动物营养主要涉及饲粮营养物质的供给量与动物对营养物质的需要量之间的平衡问题。对于蛋白质和氨基酸营养这部分，各个国家和地区相继提出了新的蛋白质体系，并且建立了小肠可吸收氨基酸流量模型。主要有康奈尔净碳水化合物与蛋白质体系(CNCPS)[1]、Rulquin等[2]和NRC (2001)[3]提出的3个预测模型。其中，CNCPS和Rulquin等[2]的模型以析因法建立，而NRC (2001)是以多元回归建立的半析因模型。在这些小肠可吸收氨基酸流量模型当中，美国康奈尔大学提出的CNCPS应用较为广泛。
CNCPS将粗蛋白质(CP)分为非蛋白氮、可溶性真蛋白质、中速降解真蛋白质、慢速降解真蛋白质、不溶性蛋白质共5种组分，分别用A、B1、B2、B3和C表示，通过测定B1、B2、B3组分瘤胃非降解蛋白质(RUP)含量、不溶性蛋白质的氨基酸组成以及设定B组分的小肠消化率，从而对RUP小肠可吸收氨基酸流量的进行预测。但该模型涉及指标较多，有必要对其简化。有研究表明，以饲料常规营养指标拟合各组分的降解速率，得出了较好的预测结果[4]。本研究的目的是以CNCPS为基础，通过测定CNCPS预测RUP小肠可吸收氨基酸流量所需数据，以及各时间点RUP的体外小肠消化率，围绕CP瘤胃降解率和RUP小肠消化率，对CNCPS的RUP小肠可吸收氨基酸流量预测模型进行简化，提出不同的简化方案，并评估其可靠性。
1 材料与方法 1.1 饲料样品干酒糟及其可溶物(DDGS)(2种)、全株玉米青贮(2种)、黄贮、玉米(2种)、啤酒糟、玉米蛋白粉、麸皮、豆粕、棉籽粕、次粉、米糠、燕麦、羊草、苜蓿和甜菜粕共18份饲料样品。
1.2 试验动物4头体重相近、健康且装有瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛。每天饲喂2次，时间为08:30和15:30；每天挤奶2次，时间为06:30和18:30。
1.3 瘤胃降解率的测定选用6 cm×12 cm孔径为300目的尼龙袋，每个饲料样品设2个重复，每个尼龙袋为1个重复，精料样品量约4 g，粗料样品量约2 g，随降解时间的延长尼龙袋的数量依次增加。精料的降解时间为1、2、4、8、16、24、36和48 h，共8个时间点，粗料的降解时间为2、4、8、16、24、36、48和72 h，共8个时间点。尼龙袋内样品CP含量采用凯氏定氮法测定[5]。CP瘤胃降解率的计算利用以下数学模型：
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式中：P为t(h)时间点的CP瘤胃降解率(%)；a为快速降解部分(%)；b为慢速降解部分(%)；c为b的降解速率(%/h)。
CP有效降解率计算采用以下公式：
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式中：ED为CP有效降解率(%)；k为瘤胃外流速度(%/h)。
1.4 CNCPS中B组分降解速率的计算将各个时间点瘤胃CP瘤胃降解率(P，%)、各时间点瘤胃各CP组分占CP的比例(PA、PB1、PB2、PB3，参考张英学等[7]的方法计算)带入以下方程，利用软件Graphpad Prism 5进行最小二乘数据拟和计算B1、B2、B3组分的瘤胃降解速率(kd1、kd2、kd3，%/h)。
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之后根据以下公式计算瘤胃未降解B组分含量：
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式中：REPB1为B1组分瘤胃未降解含量(%)；REPB2为B2组分瘤胃未降解含量(%)；REPB3为B3组分瘤胃未降解含量(%)；PB1、PB2、PB3分别为B1、B2、B3占饲料CP的比例(%)；kp为瘤胃外流速度(%/h)。
1.5 CNCPS对RUP小肠可吸收氨基酸流量的预测方程 1.5.1 饲料RUP对小肠氨基酸贡献量的预测方程
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式中：REFAAi为饲料原料中氨基酸i在十二指肠的流量(‰)，即瘤胃未降解氨基酸i含量；AAINSPi为瘤胃降解残渣中氨基酸i的含量(%)，氨基酸含量采用全自动氨基酸仪测定；REPC为瘤胃未降解不溶性蛋白质的含量(%)。
1.5.2 饲料小肠可吸收氨基酸流量的预测方程
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式中：DIGFAAi为饲料原料氨基酸i在小肠可吸收流量(‰)；IDPB1为B1组分的小肠消化率，为100%；IDPB2为B2组分的小肠消化率，为100%；IDPB3为B3组分的小肠消化率，为80%。
1.6 小肠消化率的测定以Calsamiglia等[8]推荐的体外法进行测定各时间点RUP小肠消化率。操作步骤：1)准确称取一定量饲料原料或降解残渣(约含15 mg氮)，精确到0.000 1 g，放入50 mL的离心管中，加入10 mL HCl-胃蛋白酶溶液, 振荡混匀，38 ℃条件下在恒温水浴摇床上培养1 h。2)取出离心管，立即加入0.5 mL浓度为1 mol/L的NaOH溶液，旋涡混合器振荡混匀，再加入10 mL的胰酶溶液，振荡混匀。3)38 ℃下水浴摇床上消化24 h。4)消化结束后立即向离心管中加入50%三氯乙酸溶液终止酶反应，使未消化的蛋白质沉淀。5)离心管旋涡混匀，静置15 min，在5 000×g下离心10 min，弃去上清液，将残渣无损转移出待测。6)测定残渣中的CP及各CP组分含量。
RUP有效消化率的计算：
各时间点RUP小肠消化率符合以下曲线：
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式中：ID为某种饲料在瘤胃内降解t时间后，该饲料RUP小肠消化率(%)；ki为某种饲料各时间点RUP小肠消化率减小的速率(%/h)；s和h为常数。
然后，由以下方程计算RUP小肠有效消化率：
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式中：Di为ID的积分；r=1-(a+b)；Kp为饲料的瘤胃外流速度(%/h)；Kd为饲料的瘤胃降解速率(%/h)；Ki为某种饲料RUP小肠消化率减小的速率(%/h)；U为RUP小肠消化率的极限值；EID为小肠有效消化率(%)。
1.7 数据统计用Graphpad Prism 5软件计算瘤胃降解率、B组分降解速率以及小肠有效消化率；用SAS 9.2进行线性回归拟合；用t检验对简化前后的流量进行差异性分析。
2 结果 2.1 以瘤胃有效降解率和小肠有效消化率对小肠可吸收氨基酸流量的预测(简化模型1) 2.1.1 CP的瘤胃降解率由表 1可知，各种饲料的CP有效降解率差异较大，其中，豆粕和甜菜粕随降解时间的延长，由于残渣的剩余量极少，降解后期并未给出对应数据。粗料的CP有效降解率较高，在51.39%~75.54%；并且前2 h降解较快，这可能与其较高的非蛋白氮含量有关；粗料的各时间点CP瘤胃降解率的变化较为平缓。精料的CP有效降解率在34.36%~90.70%；精料的CP瘤胃降解率1~4 h变化较快的为麸皮，8~24 h变化最快的为棉籽粕、豆粕和甜菜粕，36 h之后仍变化很大的为玉米、玉米蛋白粉和啤酒糟。
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表 1 饲料CP的瘤胃降解率(干物质基础) Table 1 Ruminal degradability of CP in feed (DM basis) |
由表 2可知，粗料的RUP小肠有效消化率只有苜蓿较高，其他粗料均低于精料。各时间点RUP的小肠消化率基本遵循一个规律：随着消化时间的延长，RUP的小肠消化率变小。
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表 2 饲料RUP的小肠消化率(干物质基础) Table 2 Intestinal digestibility of RUP in feed (DM basis) |
由表 3可知，小肠可吸收总氨基酸流量最高的为玉米蛋白粉，最低的为全株玉米青贮1。
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表 3 CNCPS对饲料RUP小肠可吸收氨基酸流量的预测结果(干物质基础) Table 3 Prediction results of adsorbable amounts of amino acids in small intestine of RUP in feeds based on CNCPS (DM basis) |
基于CNCPS对RUP小肠可吸收氨基酸流量的预测方程，以饲料CP瘤胃有效降解率及RUP小肠有效消化率替代B组分的瘤胃降解率及小肠消化率，得出预测结果，与CNCPS评定结果进行线性回归分析。精料和粗料的方程分别为：
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式中：X为以饲料CP瘤胃有效降解率及RUP小肠有效消化率简化CNCPS模型得出的预测小肠可吸收氨基酸流量(‰)，Y为CNCPS的预测小肠可吸收氨基酸流量(‰)。
精料(P=0.999 9)和粗料简化与未简化的模型得到的预测值(P=0.835 4)之间差异均不显著。
简化后的精料和粗料模型(简化模型1)分别为：
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式中：Y为饲料原料RUP中某种氨基酸的小肠可吸收量(‰)；AA为饲料原料不溶性蛋白质中某种氨基酸的含量(%)；ED为饲料原料CP瘤胃有效降解率(%)；CP为饲料CP含量(%)；EID为RUP小肠有效消化率(%)。
2.2 以单一时间点的瘤胃降解率和小肠消化率对小肠可吸收氨基酸流量的预测(简化模型2) 2.2.1 CP的瘤胃实时降解率与有效降解率的相关性由表 4可知，对各时间点CP的瘤胃实时降解率与有效降解率进行线性回归可发现，精料、粗料均以CP的瘤胃8 h的降解率与有效降解率相关性最强。
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表 4 饲料CP各时间点瘤胃降解率(X，%)与瘤胃有效降解率(Y，%)的相关性 Table 4 Correlation between ruminal degradability at different time points (X, %) and effective degradability (Y, %) of CP in feeds |
由表 5可知，对各时间点RUP小肠消化率与小肠有效消化率进行线性回归时发现，精料、粗料分别以2和8 h RUP小肠消化率与有效消化率相关性最强。
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表 5 饲料RUP各时间点小肠消化率(X，%)与小肠有效消化率(Y，%)的相关性 Table 5 Correlation between intestinal degradability at different time points (X, %) and effective degradability (Y, %) of RUP in feeds |
基于CNCPS，分别以单一时间点估算的CP瘤胃有效降解率和RUP小肠有效消化率对RUP小肠可吸收氨基酸流量进行预测，将预测结果与CNCPS评定结果线性回归。精料方程为：
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式中：X为以CP的8 h瘤胃降解率和RUP的2 h小肠消化率简化CNCPS模型预测的小肠可吸收氨基酸流量(‰), Y为CNCPS模型预测的小肠可吸收氨基酸流量(‰)，2者差异不显著(P=0.999 9)。
粗料方程为：
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式中：X为以CP的瘤胃8 h降解率和RUP的8 h小肠消化率简化CNCPS模型预测的小肠可吸收氨基酸流量(‰)，Y为CNCPS模型预测的小肠可吸收氨基酸流量(‰)，2者差异不显著(P=0.993 1)。
简化后的精料和粗料模型(简化模型2)分别为：
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式中：Y为RUP中某种氨基酸的小肠可吸收量(‰)；ED8为CP的8 h瘤胃降解率估算的有效降解率(%)；EID2、EID8分别为RUP 2、8 h小肠消化率估算的小肠有效消化率(%)；AA为不溶性蛋白质中该氨基酸的含量(%)；CP为饲料CP的含量(%)。
2.3 以同一时间点的瘤胃降解率和小肠消化率简化CNCPS预测小肠可吸收氨基酸流量模型(简化模型3)将同一时间点的CP瘤胃降解率和RUP小肠消化率对CNCPS预测模型简化得到结果如表 6所示。可知精料、粗料均以8 h的降解率和小肠消化率对RUP小肠可吸收氨基酸流量的预测结果与CNCPS评定结果相关性最强。精料和精料方程分别为：
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表 6 同一时间点的CP瘤胃降解率和RUP小肠消化率(X, ‰)与CNCPS预测的小肠可吸收氨基酸流量(Y，‰)的相关性 Table 6 Correlation between adsorbable amounts of amino acids in small intestine predicted by CP ruminal degradability and RUP intestinal digestibility at the same time point (X, ‰) and CNCPS (Y, ‰) |
式中：X为以CP的8 h瘤胃降解率和RUP的8 h小肠消化率简化CNCPS模型预测的小肠可吸收氨基酸流量(‰), Y为CNCPS模型预测的小肠可吸收氨基酸流量(‰)。
精料(P=0.999 5)和粗料简化与未简化的模型得到的预测值(P=0.997 1)之间差异均不显著。
简化后的精料和粗料模型(简化模型3)分别为：
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式中：Y为RUP中的某种氨基酸小肠可吸收流量(‰)；D8为CP的8 h瘤胃降解率(%)；ID8为RUP的8 h小肠消化率(%)；CP为饲料CP含量(%)；AA为不溶性蛋白质中该氨基酸含量(%)。
2.4 不同简化模型的比较由表 7可知，综合考虑可靠性和简单性，简化模型3更加简单可靠。
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表 7 不同方法的比较 Table 7 Comparison among different methods |
本试验的粗料以及DDGS1的CP瘤胃降解率较高，这可能是由饲料的来源及饲料本身的蛋白质含量决定的。在乔良等[9]的研究中，对蛋白质饲料、籽实和糠麸类饲料以及粗料测定其CP瘤胃降解率，其中玉米蛋白粉、棉籽粕和豆粕的CP瘤胃降解率与本试验相一致，而玉米和青贮的CP瘤胃降解率相差较大，原因可能在于饲料来源、加工工艺以及所用的瘤胃外流速度不一。玉米作为应用广泛的精料，对其CP瘤胃降解率的研究很多，NRC (2001)[10]为63%，在莫放等[11]的研究中，为26.40%~48.15%，而王艳荣等[12]的结果为9.86%，可见品种和产地影响较大。
当以CP瘤胃降解率与有效降解率进行拟合时，精料、粗料均得到8 h的瘤胃降解率与有效降解率相关性最高，和Yilmaz等[13]的结果相似，但是有别于王立明[14]的结果(24和48 h)。
3.1.2 RUP小肠消化率的分析由于RUP的差异极大，致使RUP的小肠消化率变化范围很广。从本研究得出的各饲料降解残渣的消化率可以看出，随着降解时间的延长，小肠消化率会随之降低，与残渣中不可降解组分的不断富集有关[15]。
粗料的RUP小肠有效消化率整体小于精料，但苜蓿的RUP小肠有效消化率较高。精料中米糠、啤酒糟、甜菜粕等饲料的小肠有效消化率较低，在50%以下。
在岳群等[16]的试验中，苜蓿和玉米青贮RUP小肠有效消化率为44.10%和24.49%，和本试验的54.89%和24.90%相近。但是在周荣[17]的研究中，用16 h的降解残渣经移动尼龙袋法得到的结果为88.60%和61.40%，差异产生可能主要由于试验方法不同。对于精料，赵青余[18]以体外三步法对16 h的降解残渣测定小肠消化率，玉米蛋白粉、豆粕、麸皮、啤酒糟、米糠、玉米的RUP小肠消化率分别为85.33%、88.37%、65.39%、70.28%、53.84%和71.49%。与本试验有一定差异，可能与其所用牛只为西门塔尔和中原黄牛的杂交阉牛有关。而在周荣[17]的研究当中，豆粕和玉米的RUP小肠消化率分别为61.31%、70.35%，和本试验的结果类似。
3.2 简化方法的分析在以CNCPS为基础进行简化时，以瘤胃降解率和小肠消化率对RUP小肠可吸收氨基酸流量预测的结果，在未与CNCPS拟合之前，其结果较CNCPS评定结果偏低。
造成该预测偏差的原因主要有2方面：第一，在RUP的估计量上，所测饲料的CNCPS值要高于实测值；第二，在小肠消化率的设定方面，CNCPS设定的小肠消化率要高于所测定的小肠消化率。但是当用简化后结果与CNCPS结果拟合时，得到了可靠的预测结果，在CNCPS基础上简化了预测模型。
4 结论基于CNCPS，得到了预测RUP小肠可吸收氨基酸流量的简化模型，简化后的精料和粗料模型分别为：
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式中：Y为RUP中的某种氨基酸小肠可吸收流量(‰)；D8为CP的8 h瘤胃降解率(%)；ID8为RUP的8 h小肠消化率(%)；AA为不溶性蛋白质中该氨基酸含量(%)。
| [1] | O'CONNOR J D, SNIFFEN C J, FOX D G, et al. A net carbohydrate and protein system for evaluating cattle diets:Ⅳ.Predicting amino acid adequacy[J]. Journal of Animal Science, 1993 , 71 (5) : 1298 –1311. |
| [2] | RULQUIN H, GUINARD J, VÉRITÉ R, et al. Variation of amino acid content in the small intestine digesta of cattle:development of a prediction model[J]. Livestock Production Science, 1998 , 53 (1) : 1 –13. DOI: 10.1016/S0301-6226(97)00148-6 |
| [3] | NRC.Nutrient requirements of dairy cattle[S].7th ed.Washington, D.C.:National Academy Press, 2001. |
| [4] | 张博.内蒙古白绒山羊十二指肠食糜氨基酸流通量及组成比例预测数学模型的研究[D].硕士学位论文.呼和浩特:内蒙古农业大学, 2004. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10129-2004076683.htm |
| [5] | 国家技术监督局.GB/T 6432-1994饲料中粗蛋白测定方法[S].北京:中国标准出版社, 1995. |
| [6] | 冯仰廉. 反刍动物营养学[M]. 北京: 科学出版社, 2004 . |
| [7] | 张英学, 林雪彦, 苏鹏程, 等. 基于CNCPS模型的14种饲料瘤胃非降解蛋白组分小肠消化率研究[J]. 畜牧兽医学报, 2010 , 41 (11) :1421 –1427. |
| [8] | CALSAMIGLIA S, STERN M D. A three-step in vitro procedure for estimating intestinal digestion of protein in ruminants[J]. Journal of Animal Science, 1995 , 73 (5) : 1459 –1465. DOI: 10.2527/1995.7351459x |
| [9] | 乔良, 郝俊玺, 闫素梅, 等. 奶牛主要饲料原料蛋白质瘤胃降解率的研究[J]. 中国奶牛, 2008 (6) :18 –21. |
| [10] | NRC.Ruminant nitrogen usage[S].Washington, D.C.:National Acadmy Press, 2001. |
| [11] | 莫放, 冯仰廉. 常用饲料蛋白质在瘤胃的降解率[J]. 中国畜牧杂志, 1995 , 31 (3) :23 –26. |
| [12] | 王艳荣, 张海棠, 崔艳红, 等.不同精料水平对肉牛饲料瘤胃降解的影响[C]//河南省畜牧兽医学会第七届暨2008年学术研讨会理事会第二次会议论文集.郑州:河南省畜牧兽医学会, 2008:353-356. |
| [13] | YILMAZ A, KOCABA Z, OZTURK E, et al. An investigation on the shortest Ruminal incubation time in calculating effective rumen degradability of nutrients in solvent extracted sunflower seed meal[J]. Journal of Animal and Veterinary Advances, 2009 , 8 (12) : 2546 –2552. |
| [14] | 王立明.奶牛常用饲料瘤胃降解规律和小肠消化率的研究[D].硕士学位论文.呼和浩特:内蒙古农业大学, 2012. http://www.oalib.com/references/17094433 |
| [15] | GONZÁLEZ J, FARÍA-MÁRMOL J, RODRÍGUEZ C A, et al. Effects of stage of harvest on the protein value of fresh lucerne for ruminants[J]. Reproduction, Nutrition, Development, 2001 , 41 (5) : 381 –392. DOI: 10.1051/rnd:2001138 |
| [16] | 岳群, 杨红建, 谢春元, 等. 应用移动尼龙袋法和三步法评定反刍家畜常用饲料的蛋白质小肠消化率[J]. 中国农业大学学报, 2007 , 12 (6) :62 –66. |
| [17] | 周荣.奶牛常用饲料蛋白质和氨基酸小肠消化率的评价[D].硕士学位论文.北京:中国农业科学院, 2011. http://www.oalib.com/references/17094315 |
| [18] | 赵青余.移动尼龙袋法和三步体外法测定反刍动物常用饲料蛋白质小肠消化率的研究[R]//中国农业科学院博士后工作报告.北京:中国农业科学院, 2005:44-46. http://industry.wanfangdata.com.cn/jd/Detail/Thesis?id=Thesis_Y880476 |