胃肠道不仅可以消化和吸收饲粮中的营养物质，还可以分泌胃肠激素，对维持机体的消化功能和稳态有重要作用。胃肠道散在分布多种内分泌细胞，包括胃壁细胞、D细胞及胃窦G细胞等[1]，这些细胞能表达多种营养素感应受体[2]，对糖类、脂肪酸、氨基酸及肽等营养素进行感应，调控胃肠激素的分泌，进而影响胃肠道的消化和吸收功能[3]。钙敏感受体(calcium sensing receptor，CaSR)基因能够感应氨基酸和多肽，尤其是芳香族L-氨基酸[如L-苯丙氨酸(L-Phe)和L-色氨酸(L-Try)][4-8]，且在胃肠内分泌细胞中有广泛的表达[3-4]。CaSR基因和H+-K+-ATP酶在胃壁细胞中均有表达，且H+-K+-ATP酶的活性受CaSR基因调控。Busque等[9]研究发现，大鼠胃壁细胞的CaSR基因能介导氨基酸，从而增强与胃酸分泌相关的H+-K+-ATP酶活性。Mace等[10]试验发现，L-氨基酸能激活CaSR基因，从而促进体外培养的大鼠小肠葡萄糖促胰岛素肽(glucose insulinotropic peptide，GIP)、酪酪肽(peptide tyrosine tyrosine，PYY)和胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的分泌。Liou等在研究小鼠I细胞[11]和Hira等[12]在研究小鼠STC-1细胞时均发现，L-Phe能够激活CaSR基因，从而促进胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)的分泌。目前为止，关于蛋白质及氨基酸对胃肠道中CaSR基因的表达及功能影响的研究主要集中在人、小鼠和大鼠等，且主要为体外试验，而在猪的体内研究尚未见报道。鉴此，本试验设计了不同粗蛋白质水平的饲粮，对猪进行长期饲喂，研究其对猪胃肠道CaSR基因表达、胃肠激素分泌及胃功能性酶活性的影响。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计选择35日龄、初始体重为(9.57±0.64) kg的“杜×长×大”杂交断奶仔猪18头，根据饲粮粗蛋白质水平随机分为3组，分别为NP组(NRC标准粗蛋白质水平组)、MP组(较标准粗蛋白质水平组降低3%蛋白质水平)和LP组(较标准粗蛋白质水平组降低6%蛋白质水平)，每组6个重复，每个重复1头仔猪，单栏饲养，自由饮水和采食。根据NRC标准(2012)配制玉米-豆粕型基础饲粮，正式试验前预饲3 d；预饲结束后，分别于仔猪阶段(35~80日龄)饲喂粗蛋白质水平为20%(NP组)、17%(MP组)和14%(LP组)的饲粮，生长猪阶段(81~110日龄)饲喂粗蛋白质水平为18%(NP组)、15%(MP组)和12%(LP组)的饲粮，肥育猪阶段(111~160日龄)饲喂粗蛋白质水平为16%(NP组)、13%(MP组)和10%(LP组)的饲粮，平衡赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苏氨酸(Thr)和Trp，试验期125 d。试验饲粮组成及营养水平见表 1。试验于中国农业科学院亚热带农业研究所猪代谢室进行。试验前对猪舍环境、用具等进行清洗、熏蒸、浸泡消毒处理。试验期间按时进行消毒、驱虫、免疫等工作。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (as-fed basis) |
试验结束前所有试验猪禁食24 h，自由饮水。试验第125天，采集所有试验猪的前腔静脉血液100 mL，待血液凝固后离心取上层血清，-20 ℃保存，用于胃肠激素CCK、GIP和PYY浓度的测定。
1.2.2 胃肠道样品采血后处死试验猪，剖开腹腔，立即取出整个消化道，分离、结扎各部位。将胃食糜充分混匀后尽快取出，-20 ℃保存，用于胃蛋白酶活性分析。冰上剪取胃、十二指肠、空肠、回肠组织及黏膜，在磷酸盐缓冲液(PBS)中漂去内容物后，放入液氮中保存，用于H+-K+-ATP酶活性分析及CaSR基因表达量检测。
1.3 测定指标及方法 1.3.1 血清胃肠激素浓度利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测试验猪前腔静脉血清中胃肠激素CCK、PYY和GIP的浓度，猪CCK (FU-Z044；CCK8 antibody，orb10260，biorbyt)、PYY (FU-Z240，PYY antibody，LS-C191185-400，LifeSpan BioSciences)及GIP (FU-A192；GIP antibody GTX37687 GeneTex)检测试剂盒均购自北京方程生物科技有限公司。
1.3.2 胃功能性酶活性严格按照猪胃蛋白酶和H+-K+-ATP酶的试剂盒说明书检测胃食糜中胃蛋白酶及胃黏膜中H+-K+-ATP酶活性，胃蛋白酶(A080-1)和H+-K+-ATP酶(A069)试剂盒均购自南京建成悦浩科技有限公司。
1.3.3 CaSR基因表达量参照Chomczynski等[13]的方法提取胃肠道各段组织总RNA并按照说明书步骤进行反转录。根据NCBI上猪CaSR序列(NM_001278748)和猪磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(NM_001206359.1)序列设计引物，CaSR引物序列：上游引物5′-CGGGGGACTCTTTCCTATTC-3′，下游引物5′-GCTGGGCTGCTGTTTATTTC-3′，退火温度为60 ℃；GAPDH引物序列：上游引物5′-ATGGTGAAGGTCGGAGTGAAC-3′，下游引物5′-GCTGGGCTGCTGTTTATTTC-3′，退火温度为60 ℃。按文献[14]的方法对猪胃肠道各段组织提取的总RNA进行荧光定量PCR分析。采用2-△△Ct法计算CaSR基因的相对表达量。总RNA提取试剂盒(RNAiso Plus，9108)、反转录试剂盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A)、荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM，RR420A)均购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.4 数据统计与分析试验数据经Excel 2010初步整理后，采用SPSS 20.0软件中的单因素方差(one-way ANOVA)模型进行分析，S-N-K test进行差异显著性检验，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著；采用GraphPad Prism 5分析胃肠道中CaSR基因表达量与胃黏膜中H+-K+-ATP酶、胃食糜中胃蛋白酶活性及血清中胃肠激素浓度的相关关系，P < 0.05为显著相关，0.05≤P < 0.10为呈显著相关趋势。
2 结果 2.1 饲粮粗蛋白质水平对猪胃肠道CaSR基因表达量的影响由图 1可以看出，在胃中，LP组CaSR基因表达量显著高于NP和MP组(P < 0.05)，NP与MP组差异不显著(P > 0.05)；十二指肠及空肠中，MP和LP组CaSR基因表达量均显著低于NP组(P < 0.05)，MP与LP组差异不显著(P > 0.05)；而回肠各组CaSR基因表达量无显著差异(P > 0.05)。
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同一组织数据柱形标注无字母或相同字母者表示差异不显著(P > 0.05), 不同小写字母者表示差异显著(P < 0.05)。 Data columns of the same tissue with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05), while with different small letter superscripts mean sig-nificant difference (P < 0.05). 图 1 饲粮粗蛋白质水平对猪胃肠道CaSR基因表达量的影响 Figure 1 Effects of dietary crude protein level on CaSR gene expression level of gastrointestinal tract of pigs |
由表 2可以看出，与NP组相比，MP和LP组猪血清PYY和GIP浓度显著降低(P < 0.05)，MP与LP组无显著差异(P > 0.05)；MP组血清CCK浓度显著升高(P < 0.05)，LP组无显著变化(P > 0.05)；LP组胃黏膜中H+-K+-ATP酶与胃食糜中胃蛋白酶活性显著升高(P < 0.05)，MP组未表现出显著变化(P > 0.05)。
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表 2 饲粮粗蛋白质水平对猪血清胃肠激素浓度及胃功能性酶活性的影响 Table 2 Effects of dietary crude protein level on the concentrations of gastrointestinal hormones in serum and the activities of gastric function enzymes of pigs |
由表 3可以看出，胃中CaSR基因表达量与胃黏膜中H+-K+-ATP酶和胃食糜中胃蛋白酶活性均呈显著正相关(P < 0.05)；十二指肠CaSR基因表达量与血清GIP浓度呈显著正相关(P < 0.05)，与血清CCK浓度无显著相关性(P > 0.05)，与血清PYY浓度呈显著正相关趋势(0.05≤P < 0.10)；空肠CaSR基因表达量与血清GIP和PYY浓度均呈显著正相关(P < 0.05)，与血清CCK浓度无显著相关性(P > 0.05)；回肠CaSR基因表达量与血清CCK和GIP浓度均无显著相关性(P > 0.05)，与血清PYY浓度呈显著正相关趋势(0.05≤P < 0.10)。
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表 3 猪胃肠道CaSR基因表达量与血清胃肠激素浓度、H+-K+-ATP酶及胃蛋白酶活性相关性分析 Table 3 Correlation between CaSR gene expression level of gastrointestinal tract and the concentration of gastrointestinal hormone in serum and the activities of H+-K+-ATPase and pepsin of pigs |
CaSR基因在啮齿类动物消化道诸多部位中广泛表达，包括食管、胃、小肠[15]。本研究发现CaSR基因在猪胃及小肠各部位均有表达。饲粮粗蛋白质的降解产物主要为小肽和氨基酸[2]，这些降解产物能够激活CaSR[10, 16]。Conigrave等[17-18]发现，细胞外钙离子处于一定浓度下，芳香族氨基酸可以调节CaSR的活性，且随着氨基酸浓度的升高，CaSR基因表达量也随之升高。本研究发现，当饲粮粗蛋白质水平降低时，胃CaSR基因表达量升高，这可能是因为饲粮中平衡的4种氨基酸(Lys、Met、Thr和Try)中含有可以激活CaSR基因的Try (随着饲粮粗蛋白质水平的降低色氨酸添加量增加)，饲粮进入胃中粗蛋白质尚未降解为氨基酸，所以额外添加的Try含量越高，对CaSR的激活作用越强，CaSR基因表达量则越高；十二指肠和空肠的CaSR基因表达量随饲粮粗蛋白质水平的降低而降低，可能是由于饲粮中粗蛋白质在胃中经过消化后产生的部分肽以及氨基酸进入小肠后激活了十二指肠和空肠的CaSR基因而使其表达量升高；而回肠的CaSR基因表达量虽随着粗蛋白质水平的降低而略有降低，但并未表现出显著变化，这可能是因为氨基酸在十二指肠和空肠中已经被大量消化吸收，到达回肠的氨基酸浓度较低，故未能调控CaSR的基因表达量。
研究表明，CaSR基因在胃壁细胞中表达量较高[19-20]，L-芳香族氨基酸可以激活CaSR基因，从而增强H+-K+-ATP酶和胃蛋白酶活性[9, 21]。本研究中，随着饲粮粗蛋白质水平的降低，色氨酸添加量逐渐增加，胃蛋白酶与H+-K+-ATP酶的活性升高；相关性分析显示，随着猪胃CaSR基因表达量的升高，H+-K+-ATP酶与胃蛋白酶活性随之升高，二者存在显著正相关，与上述研究结果一致。研究还发现，随着粗蛋白质摄入水平的增加，人体内的GIP、PYY等激素的分泌增加[22]。本研究结果表明，随饲粮粗蛋白质水平的降低，胃肠激素PYY、GIP的分泌也降低。研究也表明，氨基酸对大鼠小肠GIP、CCK、PYY的分泌有促进作用，CaSR特异性激活剂NPS R568可以显著增强这种作用，而CaSR特异性抑制剂Calhex 231显著抑制这种作用[11]。据此，本试验将猪小肠CaSR基因表达量与胃肠激素进行了相关性分析，结果显示，除CCK外，其余胃肠激素与十二指肠和回肠的CaSR基因表达量呈显著或趋于显著的正相关关系。当饲粮粗蛋白质水平降低时，小肠中蛋白质水解产生的氨基酸的水平降低，使CaSR对氨基酸的敏感性降低，导致胃肠激素分泌量下降。以上结果初步表明，氨基酸可以通过激活CaSR调节胃肠激素分泌、胃蛋白酶及H+-K+-ATP酶活性。Shi等[23]和Leray等[24]研究表明，饲粮中粗蛋白质水平降低会促进胃肠道CCK的释放。本研究中，蛋白质水平降低3%，小肠CaSR基因表达量降低，但CCK的分泌量有所升高，可能是由于营养摄入不足所产生的代偿性反应，以保证在低蛋白质水平的情况下，机体仍能保持稳定的状态。目前，由于体内环境复杂，影响因素多，有关蛋白质及其水解产物与CaSR对胃肠激素分泌作用的影响在机体内的研究甚少。鉴此，在后续研究中，课题组计划采用体外灌流技术研究猪胃肠道CaSR基因表达量与胃肠激素分泌的关系，并利用免疫组化及免疫荧光技术探究氨基酸激活CaSR调节胃肠激素分泌、胃功能性酶活性的信号通路，揭示猪胃肠道CaSR基因表达量与胃肠激素分泌和胃功能性酶活性之间的关系及其机制。
4 结论综上所述，当饲粮中粗蛋白质水平降低时会影响猪胃肠道中CaSR基因的表达量，从而影响部分胃肠激素(GIP、PYY)的分泌以及胃功能性酶(胃蛋白酶、H+-K+-ATP酶)活性。
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