指标的影响，以期为南极磷虾粉在鲽形目鱼饲料中的应用提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验饲料以鱼粉和玉米蛋白粉为蛋白质源，高筋粉为糖源，鱼油、豆油和磷脂为脂肪源配制基础饲料。以南极磷虾粉分别替代基础饲料中0(对照)、10%、20%、30%、40%、50%的鱼粉，配制6种等氮等脂的试验饲料，并分别记为R0、R10、R20、R30、R40和R50。以南极磷虾粉替代鱼粉后，南极磷虾粉中的油脂含量高于鱼粉，通过鱼油和豆油将6种试验饲料的粗脂肪含量调至8%左右，因此随着替代水平的逐渐升高，饲料配方中鱼油和豆油的比例逐渐下降。试验饲料组成及营养水平见表 1。对所有原料进行营养成分测定后，粉碎机粉碎过100目筛，按配方比例混合，最后将磷脂溶于鱼油和豆油中与其他原料混合，加35%的水搅拌，然后用制粒机制成直径为3 mm的颗粒饲料，鼓风烘干12~14 h，将制得的饲料保存在-20 ℃的冷库中。
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表 1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
试验用圆斑星鲽幼鱼取自山东省烟台市天源水产有限公司，挑选体格健壮、规格一致的同一批鱼种，初始体重为(38.16±0.11) g，随机分配到18个53 cm×72 cm×60 cm的塑料桶中，每种饲料投喂3个桶(重复)，每桶30尾。试验开始前使用对照组饲料暂养1周，使之适应配合饲料。养殖期间，水温控制在14 ℃左右，盐度为35左右，溶解氧浓度在5.5 mg/L左右。试验持续50 d，每天08：30换水1次，14：00饱食投喂1次，投喂0.5 h后使用虹吸管吸取残饵，烘干称重，每天记录摄食量。
1.3 样品收集与分析试验结束后，采样前将试验鱼饥饿24 h，对每桶鱼进行计数、称重。每桶随机取5尾鱼，尾静脉取血3 mL左右，用体积分数为1%的肝素钠抗凝，低温放置4 h后4 000 r/min离心10 min，然后解剖分离内脏团和肝脏并称重，用于计算肝体比和脏体比。分离的血清用于总蛋白(total protein，TP)含量及谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT)、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，GPT)、溶菌酶(lysozyme，LZM)、酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性的测定；分离的肝脏用于谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，GDH)、GOT和GPT活性的测定。
饲料样品在105 ℃烘干后采用凯氏定氮法测得粗蛋白质含量(VELP，UDK-142 Automatic Distillation Unit，意大利)；采用索氏抽提法(石油醚为抽提液)测得饲料样品的粗脂肪含量(SOXTEC-2050 FOSS脂肪测定仪，瑞典)；将饲料样品在马弗炉(550 ℃)中灼烧6 h测得粗灰分含量。血清中总蛋白含量及GOT、GPT、GDH、LZM、ACP和AKP活性以及肝脏中GDH、GOT和GPT活性采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定。
1.4 计算公式
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试验数据采用Excel 2010和SPSS 17.0软件进行统计分析，差异显著时采用Duncan氏法进行多重比较，显著水平为P < 0.05，数据以平均值±标准误(mean±SE)表示。
2 结果 2.1 南极磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽幼鱼生长性能的影响南极磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽幼鱼生长性能的影响如表 2所示。随着南极磷虾粉替代水平的升高，增重率呈现先升高后降低的趋势，R30组的增重率最高，显著高于除R40组外的其他各组(P < 0.05)；饲料效率也呈现先升高后降低的趋势，其中对照组和R20、R50组的饲料效率没有显著差异(P > 0.05)，其他各组均显著高于对照组和R50组(P < 0.05)。南极磷虾粉替代鱼粉会提高圆斑星鲽幼鱼的死亡率，其中R50组的死亡率最高，为13.67%，显著高于其他各组(P < 0.05)，其他组间无显著差异(P > 0.05)。南极磷虾粉替代鱼粉水平对圆斑星鲽幼鱼的肝体比和脏体比没有产生显著影响(P > 0.05)。
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表 2 南极磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽幼鱼生长性能的影响 Table 2 Effects of Antarctic krill meal replacing fish meal on growth performance of juvenile spotted halibut |
南极磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽幼鱼血清和肝脏生化指标的影响如表 3所示。R10和R30组的血清总蛋白含量显著高于对照组(P < 0.05)，其余各组显著低于对照组(P < 0.05)。与对照组相比，南极磷虾粉替代鱼粉水平低于或等于30%时对血清中GOT、GPT活性无显著影响(P > 0.05)，南极磷虾粉替代鱼粉水平为40%和50%时血清中GOT、GPT活性显著降低(P < 0.05)。肝脏中GPT活性随着南极磷虾粉替代水平的升高有降低的趋势，除R50组外，其余各组均显著高于对照组(P < 0.05)。肝脏中GOT活性R30组与对照组无显著差异(P > 0.05)，其余各组均显著低于对照组(P < 0.05)。R30组肝脏中GDH活性最高，显著高于除对照组外的其余各组(P < 0.05)。
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表 3 南极磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽幼鱼血清和肝脏生化指标的影响 Table 3 Effects of Antarctic krill meal replacing fish meal on serum and liver biochemical indices of juvenile spotted halibut |
南极磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽幼鱼血清非特异性免疫指标的影响如表 4所示。各替代组血清中LZM和ACP的活性均显著高于对照组(P < 0.05)；此外，除R10组外，其余各组血清中AKP活性均显著高于对照组(P < 0.05)。
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表 4 南极磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽幼鱼血清非特异性免疫指标的影响 Table 4 Effects of Antarctic krill meal replacing fish meal on serum non-specific immune indices of juvenile spotted halibut |
本试验中，南极磷虾粉替代10%~40%的鱼粉可以提高圆斑星鲽幼鱼的增重率和饲料效率。关于磷虾粉在不同鱼类饲料中的应用已经有大量报道，部分研究结果表明，磷虾粉替代高水平的或全部的鱼粉可能会导致鱼体的生长性能和饲料效率下降[8, 17]，磷虾粉替代中等水平的鱼粉可能对水产动物的生长无不利影响或有一定的促进作用，例如，有报道指出以南极磷虾粉替代大西洋鲑饲料中40%的鱼粉及以南极磷虾粉替代大西洋庸鲽饲料中60%的鱼粉能够显著提高鱼体的特定生长率[18]；此外，研究认为4%的磷虾粉对点带石斑鱼有一定的促生长和促摄食作用[14]；孔凡华[15]也指出以磷虾粉替代20%~60%的鱼粉对大菱鲆的生长性能无不利影响。本试验中，随着南极磷虾粉替代水平的升高，圆斑星鲽幼鱼的增重率和饲料效率均出现先升高后降低的现象，饲喂南极磷虾粉替代30%鱼粉饲料的圆斑星鲽幼鱼有最好的生长性能，但是饲喂南极磷虾粉替代50%鱼粉饲料的圆斑星鲽幼鱼的死亡率显著升高，这和魏佳丽[13]得出的磷虾粉替代鱼粉的水平超过30%时星斑川鲽的生长性能下降的研究结果一致。Yoshitomi等[19]也发现磷虾粉完全替代鱼粉对黄尾鲺(Seriola quinqueradiata)的生长会产生不利的影响。而Hansen等[8]报道，以磷虾粉完全替代鱼粉会导致大西洋鲑的生长率显著下降，但是去壳的低氟磷虾粉可以显著提高鱼体的生长性能。本试验中，南极磷虾粉中的氟含量较高，可达(1 642.80±31.78) mg/kg，随着南极磷虾粉的替代水平的升高，饲料中氟含量也会升高，替代水平为50%的组的生长性能和饲料效率下降、死亡率升高可能是由于高含量的氟造成的，因为过量的氟对鱼体有毒害作用。此外，磷虾粉中还含有大量的几丁质，在某种程度上几丁质几乎不能被鱼体吸收利用，还可降低鱼体的消化率[20-21]。鱼体的肝体比和脏体比不受饲料中南极磷虾粉替代水平的影响，这与魏佳丽[13]的研究结果一致。关于磷虾粉在不同鱼类饲料中的替代水平不一和效果各异，可能与试验鱼的种类、食性和生活环境等有关，具体的原因还需进一步的研究。
3.2 南极磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽幼鱼血清和肝脏生化指标的影响血清总蛋白的主要功能是维持渗透压平衡，同时是蛋白质代谢水平的重要指标，可反映机体蛋白质和氨基酸的消化吸收程度[22]，血清中总蛋白含量增多，能够增强动物体内的代谢，对合成蛋白质和氮沉积有利，对免疫能力也有促进作用[23-24]。R10和R30组的血清总蛋白含量显著高于对照组，说明饲料中适宜水平的南极磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼的蛋白质利用有一定的促进作用。GOT和GPT主要存在于肝脏中，正常情况下血清中这2种酶的活性很低，当组织细胞受损细胞膜通透性发生改变时才会进入血液，进而活性升高，因此血清中GOT和GPT的活性可反映肝脏的损伤情况[25]。R10、R20和R30组圆斑星鲽幼鱼血清中GPT和GOT活性与对照组没有显著差异，说明南极磷虾粉替代10%~30%的鱼粉没有对圆斑星鲽幼鱼的肝脏造成损伤和代谢负担。
GDH是非必需氨基酸合成的关键酶，其活性与蛋白质的合成与分解有密切关系[26]。饲料氨基酸主要通过转氨基作用和脱氨基作用在体内代谢转化，鱼类则主要通过联合脱氨基作用满足机体需要，GPT和GOT是氨基酸代谢中的2个关键酶，它们的活性大小不仅反映了氨基酸代谢程度的强弱，而且反映肝脏功能的正常与否[27]。本试验中，各替代组圆斑星鲽幼鱼肝脏中GDH活性与对照组没有显著差异，说明南极磷虾粉对鱼体的蛋白质代谢无不利的影响，而R30组圆斑星鲽幼鱼肝脏中GOT和GDH活性均在最高的水平，说明R30组的圆斑星鲽幼鱼蛋白质代谢最快，而且肝脏无损伤；而R40组肝脏中GOT活性较之对照组显著降低，且R50组肝脏中GPT活性显著低于其他各组，说明过高的替代水平可能会降低鱼体的蛋白质代谢水平，并且影响肝脏功能。
3.3 南极磷虾粉替代鱼粉对圆斑星鲽幼鱼血清非特异性免疫指标的影响水生动物的特异性免疫机制不具备抗体生成的二次反应，非特异性免疫在水生动物的免疫防御中扮演着最为重要的角色。LZM能够对细菌的细胞壁造成损害，其活性大小可在一定程度上反映机体抵御细菌侵袭的能力[28]。ACP作为溶酶体的标志酶，主要参与磷酸酯的代谢调节、信号传导以及能量转化等[29]，而AKP可直接参与生物体磷酸集团的转移和代谢[30-31]。本研究中，各替代组血清中LZM的活性均显著高于对照组，这与孔凡华[15]研究得出的半滑舌鳎血清中的LZM活性随着磷虾粉水平的升高而显著升高的结果相一致。同时，各替代组血清中ACP和AKP的活性也有升高的趋势，说明南极磷虾粉对圆斑星鲽幼鱼血清中的ACP和AKP的活性有提高作用，进而提高机体的非特异性免疫力，这可能与南极磷虾粉富含胡萝卜素和虾青素[3]有关，虾青素可以提高机体的免疫力和抗氧化能力[4, 32]，已有的研究曾报道饲料中的虾青素可以显著提高大黄鱼的免疫力和抗氧化能力[33]，并可以改善虹鳟(Oncorhynchus mykiss)血清防御素含量和LZM活性等[3]。
4 结论① 南极磷虾粉替代鱼粉可以提高圆斑星鲽幼鱼的增重率和饲料效率，替代水平为30%时生长性能和饲料效率较好，但替代水平大于40%时会降低鱼体的存活率。
② 南极磷虾粉替代10%~30%的鱼粉对圆斑星鲽幼鱼的肝脏功能和蛋白质代谢无不利影响，同时可以提高圆斑星鲽幼鱼的非特异性免疫力。
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