锌是动物所必需的微量元素，它能促进骨骼发育，提高免疫性能[1]，并参与碱性磷酸酶(AKP)等多种酶的合成，与动物机体的抗氧化能力密切相关[2]，且能促进动物的骨骼发育[3]。植酸酶是一类能将植酸和植酸盐中的磷酸基团逐一水解，最终释放出肌醇和无机磷的磷酸单酯酶，它能促进微量元素的生物利用率，且能促进单胃动物的生长性能[4]。为此，深入研究植酸酶对锌营养利用率的影响，探讨锌和植酸酶对机体生长发育、免疫器官指数和抗氧化能力的有益作用，对科学地降低鹅饲粮中锌的添加水平具有重要意义。锌是一种受饲粮植酸含量影响最大的微量元素[5]。有研究证实，锌与植酸酶在小肠上段能够结合成极难溶解的植酸盐，不能被动物体消化吸收，从而阻碍了锌的生物学效价[6]。根据我国农业部1224公告，硫酸锌(ZnSO4)在鹅饲粮中的建议添加水平为60 mg/kg。而陈苗璐等[7]研究表明，五龙鹅达到最佳生长性能的适宜锌添加水平为106.45 mg/kg，超出了我国的推荐量。Brnić等[8]研究表明，添加植酸酶对氧化锌(ZnO)和硫酸锌的利用率提高了80%左右；Revy等[9]在对仔猪添加锌和植酸酶的研究表明，添加植酸酶组的锌生物学效价优于只添加锌组；朱连勤等[10]研究了不同植酸酶对蛋鸡组织微量元素沉积的影响，发现添加400 U/kg植酸酶能有效提高锌的组织沉积。本试验旨在探索植酸酶与锌协同作用对1~4周龄鹅生长性能、胫骨发育、免疫性能及抗氧化能力的影响，确定添加植酸酶对锌的利用率，为鹅饲粮中植酸酶的合理利用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计选择1日龄体况相近的五龙鹅360只，随机分为6组，每组6个重复，每个重复10只鹅，公母各占1/2。Ⅰ组为正对照组，饲喂基础饲粮，添加80 mg/kg硫酸锌，未添加植酸酶；Ⅱ组为负对照组，饲喂基础饲粮，添加1 200 U/kg植酸酶，未添加锌；Ⅲ~Ⅵ组在负对照组的基础上分别添加16、32、48、64 mg/kg硫酸锌。本试验锌源购自浙江新维普添加剂有限公司，植酸酶购自江苏远方中汇生物科技有限公司。
1.2 试验饲粮试验用饲粮以玉米和豆粕为主要原料，参照NRC (1994)家禽营养需要量中推荐的鹅饲粮营养水平设计配方。试验期28 d。基础饲粮组成及营养水平见表 1。基础饲粮中锌含量采用等离子体发射光谱仪测得。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
饲养试验开始前对鹅舍及器具进行冲洗和高锰酸钾喷雾消毒，然后用福尔马林和高锰酸钾熏蒸，密闭门窗24 h。1周后开始试验。试验采用网上散养方式，全期自由采食，自由饮水，试验期内定期消毒，严格控制温湿度和光照，1~3日龄皮下注射小鹅瘟、鹅副黏病毒二联灭活疫苗；10日龄皮下注射新城疫H5N1疫苗；20日胸部肌肉注射新城疫油苗。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生长性能在1日龄时对试验鹅苗进行称重，第4周龄末，以重复为单位分别进行空腹称重，计算1~4周龄的平均日增重(ADG)；统计每日耗料量，计算平均日采食量(ADFI)。每天记录各组死淘情况，计算料重比(F/G)和死淘率[11]。
1.4.2 胫骨发育在第4周龄末屠宰后，取鹅右侧胫骨(每重复1只，共36只)，采用数字闪烁式锥形扫描骨密度仪(osteocoer 3)测定骨密度(bone mineral density，BMD)，计算骨矿含量(bone mineral content，BMC)，然后105 ℃烘干后称重胫骨重量，再依据GB/T 6438-1992、原子分光光度分和钼黄比色法分别测定胫骨中骨灰分及钙(Ca)、磷(P)含量。AKP活性由相应试剂盒测得，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.4.3 抗氧化指标第4周龄末屠宰时，采集鹅的血清和肝脏(每重复2只，共72只)。总抗氧化能力(T-AOC)采用比色法测定，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性采用比色法测定，铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，上述指标均用试剂盒测定，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.4.4 免疫性能免疫器官指数的测定：在第4周龄末进行屠宰试验时，摘取鹅的免疫器官(胸腺、脾脏、法氏囊)，并剔除附着的组织，用滤纸吸干多余水分后准确称其重量。
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新城疫抗体效价的测定：鹅苗于注射新城疫疫苗前，分别从每组中抽取6只体重相近的鹅，进行静脉采血，并作标记；注射新城疫疫苗后，分别于注射后第7、14天再次对标记鹅进行静脉采血，血样作不抗凝处理，3 000 r/min离心10 min后吸取血清，用于测定新城疫抗体效价。抗体效价的测定根据病毒的血凝和血凝抑制试验进行。血清效价为以100%抑制凝集的血清最大稀释度。
1.5 统计分析采用SPSS 19.0软件中单因素方差分析(one-way ANOVA)中的LSD法进行多重比较。试验数据以“平均值±标准差”表示。P < 0.05和P < 0.01分别为差异显著和极显著水平。
2 结果与分析 2.1 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅生长性能的影响由表 2可以看出，Ⅳ、Ⅴ组的体重和平均日增重均极显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P < 0.01)，Ⅳ组的平均日采食量极显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P < 0.01)，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的料重比极显著低于Ⅰ组(P < 0.05)，各组死淘率差异不显著(P > 0.05)。
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表 2 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅生长性能的影响 Table 2 Effects of phytase supplementation in a low zinc diet on growth performance of geese aged from 1 to 4 weeks |
以上结果表明，饲粮添加植酸酶可显著提高1~4周龄鹅的生长性能，且在加酶条件下平均日增重和料重比与饲粮锌添加水平有相关性。对Ⅱ~Ⅵ组平均日增重(Y1)和料重比(Y2)分别与饲粮锌添加水平(X)进行二次曲线拟合，建立回归方程如下：
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由上述回归方程得出，饲粮中锌添加水平为34.00 mg/kg时平均日增重最大，饲粮中锌添加水平为44.70 mg/kg时料重比最低。从综合效益角度分析，1~4周龄鹅饲粮中植酸酶添加水平为1 200 U/kg条件下，获得最佳生长性能的饲粮锌添加水平为34.00~44.70 mg/kg。
2.2 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅胫骨发育的影响由表 3可以看出，Ⅳ、Ⅴ组的骨密度显著高于Ⅱ组(P < 0.05)；Ⅳ、Ⅴ组的骨矿含量显著或极显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P < 0.05或P < 0.01)；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的AKP活性显著高于Ⅰ组(P < 0.05)，极显著高于Ⅱ组(P < 0.01)；各组骨灰分含量差异不显著(P > 0.05)；Ⅳ、Ⅵ组Ca含量显著高于Ⅱ组(P < 0.05)；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组P含量显著高于Ⅱ组(P < 0.05)。
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表 3 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅胫骨发育的影响 Table 3 Effects of phytase supplementation in a low zinc diet on tibia development of geese aged from 1 to 4 weeks |
对Ⅱ~Ⅵ组的骨密度和血清AKP活性分别进行二次曲线拟合，结果发现，骨密度与饲粮锌添加水平的曲线关系不显著(R2 < 0.700)，血清AKP活性(Y3)与饲粮锌添加水平(X)的回归方程如下：
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由上述回归方程得出，当饲粮锌添加水平为51.38 mg/kg时，血清AKP活性最大，即成骨细胞的活动越强。
由表 4可以看出，骨密度、钙含量与血清AKP活性呈极显著正相关(P < 0.01)，血清磷含量与血清AKP活性呈显著正相关(P < 0.05)。
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表 4 血清碱性磷酸酶活性与胫骨指标的相关性分析 Table 4 Correlation analysis between serum AKP activity and tibia indicators |
以上结果表明，饲粮添加植酸酶与锌协同，能通过提高血清AKP的活性，增加骨密度，促进骨中钙、磷钙的沉积，从而促进胫骨的发育。
2.3 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅抗氧化能力的影响由表 5可以看出，血清中，Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ组的T-AOC显著高于Ⅱ组(P < 0.05)，与Ⅰ组差异不显著(P > 0.05)；Ⅲ、Ⅳ组Cu-Zn SOD活性显著高于Ⅱ组(P < 0.05)，Ⅴ、Ⅵ组极显著高于Ⅱ组(P < 0.01)；各组MDA含量差异不显著(P > 0.05)；Ⅳ~Ⅵ组GSH-Px活性极显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P < 0.01)。
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表 5 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅抗氧化能力的影响 Table 5 Effects of phytase supplementation in a low zinc diet on antioxidant capacity of geese aged from 1 to 4 weeks |
肝脏中，Ⅴ、Ⅵ组的T-AOC显著或极显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P < 0.05或P < 0.01)；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的Cu-Zn SOD、GSH-Px活性及MDA含量均显著或极显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P < 0.05或P < 0.01)。
Ⅱ~Ⅵ组的血清和肝脏抗氧化指标均随着饲粮锌添加水平的升高有提高趋势。通过对Ⅱ~Ⅵ组的曲线拟合分析可得，血清T-AOC (Y4)和肝脏T-AOC (Y5)与饲粮锌添加水平(X)呈二次曲线关系，建立回归方程如下：
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由上述回归方程得出，当饲粮锌添加水平为50.24 mg/kg时，血清T-AOC最高；当饲粮锌添加水平为47.49 mg/kg时，肝脏T-AOC最高。以上结果表明，低锌饲粮添加植酸酶能够提高鹅血清和肝脏的抗氧化能力。
2.4 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅免疫性能的影响由表 6可以看出，Ⅲ~Ⅵ组的胸腺指数和法氏囊指数均显著或极显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P < 0.05或P < 0.01)；各组脾脏指数差异不显著(P > 0.05)。
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表 6 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅免疫器官指数的影响 Table 6 Effects of phytase supplementation in a low zinc diet on immune organ index of geese aged from 1 to 4 weeks |
由表 7可以看出，免疫前后，Ⅳ~Ⅵ组的血清新城疫抗体水平均显著或极显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P < 0.05或P < 0.01)，且Ⅱ~Ⅴ组随着饲粮锌添加水平的增加，血清抗体水平呈上升趋势。通过对Ⅱ~Ⅵ抗体水平的二次曲线拟合分析，免疫第14天后的血清抗体水平(Y6)与饲粮锌添加水平(X)呈二次线性关系，建立回归方程如下：
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表 7 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅血清抗体水平的影响 Table 7 Effects of phytase supplementation in a low zinc diet on serum antibody level of geese aged from 1 to 4 weeks |
由上述回归方程得出，当饲粮锌添加水平为49.67 mg/kg时，血清抗体水平最高。以上结果表明，饲粮添加植酸酶与锌协同能够提高鹅免疫性能，且当饲粮锌添加水平为49.67 mg/kg时，免疫第14天后能获得最佳血清抗体水平。
3 讨论 3.1 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅生长性能的影响动物的生长性能是反映动物生长发育的指标，幼龄动物是生长力最旺盛的时期，其生长性能高低将直接影响其进入育成期的生长发育好坏。锌和植酸酶均能对育雏期动物的生长性能产生有利的影响。苏丽娜等[12]研究了锌对蛋雏鸭生长性能的影响，发现饲粮锌添加水平的提高能促进蛋雏鸭生长性能，并确定蛋雏鸭饲粮适宜锌添加水平为51.8 mg/kg；Attia等[13]发现，在雏鸡饲粮中添加500 U/kg微生物来源植酸酶极显著提高了雏鸡的生长性能；Józefiak等[14]研究了复合糖酶与植酸酶对育雏鸡生长性能的影响，发现加酶组料重比由1.90降至1.84。本试验的研究结果表明，加酶的Ⅲ~Ⅵ组料重比低于不加酶的Ⅰ组，平均日增重高于Ⅰ组；Ⅱ组的生长性能显著低于其他各组，是由于Ⅱ组饲粮中的锌水平不能满足鹅需要量，鹅群普遍出现缺锌症状。为了探讨添加植酸酶时锌适宜添加水平，对料重比和平均日增重分别进行二次曲线拟合，结果显示锌的添加水平应控制在34.00~44.70 mg/kg。由此证明饲粮添加植酸酶能有效降低锌的添加水平。
3.2 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅胫骨发育的影响锌和植酸酶对动物骨骼的发育均有影响，其作用机制主要与影响AKP的活性以及影响钙、磷代谢有关。AKP是一种催化磷酸单酯水解释放无机磷的酶类，是反映骨骼代谢和成骨细胞活动的重要指标，缺锌可引起胃和血清AKP活性降低，导致骨代谢异常，改变骨的钙化作用，使骨骼生长板上的软骨细胞增生，骨密度下降。何霆等[15]发现，肉仔鸡血清AKP活性随饲粮锌添加水平的提高而提高，当饲粮锌添加水平为70 mg/kg时达到最高。而植酸酶可使饲粮有效磷水平增加，促进血液和骨骼中的钙、磷代谢，增加骨中钙和磷的沉积，从而促进胫骨的发育。Manobhavan等[16]研究了高剂量植酸酶对雏鸡骨骼矿物元素含量的影响，发现饲粮添加2 500~5 000 U/kg植酸酶能显著增加骨骼中钙、磷等矿物元素的含量；雷乔波等[17]研究表明，饲粮添加300 U/kg植酸酶能显著提高胫骨灰分和灰分中磷的含量；赵春等[18]研究发现，在肉仔鸡饲粮添加植酸酶能显著促进钙、磷的利用率。本试验的研究首先证明了添加植酸酶的Ⅲ~Ⅵ组的血清AKP活性比Ⅰ组显著增加，且与饲粮锌添加水平之间存在二次曲线关系，对其进行拟合分析后得知，当饲粮锌添加水平为51.38 mg/kg时血清AKP活性最高，且血清AKP活性与骨密度和钙、磷含量之间存在显著或极显著线性关系；其次证明了添加植酸酶后，Ⅳ~Ⅵ组的骨磷含量显著高于Ⅰ、Ⅱ组。由此表明饲粮添加植酸酶后，能提高锌对胫骨发育的生物学效价，有效降低饲粮锌的添加水平。
3.3 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅抗氧化能力的影响动物机体的抗氧化能力决定了动物机体防御体系的强弱。T-AOC是体内酶促抗氧化体系的重要组成部分，能清除机体不断产生的氧自由基。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的含锌酶，它主要参与还原型谷胱甘肽对过氧化氢(H2O2)的还原反应，能够防止脂质过氧化，提高机体的抗氧化能力。CuZn-SOD是一种锌依赖酶，主要功能是使超氧自由基发生歧化反应，消除其毒性，防止机体过氧化。MDA含量是间接反映生物体内氧自由基的代谢状况以及脂质过氧化程度的指标。王宝维等[19]的研究表明，增加饲粮锌水平能显著通过血清和肝脏T-AOC及GSH-Px、CuZn-SOD活性，显著降低血清和肝脏MDA含量；钟映梅等[20]的研究表明，提高饲粮锌水平能降低鹅血清和肝脏的MDA含量。Tang等[21]研究了补锌对胰腺炎大鼠的抗氧化调节，发现补锌组的超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)活性显著提高。Liu等[22]研究证明，植酸酶能提高血清T-AOC和SOD活性9%~16%；Gowanlock等[23]在仔猪饲粮中加入植酸酶，发现锌与植酸酶协同能够提高肝脏CuZn-SOD的活性。本试验研究发现，缺锌的Ⅱ组血清和肝脏抗氧化指标均显著低于其他各组；添加植酸酶后，Ⅳ~Ⅵ组的血清和肝脏的T-AOC和GSH-Px活性比Ⅰ组显著升高；血清的MDA含量差异不大，肝脏的MDA含量，Ⅳ~Ⅵ组比Ⅰ组极显著降低。结果表明添加植酸酶提高了锌促进机体抗氧化能力的生物学效应，两者协同能有效降低饲粮锌的添加水平，但缺锌状态会严重降低机体抗氧化能力。经过对血清和肝脏T-AOC的分析，饲粮锌添加水平在47.49~50.24 mg/kg时机体的抗氧化能力最佳。
3.4 低锌饲粮添加植酸酶对1~4周龄鹅免疫性能的影响对免疫性能的影响主要包括对免疫器官指数和血清抗体水平的影响。家禽主要的免疫器官包括胸腺、脾脏和法氏囊。其中胸腺发挥生理作用需要锌的参与；脾脏主要与产生抗原和免疫应答有关；法氏囊对幼龄动物的体液免疫有重要影响。三者的发育情况由相应的器官指数衡量。苏莉娜等[24]研究发现，饲粮锌添加水平为55.7 mg/kg时，胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数显著升高；Cui等[25]研究缺锌对鸭免疫器官发育的影响，发现缺锌严重抑制了鸭法氏囊的发育；徐晓娜等[26]的研究发现添加900 U/kg植酸酶，五龙鹅的胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数显著提高；Zyła等[27]在肉鸡饲粮添加植酸酶复合酶制剂，发现植酸酶能增加法氏囊的重量。本试验在低锌水平饲粮添加植酸酶后，Ⅲ~Ⅵ组的胸腺指数和法氏囊指数显著增加，甚至超过了Ⅰ、Ⅱ组的水平，但2个对照组间差异不大，分析原因可能由于Ⅰ组未添加植酸酶，幼龄鹅饲粮秸秆含量高，其中的植酸抑制了锌的吸收利用，而缺锌的Ⅱ组由于添加了植酸酶，对免疫器官的发育有一定的促进作用，弥补了锌的不足。结果表明，植酸酶与锌协同有效促进了免疫器官的发育，且能有效降低饲粮锌的添加。
免疫抗体效价直接反映了动物体液免疫的水平，对预防家禽传染病的发生具有重要的意义。王明发等[28]研究表明，添加氨基酸络合锌极显著提高了肉鸡新城疫抗体水平；Chand等[29]探讨了锌对肉鸡血清抗体的影响，发现补锌组的传支和传法的抗体滴度显著增加；Shaw等[30]在接种了球虫病的肉仔鸡饲喂植酸酶，发现饲喂植酸酶后白介素基因的表达量显著提高；Liu等[31]研究发现，添加高植酸酶饲粮的肉仔鸡新城疫抗体水平显著提高。本试验的研究表明，添加植酸酶的Ⅲ~Ⅵ组，免疫前后血清新城疫抗体水平较Ⅰ组均有显著提高，Ⅱ组的抗体水平较低，说明缺锌对血清抗体的产生有不良影响。试验结果表明，添加植酸酶能提高低饲粮锌水平下鹅的血清抗体水平，也说明添加植酸酶可以降低饲粮锌的添加水平。
综上研究结果表明，植物性饲粮中植酸水平均较高，尤其是秸秆中含量更多，家禽等单胃动物自身不能分泌植酸酶，添加微生物植酸酶可将饲粮中的植酸盐水解为肌醇和磷酸单酯酶，使植酸对锌等微量元素的络合作用降低，使其以无机离子态的形式游离出来，被单胃动物所吸收利用，从而提高了锌的营养利用率，使低锌饲粮也可以取得理想的生产效果，此结果对指导鹅生态养殖具有重要意义。
4 结论① 低锌饲粮中添加植酸酶能够提高1~4周龄鹅生长性能、免疫性能和机体抗氧化能力，促进胫骨发育，降低饲粮中锌的添加水平。
② 饲粮添加1 200 U/kg植酸酶的条件下，1~4周龄鹅饲粮锌的适宜添加水平为44.70~51.38 mg/kg。
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