, CHEN Daiwen, YU Bing, HE Jun, ZHENG Ping, MAO Xiangbing, HUANG Zhiqing, LUO Junqiu, LUO Yuheng, YU Jie
近年来，猪烈性传染性疾病频繁发生，严重威胁猪群健康。目前，免疫接种是控制传染性疾病的有效方法之一，但在养殖生产中经常出现免疫失败或疫苗抗体效价低等情况，这直接影响免疫接种控制传染性疾病的效果，阻碍养猪业的发展。研究表明，营养与疫苗免疫效果存在直接关系，营养不仅影响免疫系统的发育和完善，同时免疫抗体的产生消耗大量的营养物质，包括蛋白质、维生素及微量元素等[1]。因此，通过营养调控改善动物的免疫功能，能有效提高疫苗免疫效果。研究表明，在疫苗免疫条件下分别添加黄芪多糖、维生素E有效提高了断奶仔猪血清抗体水平，增强了机体免疫功能[2-3]。酵母硒、叶酸、生物素能通过影响免疫器官的产生和淋巴细胞分化，对机体的免疫功能造成影响[4-5]。目前，有关添加剂单独添加效应的研究较多，而营养性复合添加剂及新型添加剂的研究则相对较少。本课题组前期的研究已经研究筛选了适宜的营养性复合添加剂的配方和添加水平[6]，但该添加剂的饲喂方法和模式尚有待进一步研究。因此本试验旨在研究营养性复合添加剂的适宜饲喂模式对生长猪免疫功能和猪瘟疫苗抗体效价的影响，为营养性复合添加剂在生产上的使用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验选用24头体重(40.5±2.3) kg的健康“杜×长×大”生长猪，按体重相近、性别一致原则随机分为4组，每组6个重复，每个重复1头猪。试验第7天接种猪瘟疫苗，疫苗接种前7 d为试验前期，疫苗接种后28 d为试验后期，试验全期为35 d。营养型复合添加剂饲喂模式见表 1。
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表 1 试验设计 Table 1 Experimental design |
基础饲粮采用玉米-豆粕型，参照NRC (2012)25~50 kg生长猪营养需要量配制，其组成及营养水平见表 2。营养性复合添加剂添加量为0.1%。
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表 2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
本试验所使用的营养性复合添加剂成分及含量(在全价料中添加量)如下：酵母硒0.5 mg/kg、黄芪多糖300 mg/kg、生物素0.1 mg/kg、叶酸0.02 mg/kg、维生素C 100 mg/kg。
1.3 饲养管理试验预试期为4 d，饲喂基础饲粮。所有猪只采用单笼饲养，每天饲喂3次，自由采食和饮水，少喂勤添，饲喂量以料槽内略有剩余为标准。每天进行圈舍清洁和消毒，并保持舍内通风和干燥。
1.4 样品采集及指标测定血样采集：所有试验猪于正试期开始、第7天、第14天、第21天、第28天和第35天前腔静脉采血3~5 mL，分离血清，用于抗体效价的测定。正式试验第21天和第35天前腔静脉采血10 mL，部分3 000 r/min离心15 min收集血清，部分收集于抗凝管中用于淋巴细胞亚群检测。
1.5 检测指标及方法 1.5.1 猪瘟抗体测定采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定正试期开始、第7天、第14天、第21天、第28天和第35天猪瘟抗体水平，严格按照猪瘟病毒抗体检测试剂盒(美国爱德士)说明书操作。抗体滴度以阻断率来表示：
阻断率(%)=100×(ODN450-ODTEST450)/ODN450。
式中：ODTEST450为被检样本的平均值；ODN450为阴性对照的平均值。
1.5.2 T淋巴细胞测定正试期第21天和第35天取2 mL抗凝全血，用流式细胞仪分析测定T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+数量和CD4+/CD8+值。
1.5.3 免疫球蛋白测定正试期第21天和第35天测定生长猪血清免疫球蛋白A (IgA)、免疫球蛋白G (IgG)和免疫球蛋白M (IgM)含量，使用武汉基因美生物科技有限公司提供的试剂盒、采用双抗体两步夹心ELISA法进行测定。
1.5.4 抗氧化指标测定正试期第21天和第35天收集血清，分装于500 μL EP管中，-20 ℃保存备用。血清总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，严格按照试剂盒说明说进行操作。
1.6 数据处理分析用Excel 2007软件对试验数据进行整理，采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，并用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示，P < 0.05表现为差异显著，P > 0.05为差异不显著。
2 结果与分析 2.1 营养性复合添加剂饲喂模式对猪瘟疫苗免疫生长猪血清猪瘟抗体滴度的影响从表 3可知，猪瘟疫苗免疫后，各组均产生了较高水平的猪瘟抗体，尤其是在试验第21天开始大量产生，且与试验开始、第7天和第14天相比差异显著(P < 0.05)。与对照组相比，全期组显著提高了试验第21天生长猪血清猪瘟抗体滴度(P < 0.05)。全期组试验第28天生长猪血清猪瘟抗体滴度显著高于对照组和前期组(P < 0.05)。
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表 3 营养性复合添加剂饲喂模式对猪瘟疫苗免疫生长猪血清猪瘟抗体滴度的影响 Table 3 Effects of nutritional compound additive feeding patterns on serum classical swine fever virus antibody titer of growing pigs injected by swine fever vaccine |
从表 4可知，与对照组相比，后期组和全期组显著减少了试验第21天生长猪全血CD3+数量(P < 0.05)。全期组试验第35天生长猪全血CD3+数量显著低于其他各组(P < 0.05)，CD4+/CD8+值也有下降的趋势(P > 0.05)，这表明营养性复合添加剂影响了辅助性T细胞和抑制性T细胞在全血中的百分比，降低了CD3+数量，导致机体细胞免疫功能降低，增加了生长猪对疾病的易感性。各组间血液中CD4+、CD8+数量和CD4+/CD8+值没有显著差异(P > 0.05)。
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表 4 营养性复合添加剂饲喂模式对猪瘟疫苗免疫生长猪淋巴细胞亚群的影响 Table 4 Effects of nutritional compound additive feeding patterns on blood lymphocyte subtypes of growing pigs injected by swine fever vaccine |
从表 5可知，与对照组相比，后期组和前期组提高了试验第21天和第35天生长猪血清IgG、IgA和IgM含量，但差异不显著(P > 0.05)。全期组试验第21天和第35天生长猪血清IgG、IgA和IgM含量显著高于对照组(P < 0.05)。
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表 5 营养性复合添加剂饲喂模式对猪瘟疫苗免疫生长猪血清免疫球蛋白的影响 Table 5 Effects of nutritional compound additive feeding patterns on serum immuneglobulin of growing pigs injected by swine fever vaccine |
从表 6可知，后期组和前期组试验第21天和第35天生长猪血清MDA含量低于对照组，但差异不显著(P > 0.05)；与对照组相比，全期组显著降低了试验第21天生长猪血清MDA含量(P < 0.05)。与对照组相比，前期组试验第21天生长猪血清SOD活性显著提高(P < 0.05)，前期组和全期组显著提高了试验第35天生长猪血清SOD活性(P < 0.05)。与对照组相比，饲喂营养性复合添加剂提高了试验第21天生长猪血清T-AOC，其中全期组差异达显著水平(P < 0.05)。
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表 6 营养性复合添加剂饲喂模式对猪瘟疫苗免疫生长猪血清抗氧化能力的影响 Table 6 Effects of nutritional compound additive feeding patterns on serum antioxidant capacity of growing pigs injected by swine fever vaccine |
免疫接种是控制疾病的有效方法，但在免疫过程中，动物因受到外来病原体刺激，易引发机体代谢发生改变，从而影响免疫效率。猪瘟一直是阻碍现代养猪业发展的重要因素，通过营养调控降低猪只应激反应，改善其免疫功能，并由此提高免疫效率是本文着重解决的问题。前期研究证实，中草药添加剂能够作为免疫佐剂提高机体的抗病毒能力，微量元素、维生素等在机体抵抗外界环境变化和病菌方面也具有其独特作用[7-9]。因此，本研究采用对生长猪接种猪瘟疫苗，模拟生产实际中猪瘟疫苗的免疫情况。结果显示：免疫21 d后各组的抗体滴度较免疫前均显著提高。这表明，本试验猪瘟疫苗接种有效。
体液免疫是构成机体防御能力的重要组成部分，动物机体内的体液免疫主要是由抗体介导的，血清中抗体水平的高低能够在一定程度上反映机体的免疫状态。动物在疫苗免疫后能否最短时间内激活免疫系统，产生特异性抗体，在疾病防治中尤为重要。IgA作为防止病原体入侵机体的第1道防线，与IgG作用共同抵御细菌、病毒和毒性的感染。IgM早于IgG的产生，能有效结合补体，在机体的早期防御中具有重要意义。陈宏等[10]研究表明，仔猪饲粮中添加0.3~0.5 mg/kg的生物素显著提高了血清IgG含量。侯伟革[11]在饲粮中添加0.05%黄芪多糖显著提高了断奶仔猪血清中IgG的含量。Niu等[12]发现，饲粮添加0.4 mg/kg有机硒显著提高了绵阳红细胞抗原免疫肉鸡血清总抗体、IgM和IgG含量。在免疫条件下添加单一或2种营养性添加剂对动物的抗体效价有增效作用[13-14]。饲粮中添加黄芪多糖显著提高了血清中油剂疫苗抗体滴度[15]。疫苗免疫下，硒的添加能够刺激免疫球蛋白及抗体的生成，提高机体的体液免疫功能[16]。本试验发现营养性复合添加剂的使用提高了生长猪血清免疫球蛋白含量，并以全期饲喂添加剂效果最为明显，且全期饲喂显著提高了猪瘟疫苗免疫生长猪血清抗体水平，而对未免疫生长猪抗体水平没有影响，这表明营养性复合添加剂可能是作为一种免疫佐剂影响生长猪的免疫功能。值得注意的是，本研究结果还显示全期饲喂营养性复合添加剂下调了生长猪全血CD3+数量，同时CD4+/CD8+值也有降低趋势。可以推测，营养性复合添加剂作为免疫佐剂调节生长猪免疫功能主要是通过增强体液免疫实现的。
机体抗氧化能力与动物的健康密切相关，诸多研究报道，营养性添加剂对机体抗氧化功能有促进作用。黄芪多糖降低了小鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性，增强了SOD和谷胱甘肽在肝脏中的活性[17]。曾秋凤等[18]在肉鸡上研究表明，维生素C显著提高了肝脏以及血清中T-AOC，降低了MDA含量。叶酸可促进血清和肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶减少自由基的产生，从而保护细胞膜的结构和功能的完整。本试验中，全期饲喂添加剂显著提高了血清T-AOC和SOD活性，降低了MDA含量，这与营养性复合添加剂中的维生素E、维生素C、酵母硒等抗氧化成分密切相关。另外，本研究结果还发现营养性复合添加剂对抗氧化能力的影响主要集中于免疫之前，后期饲喂对提高机体抗氧化有一定的作用，但效果不明显，整个试验期饲喂营养性复合添加剂更有利于提高机体的抗氧化能力。
4 结论饲喂营养性复合添加剂提高了生长猪的猪瘟抗体水平、免疫球蛋白含量和机体抗氧化能力。营养性复合添加剂的不同饲喂方式对生长猪猪瘟疫苗抗体效价和免疫功能的影响存在差异，在本试验条件下，全期饲喂效果最佳。
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