肠道是机体消化吸收的主要场所，也是阻止外界病原体和致癌物等有害物质对机体造成损害的生理屏障[1]。肠道需要很高的能量来维持其健康和功能[2]。而在应激状态下，机体能量代谢紊乱，三磷酸腺苷(ATP)含量明显降低，细胞功能障碍或死亡，导致肠道结构功能的损伤[3]。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌膜结构物质。LPS刺激可导致能量供应不足，引起肠道损伤[4]。谷氨酸(Glu)是一种酸性非必需氨基酸，对幼年动物的生长发育十分重要，与肠黏膜的生长代谢息息相关[5-6]。Stoll等[7]研究发现，饲粮中90% Glu可在猪肠道中被代谢，是肠道主要的能源物质。Glu的碳骨架分解后可形成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸可以进入三羧酸(TCA)循环氧化分解产生能量[8]。另外，Glu是精氨酸家族氨基酸，可以转化为该家族其他氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酰胺和精氨酸等，进一步在动物体内发挥作用[9]。但是，目前关于Glu在肠道能量代谢方面的研究很少，且其发挥作用的分子机理尚不清楚。因此，本试验通过给断奶仔猪注射LPS建立免疫应激模型[10]，研究Glu对断奶仔猪肠道能量代谢的影响，旨在为Glu缓解LPS刺激导致的断奶仔猪肠道损伤提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料L-Glu：有效成分>99.1%，武汉阿米诺科技有限公司提供。
L-丙氨酸：有效成分>99.5%，武汉阿米诺科技有限公司提供。
LPS：大肠杆菌血清型O55：B5，Sigma公司提供，注射时用生理盐水溶解，配成浓度500 μg/mL。注射时按照0.2 mL/kg BW (即100 μg/kg BW)进行处理。
1.2 试验动物与设计选择24头健康、体况相近[平均体重(7.02±0.21) kg]的杜×长×大断奶仔猪，按体重相近原则随机分为4组，每组6个重复，每个重复1头猪。试验采用单因子设计，4个组分别为：1)对照组(生理盐水+基础饲粮)；2) LPS组(LPS+基础饲粮)；3) LPS+1.0% Glu组(LPS+基础饲粮+1.0% Glu)；4) LPS+2.0% Glu组(LPS+基础饲粮+2.0% Glu)。参照NRC (1998)仔猪营养需要量配制基础饲粮，其组成及营养水平见表 1。各组的饲粮用丙氨酸进行等氮处理。试验期为28 d。在正式试验第28天，试验组猪注射100 μg/kg BW LPS，对照组猪注射等量的生理盐水。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验在动物营养与饲料科学湖北省重点实验室进行。每个猪栏的大小为1.20 m×1.10 m。猪舍的室内温度维持在25~27 ℃。试验采用粉料饲喂，饲养过程中让仔猪自由采食和饮水，并定期进行免疫和驱虫。
1.4 肠道样品采集与处理试验第28天，注射LPS或生理盐水4 h后，屠宰仔猪，剖开腹腔从肠系膜处取下小肠。在空肠和回肠各段中部各取10 cm左右的一段，然后立即放入冰块中。将10 cm肠段用剪刀沿肠系膜纵向剖开，4 ℃生理盐水轻轻冲洗干净，然后使用滤纸吸干水分，再用载玻片轻轻刮取肠黏膜，分装在1.5 mL无菌冻存管中，并立即放入液氮中速冻，后转入-80 ℃冰箱中冻存。
1.5 检测指标及方法 1.5.1 小肠黏膜腺苷酸含量测定采用反相高效液相色谱法测定。将肠黏膜从液氮中取出，称取0.1~0.2 g组织，加入2 mL预冷的1.5 mol/L高氯酸，冰浴匀浆，4 ℃、3 000 r/min离心5 min。取上清液1 mL，缓慢加入0.4 mL 2 mol/L碳酸钾溶液中和，4 ℃、3 000 r/min再离心5 min，取上清液-80 ℃冻存待测。
采用Waters Breeze高效液相色谱系统。色谱柱采用Waters XTerra MS C18(5 μm×4.6 mm×150 mm)；流动相：50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液：色谱级甲醇(体积比)=77：23，用磷酸调至pH=7.0；流速：1.0 mL/min；柱温：20 ℃；紫外检测器，检测波长：260 nm；进样量：10 μL。采用外标法定量测定ATP、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)含量。标准品也在相同的色谱条件下测定。
腺苷酸池(TAN)=ATP+ADP+AMP；
能荷(EC)=(ATP+1/2 ADP)/(ATP+ADP+AMP)。
1.5.2 小肠黏膜柠檬酸合酶、α-酮戊二酸脱氢酶系和异柠檬酸脱氢酶活性测定酶活性的测定参照Pi等[11]的方法，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法进行测定。猪柠檬酸合酶(#45126)、α-酮戊二酸脱氢酶系(#45157)和异柠檬酸脱氢酶(#45234) ELISA检测试剂盒生产厂家为上海源叶生物科技有限公司。
1.5.3 小肠黏膜能量代谢相关信号分子mRNA表达量的测定基因mRNA表达量的测定参照陈逢[12]的方法，采用实时定量PCR (real-time PCR)法测定，试剂均购自大连宝生物工程有限公司。根据已发表的猪的基因序列，利用Primer premier 6.0软件设计real-time PCR引物(表 2)，并由大连宝生物工程有限公司合成。本试验中，各基因扩增效率均接近100%。另外，本试验以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，各基因mRNA表达量采用2-ΔΔCT相对定量法计算[13]。各基因的mRNA相对表达量通过归一化法，以相对于对照组的表达量表示。
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表 2 基因的引物序列 Table 2 Primer sequences of genes |
试验数据采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析和LSD多重比较。统计结果采用平均值±标准误表示。以P≤0.01为差异极显著标准，0.01 < P≤0.05为差异显著标准，0.05 < P≤0.10为具有显著性趋势。
2 结果与分析 2.1 Glu对LPS刺激断奶仔猪肠道黏膜腺苷酸含量的影响由表 3可知，与对照组相比，LPS组空肠ATP、TAN含量和EC显著降低(P < 0.05)，AMP/ATP值显著升高(P < 0.05)；与LPS组相比，LPS+2.0% Glu组空肠ATP、ADP和TAN含量显著升高(P < 0.05)。
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表 3 Glu对LPS刺激断奶仔猪肠道黏膜腺苷酸含量的影响 Table 3 Effect of Glu on adenylate contents in intestinal mucosa of the LPS-challenged weaned piglets |
由表 4可知，与对照组相比，LPS组回肠柠檬酸合成酶和α-酮戊二酸脱氢酶系活性极显著降低(P < 0.01)，空肠α-酮戊二酸脱氢酶系活性有降低趋势(P=0.092)；与LPS组相比，除LPS+1.0% Glu组回肠柠檬酸合成酶活性显著降低(P < 0.05)外，饲粮添加Glu对LPS刺激断奶仔猪空肠和回肠TCA循环关键酶活性均无显著影响(P > 0.05)。
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表 4 Glu对LPS刺激断奶仔猪肠道黏膜TCA循环关键酶活性的影响 Table 4 Effect of Glu on activities of TCA cycle key enzymes in intestinal mucosa of the LPS-challenged weaned piglets |
由表 5可知，与对照组相比，LPS组空肠过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC1α)及回肠沉默信号调控因子1(Sirt1)和PGC1α的mRNA表达量极显著降低(P < 0.01)；与LPS组相比，LPS+2.0% Glu组空肠PGC1α(P=0.067)和回肠Sirt1(P=0.053)的mRNA表达量有升高趋势，LPS+1.0% Glu组回肠Sirt1的mRNA表达量有升高趋势(P=0.070)。
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表 5 Glu对LPS刺激断奶仔猪肠道黏膜能量代谢相关信号分子mRNA表达量的影响 Table 5 Effects of Glu on mRNA expression of signal molecules related to energy metabolism in intestinal mucosa of the LPS-challenged weaned piglets |
ATP是一种不稳定的高能化合物，它的3个磷酸基团中包含2个高能分子磷酸酐键，水解时转化成ADP释放出大量能量，是各种机体活动的直接能量来源，当底物代谢产生ATP的速度未能赶上其利用速度，就会增加细胞内ADP的浓度，2分子的ADP在腺苷酸激酶作用下转化成1分子ATP和1分子AMP[8]。TAN是一个能量媒介系统，其大小反映了线粒体的氧化呼吸活性和生成高能磷酸化合物的能力，同时反映了细胞的能量储备[14]。EC反映了高能磷酸键在ATP、ADP和AMP之间的相互转换，EC的正常维持取决于细胞高能化合物合成和分解之间的动态平衡，细胞能量产生不足或消耗增加时，均会影响EC水平[15]。ATP的产生减少或利用增加，会使细胞内AMP/ATP值增加，而AMP/ATP值的增加可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，从而引起一系列反应来恢复细胞内的能量平衡[16]。
本试验中LPS刺激导致断奶仔猪空肠ATP、TAN含量和EC显著降低，AMP/ATP值显著升高，这与Pi等[11]研究结果类似。王岩等[17]研究表明，LPS刺激可以影响线粒体内细胞色素氧化酶系统，阻碍呼吸链的传递，导致能量合成代谢障碍，ATP合成减少。本试验中，饲粮中添加2.0% Glu后，空肠ATP、ADP和TAN含量显著升高。Watford[18]研究表明，Glu的代谢为肠道完整性和功能维持提供了大量的ATP。Blachier等[19]研究表明，Glu在肠上皮细胞内谷氨酸脱氢酶的作用下被氧化，首先与草酰乙酸通过转氨基作用产生α-酮戊二酸和天冬氨酸，α-酮戊二酸进入线粒体参加TCA循环，进而产生ATP。以上结果及分析表明，Glu可缓解LPS刺激导致的能量代谢障碍，促进能量生成，增加能量代谢能力和储备能力。
柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶系是TCA循环的3个限速酶，调节着生物体的能量代谢和生物合成等重要生命活动[20]。柠檬酸合成酶可决定乙酰辅酶A进入TCA循环的速率，是研究能量代谢状态的重要指标[21]。异柠檬酸脱氢酶存在于线粒体和胞质中，催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸[22]。α-酮戊二酸脱氢酶系存在于线粒体基质内，可催化α-酮戊二酸酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A，同时生成还原型辅酶Ⅰ(NADH)[23]。
本试验中LPS刺激导致空肠α-酮戊二酸脱氢酶系活性有降低趋势，回肠柠檬酸合成酶和α-酮戊二酸脱氢酶系活性极显著降低，这与石海峰[24]的研究一致。饲粮添加Glu对柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶系活性无显著影响，其原因一方面可能是因为饲粮中添加Glu后肠道ATP含量显著升高，而这3种TCA循环限速酶含量受到ATP的抑制[20]；另一方面，Glu可能不是通过影响酶活性来提高TCA循环的反应速率，而是通过转化为TCA循环的中间体α-酮戊二酸，进而改善肠道的能量代谢水平。研究表明，α-酮戊二酸可以作为肠黏膜能量代谢底物[25]，饲粮添加α-酮戊二酸有助于改善LPS刺激后肠黏膜细胞的能量代谢[26]。
AMPK是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于真核细胞生物中，能感知细胞能量代谢状态的改变，维持机体的能量代谢平衡[27]。当ATP的产生减少或利用增加，导致细胞内AMP/ATP值增加时，AMPK可被激活，从而有助于ATP再生和抑制ATP消耗，维持能量平衡[28]。此外，AMPK的活化可激活其下游Sirt1活性[29]。Sirt1是一种核蛋白，能通过增强肝脏糖异生、降低脂质积累和参与胰腺的胰岛素分泌使机体ATP的含量上升[30]。同时，Sirt1可介导其下游靶点PGC1α发生去乙酰化，影响PGC1α的活性，最终调控线粒体和脂质代谢基因[31]。而PGClα是一种核转录辅激活因子，参与调节线粒体生物反应和葡萄糖脂肪代谢等生物反应[32]。
本试验中，LPS刺激导致断奶仔猪空肠PGC1α及回肠Sirt1和PGC1α的mRNA表达量极显著降低。罗丽丽等[33]研究发现，LPS诱导PC12细胞凋亡过程中Sirt1的表达受到抑制。而Glu缓解了LPS刺激导致的空肠PGC1α和回肠Sirt1的mRNA表达量的降低，表明Glu可以调节肠道能量代谢相关信号通路。Glu是精氨酸家族氨基酸，可以转化为该家族其他氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酰胺和精氨酸等，进一步在动物体内发挥作用[9]。Kang等[34]研究表明，饲粮添加天冬氨酸可增加肝脏Sirt1的mRNA表达量。Glu可能可以通过转化为天冬氨酸来提高肠道Sirt1的mRNA表达量，进一步激活下游PGC1α，从而促进ATP的产生。本试验中LPS刺激和饲粮添加Glu对空肠和回肠AMPKα1和AMPKα2的mRNA表达量均无显著影响，其原因可能是试验中仔猪肠道能量变化幅度未能达到AMPK感受范围。有研究表明，细胞中ATP的变化水平需达到一定的阈值才能使AMPK活化[35]。
4 结论Glu缓解了LPS刺激导致的断奶仔猪肠道能量代谢障碍，其可能是通过影响肠道能量代谢相关调控因子Sirt1和PGC1α的mRNA表达量，进而促进肠黏膜能量的产生。
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