2. 中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所, 动物营养学国家重点实验室, 北京 100193
2. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
氧化应激是动物机体内氧化还原系统失衡的状态，是导致人类和动物综合病征的主要原因之一。正常情况下，机体内有一系列的适应机制保护细胞免于损伤，多种有害刺激可以打破机体内氧化还原系统的平衡状态，促使细胞凋亡甚至导致病理损伤[1]。敌草快(diquat)为氧化还原型双吡啶除草剂，属中等毒性化合物，进入动物机体后利用分子氧产生氧自由基和其他活性氧(ROS)，导致氧化应激[2]。硫辛酸(lipoic acid，LA)作为高效抗氧化剂可以减少ROS的产生，减弱DNA的氧化损伤，抑制脂质过氧化，并能很大程度地改善体内抗氧化防御系统，对氧化应激引起的疾病有显著的缓解作用[3]。氧化应激通过线粒体、死亡受体、内质网应激等途径介导细胞凋亡[4]；也可能通过激活丝裂原活化蛋白激酶通路、活化核转录因子κB (NF-κB)并诱导其表达、激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)途径诱导细胞凋亡[5]。内源性和外源性通路不一定相互独立，二者的某些构成因素可能对单一刺激引起的凋亡过程具有协同调节作用。肠道作为应激反应的中心器官，在机体遭受应激源刺激时最先出现缺氧缺血的状况[6]。氧化应激可导致肠道上皮细胞正常生长代谢受阻、细胞功能受损，进一步引发炎症反应、肠道大量细胞出现凋亡，最终可导致肠黏膜形态结构受损、肠道通透性升高、肠道免疫机能障碍[7]。Diquat作为一种氧化应激诱导剂已经分别应用于野生型大鼠[8]、断奶仔猪[9]和生长猪[10]，并成功建立了氧化应激模型。LA具有双硫五元环结构，有显著的亲电性和与自由基反应能力，在生物体内可以转化为还原型的二氢硫辛酸，并能够再生为内源性抗氧化剂。此外，LA和二氢硫辛酸能够调节NF-κB的激活，且LA能够阻止艾滋病病毒(HIV)复制，影响癌基因(C-fos)的表达，对自由基代谢过程中的中间产物过氧化氢(H2O2)造成的细胞DNA氧化损伤具有显著的保护作用[11]。根据氧化损伤理论开发有针对性的饲料添加剂已成为国内外的一个研究热点。然而，近年来的研究多选用小型动物建立氧化应激模型，且有关氧化应激促使细胞凋亡的研究大都限制在细胞水平，而建立大中型动物模型研究氧化应激引起细胞凋亡的试验相对较少，其中将LA作为营养素来缓解氧化应激导致细胞凋亡的动物试验更为少见。本试验以育肥猪为研究对象，选用diquat诱导育肥猪产生氧化应激，探讨氧化应激对育肥猪生长性能、血浆和空肠氧化还原状态及空肠细胞凋亡的影响；选择LA为营养素，旨在探究LA对diquat诱导的氧化应激育肥猪生长性能、血浆和空肠氧化还原状态及空肠细胞凋亡的调控作用，为LA在育肥猪饲粮中作为抗氧化应激剂的合理应用提供参考，并为进一步揭示LA缓解空肠氧化及细胞凋亡的机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计采用2×2双因子试验设计，腹腔滴注diquat (每千克体重0、8 mg)和饲粮中添加LA (0、800 mg/kg)为2个主效应，共形成4个组，分别为-Diquat-LA组(0 mg/kg diquat+0 mg/kg LA)、-Diquat+LA组(0 mg/kg diquat+800 mg/kg LA)、+Diquat-LA组(8 mg/kg diquat+0 mg/kg LA)、+Diquat+LA组(8 mg/kg diquat+800 mg/kg LA)。Diquat购自美国Sigma公司；LA购自美国Amresco公司，纯度≥99%。
试验选取24头体重为(70.64±3.61) kg的健康大白阉公猪，根据体重相近的原则随机分为4个组，每组6个重复，每个重复1头猪。试验期29 d。于试验第1天开始在-Diquat+LA组和+Diquat+LA组育肥猪饲粮中添加800 mg/kg LA，直到试验结束，其他2组不添加；于试验第15天对+Diquat-LA组和+Diquat+LA组育肥猪腹腔滴注diquat，每头育肥猪一次性滴注量为每千克体重8 mg，以250 mL生理盐水稀释后采用输液器滴注，其他2组育肥猪滴注等量的生理盐水，滴注耗时约5 min。
1.2 试验饲粮与饲养管理参考NRC (2012)及《猪饲养标准》(NY/T 65-2004)相应阶段营养需要配制玉米-豆粕型基础饲粮(粉料)，基础饲粮组成及营养水平见表 1。为了保证饲粮质量，根据育肥猪日采食量估算每周采食总量，并根据配方每周配料1次，配料时按照试验设计在基础词粮中分别添加0、800 mg/kg的LA构成2种试验饲粮。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所试验基地猪场进行。试验前圈舍彻底清洗，以2%~3% NaOH和百毒杀先后2次消毒，再密闭熏蒸24 h (髙猛酸钾：甲醛=1：2，V/V)，通风干燥5 d，转入育肥猪当天再用百毒杀消毒。转入的育肥猪于160 cm×90 cm×120 cm的代谢笼中单笼饲养，适应约1周后开始正式试验。试验期间由专人对育肥猪进行管理和饲喂，所有操作均严格按照饲养手册进行，尽可能减少与试验无关的应激因素，环境温度控制在15~20 ℃，相对湿度40%~60%。
1.3 样品采集试验第29天，用含肝素钠抗凝剂的采血管采集育肥猪前腔静脉血液，静置10~15 min后，3 000 r/min离心10 min分离血浆，-20 ℃保存。用电击棒(110 V，5 A)将育肥猪击晕，悬挂颈动脉放血，整个过程在30 s内完成以确保将育肥猪的痛苦降到最低。待育肥猪没有角膜反射后，立即沿腹中线剖开，取出内脏，找到空肠中段部位剪取1~2 cm空肠段，用预冷的生理盐水冲洗掉食糜后，放入离心管中，液氮速冻，-80 ℃保存。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生长性能分别在正式试验开始前、腹腔滴注diquat前和屠宰前称取育肥猪的体重；试验期间记录每次的投料量和饲槽中的剩料量，以计算每头猪的日采食量。计算育肥猪的平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(F/G)。由于试验第15天对+Diquat-LA组和+Diquat+LA组育肥猪腹腔滴注diquat，所以不测定这2组第1~14天的生长性能数据。
1.4.2 血浆抗氧化指标血浆中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量均采用比色法测定，试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.4.3 空肠组织抗氧化指标将空肠组织样品从-80 ℃冰箱取出放入研钵，边倒入液氮边研磨，直至磨成粉末，准确称量粉末重量，并按照1：9(m/V)加入生理盐水制成10%的组织匀浆；在4 ℃的低温冷冻离心机中3 000 r/min离心15 min，取上清原液备用；将原液用生理盐水稀释成1%的组织匀浆，用南京建成生物工程研究所提供的考马斯亮蓝试剂盒测定1%组织匀浆中的蛋白质浓度。组织中SOD、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)以及H2O2含量用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定。
1.4.4 空肠组织细胞凋亡蛋白相对表达量免疫印迹杂交(Western blotting)试验检测热休克蛋白70(HSP70)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的蛋白质相对表达量。取育肥猪空肠组织100 mg，用组织裂解液裂解后，按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作说明书提取空肠组织蛋白质；将提取好的空肠组织蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(120 V，90 min)，电泳结束后以湿转法将蛋白质转印至硝酸纤维素(NC)膜上(350 mA，90 min)；将转印完的NC膜完全浸没在3%牛血清白蛋白-洗涤缓冲液(BSA-TBST)中室温轻摇30 min；用3% BSA-TBST稀释一抗(HSP70鼠单抗，TDY 062，1：2000；caspase-3兔多抗，TDY 411，1：2000)，室温孵育10 min，4 ℃过夜；第2天从4 ℃拿出膜，室温孵育30 min；洗涤缓冲液(TBST)洗膜5次，每次3 min；用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗[辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L) HRP，1：10 000]，室温轻摇40 min；TBST洗膜6次，每次3 min；增强化学发光(ECL)试剂加到膜上后反应3~5 min，曝光10 s~5 min (曝光时间随不同光强度而调整)，显影2 min，定影；采用Image Master Total Lab V 1.10图像分析软件对图像进行灰度分析，分别以HSP70/磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、caspase-3/GAPDH表示HSP70、caspase-3的蛋白质相对表达量。
1.5 数据处理与分析采用SAS 9.2软件对数据进行两因素有互作的方差分析，并分别在diquat (有、无)刺激下，对添加LA组和未添加LA组进行t检验，所有数据均采用“平均值±标准差”表示，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。
2 结果与分析 2.1 LA和diquat对育肥猪生长性能的影响由表 2可知，饲粮中添加LA和腹腔滴注diquat对育肥猪的ADFI、ADG和F/G均无显著交互作用(P > 0.05)。试验1~14 d，饲粮中添加LA对育肥猪的ADFI、ADG和F/G均无显著影响(P > 0.05)。试验15~28 d，腹腔滴注diquat对育肥猪的ADFI、ADG和F/G均有极显著的影响(P < 0.01)，使育肥猪的ADFI (3 093.5 g/d vs. 2 238.5 g/d，-27.64%)和ADG (1 080.5 g/d vs. 562.5 g/d，-47.94%)降低、F/G升高(2.895 vs. 4.065，+40.41%)；饲粮中添加LA使ADFI显著升高(2 451 g/d vs. 2 881 g/d，+17.54%；P < 0.05)、ADG极显著升高(765.5 g/d vs. 877.5 g/d，+14.63%；P < 0.01)，但F/G未发生显著变化(P > 0.05)。与+Diquat-LA组相比，+Diquat+LA组育肥猪的ADFI (1 900 g/d vs. 2 577 g/d，+35.63%)和ADG (477 g/d vs. 648 g/d，+35.85%)极显著升高(P < 0.01)；-Diquat-LA组与-Diquat+LA组育肥猪的生长性能指标无显著差异(P > 0.05)。这表明饲粮中添加LA缓解了diquat引起的育肥猪ADFI和ADG的下降，而在无diquat刺激时饲粮中添加LA对育肥猪生长性能的影响较小。
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表 2 LA和diquat对育肥猪生长性能的影响 Table 2 Effects of LA and diquat on growth performance of finishing pigs |
由表 3可知，饲粮中添加LA和腹腔滴注diquat对育肥猪血浆抗氧化指标均无显著交互作用(P > 0.05)。腹腔滴注diquat使育肥猪血浆SOD (39.73 U/mL vs. 22.50 U/mL，-43.37%)、GSH-Px (597.85 U/mL vs. 461.78 U/mL，-22.76%)和CAT活性(11.59 U/mL vs. 5.86 U/mL，-49.44%)极显著降低(P < 0.01)，血浆MDA含量(1.855 nmol/mL vs. 2.810 nmol/mL，+51.48%)极显著升高(P < 0.01)。饲粮中添加LA对育肥猪血浆SOD、GSH-Px和CAT活性及MDA含量均无显著影响(P > 0.05)。与+Diquat-LA组相比，+Diquat+LA组育肥猪血浆SOD活性(20.87 U/mL vs. 24.13 U/mL，+15.62%)显著提高(P < 0.05)；-Diquat-LA组与-Diquat+LA组育肥猪血浆抗氧化指标无显著差异(P > 0.05)。这表明饲粮中添加LA缓解了diquat引起的育肥猪血浆SOD活性的下降，一定程度上改善了氧化应激下育肥猪血浆的氧化还原状态；而在无diquat刺激时，饲粮中添加LA对育肥猪血浆氧化还原状态的作用较小。
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表 3 LA和diquat对育肥猪血浆抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of LA and diquat on plasma antioxidative indices of finishing pigs |
由表 4可知，饲粮中添加LA和腹腔滴注diquat对育肥猪空肠SOD活性有极显著的交互作用(P < 0.01)，对空肠MnSOD活性、T-AOC和H2O2含量无显著的交互作用(P > 0.05)。腹腔滴注diquat使育肥猪空肠SOD (183.20 mg/g prot vs. 131.45 mg/g prot，-28.25%)、MnSOD活性(40.76 mg/g prot vs. 26.22 mg/g prot，-35.67%)和T-AOC (2.53 mg/g prot vs. 1.61 mg/g prot，-36.24%)极显著降低(P < 0.01)，H2O2含量(3.47 mmol/g prot vs. 4.87 mmol/g prot，+40.55%)极显著升高(P < 0.01)。饲粮中添加LA使育肥猪空肠MnSOD活性(31.74 mg/g prot vs. 35.24 mg/g prot，+11.01%)极显著升高(P < 0.01)，对空肠SOD活性、T-AOC和H2O2含量均无显著影响(P > 0.05)。与+Diquat-LA组相比，+Diquat+LA组育肥猪空肠SOD (120.39 mg/g prot vs. 142.50 mg/g prot，+18.37%)和MnSOD (23.42 mg/g prot vs. 29.01 mg/g prot，+23.87%)活性极显著提高(P < 0.01)，-Diquat-LA组与-Diquat+LA组育肥猪空肠抗氧化指标无显著差异(P > 0.05)。这表明饲粮中添加LA缓解了diquat引起的育肥猪空肠SOD和MnSOD活性的下降，一定程度上改善了氧化应激下育肥猪空肠氧化还原状态；而在无diquat刺激时，饲粮中添加LA对育肥猪空肠氧化还原状态的作用较小。
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表 4 LA和diquat对育肥猪空肠抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of LA and diquat on jejunum antioxidative indices of finishing pigs |
由图 1可知，腹腔滴注diquat使育肥猪空肠HSP70和caspase-3的蛋白质相对表达量升高，饲粮中添加LA使育肥猪空肠HSP70和caspase-3的蛋白质相对表达量降低。由表 5可知，饲粮中添加LA和腹腔滴注diquat对育肥猪空肠HSP70和caspase-3的蛋白质相对表达量均无显著的交互作用(P > 0.05)；腹腔滴注diquat使育肥猪空肠HSP70(0.555 vs. 0.830，+49.55%)和caspase-3(0.425 vs. 0.760，+78.82%)蛋白质相对表达量极显著升高(P < 0.01)，饲粮中添加LA使HSP70(0.710 vs. 0.675，-4.93%；P < 0.05)、caspase-3(0.615 vs. 0.570，-7.32%；P=0.052)的蛋白质相对表达量降低。这表明无论育肥猪是否处于应激状态，饲粮中添加LA都能在一定程度上抑制空肠细胞的凋亡。
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图 1 空肠HSP70和caspase-3的蛋白质相对表达量 Figure 1 Protein relative expression levels of HSP70 and caspase-3 in jejunum |
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表 5 LA和diquat对育肥猪空肠HSP70和caspase-3的蛋白质相对表达量的影响 Table 5 Effects of LA and diquat on protein relative expression levels of HSP70 and caspase-3 in jejunum of finishing pigs |
参考李丽娟[9]每千克体重腹腔注射12 mg diquat诱导了断奶仔猪产生氧化应激；徐静等[10]每千克体重一次性腹腔注射8 mg diquat溶液可诱导生长猪产生氧化应激，且氧化应激效应可持续28 d。本试验每千克体重腹腔滴注8 mg diquat，所有育肥猪均出现急躁、空口咀嚼、呕吐、厌食等现象，持续1周左右后采食量逐渐恢复；非应激组滴注等量的生理盐水未见猪只行为异常。这与前人的研究结果[9-10, 12-14]相似，而本研究选择育肥猪作为试验动物为建立大中型氧化应激动物模型奠定了基础。虽然LA缓解diquat导致的氧化应激的研究尚未见报道，但有研究表明LA可以用于治疗百草枯(paraquat)引起的大鼠中毒[15]，而paraquat作为一种有机杂环类接触性除草剂与diquat的结构和功能相似。
3.1 LA和diquat对育肥猪生长性能及抗氧化指标的影响本试验结果显示，在diquat诱导的氧化应激状态下，育肥猪的ADFI和ADG极显著降低，F/G极显著升高，说明diquat诱导的氧化应激对育肥猪产生了较大的副作用，并导致育肥猪的生长性能降低，这一结果与Zheng等[12]、Lv等[13]、赵娇等[14]在断奶仔猪上的研究结果相似，说明本试验构建的育肥猪氧化应激模型成功。此外，饲粮中添加LA使育肥猪的ADFI显著升高、ADG极显著升高，特别是在应激状态下，LA对ADFI和ADG的改善作用尤为显著，表明饲粮中添加LA对育肥猪的氧化应激有一定的缓解作用，而具体的作用机理还需进一步的研究。
Diquat的作用是夺取分子氧的电子，使分子氧转变为ROS进而造成氧化应激；LA具有双硫五元环结构，具有显著的亲电性和与自由基反应的能力，可以减少ROS的产生。Diquat进入机体后，ROS水平剧增，大量消耗SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化酶类，导致机体氧化还原系统严重失衡。徐静等[10]研究表明，diquat极显著降低了生长猪第7、14、21和28天血清GSH-Px和SOD活性，显著提高了血清MDA含量，第7、14、21和28天血清CAT活性有降低趋势。本试验结果显示，应激组育肥猪血浆SOD、GSH-Px、CAT活性均极显著低于非应激组，MDA含量极显著高于非应激组；且在应激状态下，饲粮中添加LA组血浆SOD活性显著高于未添加LA组，表明diquat诱导了育肥猪的氧化应激，而LA能通过清除体内过量的ROS来缓解机体的氧化应激。
肠道极易受氧化损伤[16]，腹腔滴注的diquat进入机体后首先要通过肠黏膜，肠黏膜氧化应激产生的过量的氧自由基可以破坏DNA、生物脂质大分子、蛋白质和其他生物大分子；过量的氧自由基也可以通过抗氧化系统(包括非酶成分和抗氧化酶系[17-18])被消除。在肠道内环境中，单个氧化还原体系分别独立存在于线粒体、细胞核和内质网等细胞器中，任何一个氧化还原体系被破坏都会导致肠道黏膜的氧化应激[19]，进而导致肠道病变。宋小珍[20]在断奶仔猪上的研究表明，氧化应激使猪肠道SOD和GSH-Px活性显著降低，MDA含量显著上升。Chen等[21]研究表明，小肠上皮细胞添加谷胱甘肽(GSH)后使细胞液中SOD和CAT的活性有一定程度的提高，原因可能是GSH清除了部分自由基，使得自由基钝化抗氧化酶的能力减弱。上述试验表明，氧化应激导致了抗氧化酶活性的降低，而添加营养素能够一定程度地提高抗氧化酶的活性。本试验结果显示，应激组育肥猪空肠SOD和MnSOD活性以及T-AOC均极显著低于非应激组，空肠H2O2含量极显著高于非应激组；且在氧化应激情况下，饲粮中添加LA使空肠MnSOD活性极显著升高。SOD包括铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)和MnSOD 2种分型，其中MnSOD为线粒体中清除自由基的抗氧化物酶，表明本试验diquat诱导的氧化应激可能导致了细胞器的损伤。LA的特殊化学结构使其同时具有水溶性和脂溶性，易于透过细胞膜深入细胞器中发挥作用；LA的特殊化学结构还决定了LA具有清除机体过量的自由基、抑制脂质过氧化和减弱DNA的氧化损伤等功能[22]。因此，饲粮中添加LA能在很大程度上改善体内抗氧化防御系统，进而推测LA可能是通过维持细胞器中氧化还原体系的平衡来修复空肠氧化，但其修复机理尚不明确。
3.2 LA和diquat对育肥猪空肠细胞凋亡的影响在机体遭受氧化应激的情况下，ROS能通过激活一系列信号通路来诱导细胞凋亡[23]。研究表明，线粒体接受凋亡信号释放细胞色素C，细胞色素C受B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族蛋白的调控参与死亡受体通路，活化特定的caspase-3蛋白质，诱导细胞凋亡[24]；当toll样受体4(TLR4)与特异性配体脂多糖(LPS)结合后，激活NF-κB途径[25]，NF-κB可促进Bcl-2家族中凋亡因子的表达、增加线粒体膜的通透性、促进细胞色素C的释放，进而导致细胞凋亡；NF-κB也可刺激白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的表达，导致caspase-3高表达，进而引发细胞凋亡[26]。研究表明，无论是通过哪种途径，最终都会激活caspase-3前体物进而导致细胞凋亡[5]。本试验结果显示，腹腔滴注diquat的育肥猪空肠caspase-3蛋白质相对表达量极显著高于无diquat刺激的育肥猪，由此推测，氧化应激可能导致了育肥猪空肠细胞凋亡，但具体是通过哪种途径还需要进一步探究。
热休克蛋白(HSPs)在细胞生长调控和凋亡中发挥着重要作用，有关HSPs与细胞凋亡信号转导途径调节机制的研究发现，HSPs能够在Fas死亡受体途径[27]、c-Jun氨基末端激酶(JNK)/应激活化蛋白激酶(SAPK)途径[28]和caspase途径[29]等发挥调节作用，并且部分依赖于HSPs的“分子伴侣”功能，控制着细胞生命进程。由于HSP70分子的C端含有高度保守的核酸序列，此序列的缺失或突变会导致其结合底物能力的丧失，因此，推测该序列或许与HSP70对caspase-3的抑制作用有关。然而有研究表明，低浓度和高浓度的H2O2可分别诱导caspase依赖性和非依赖性的细胞凋亡，HSP70对2类凋亡都具有抑制作用[30]。本试验结果显示，diquat诱导的氧化应激使HSP70的蛋白质相对表达量急剧升高，而caspase-3的蛋白质相对表达量没有随着HSP70的蛋白质相对表达量的升高而有所降低，说明HSP70可能作用于凋亡过程早期阶段，而caspase-3是否参与了HSP70对凋亡的调节则值得商榷。
有研究表明，LA能够调节NF-κB的激活，并阻止HIV复制，从而影响C-fos的表达[11]。Bojunga等[31]报道，应用LA干预可以抑制细胞凋亡，下调caspase的活性，增加凋亡保护因子Bcl-2的表达，起到保护机体的作用。本试验结果显示，饲粮中添加LA对HSP70和caspase-3蛋白质相对表达量均有抑制作用，特别是在diquat诱导的氧化应激情况下，其作用更为显著，可能是LA通过清除体内过量的自由基进而缓解了应激，导致HSP70的蛋白质表达量有所降低；LA调节NF-κB的激活，抑制了caspase-3途径，进而阻止了育肥猪空肠细胞的凋亡。
4 结论腹腔滴注diquat降低了育肥猪的生长性能，破坏了血浆和空肠的氧化还原状态，并引起空肠细胞凋亡。Diquat诱导发生氧化应激后，在饲粮中添加LA能够提高育肥猪的生长性能，改善血浆和空肠的氧化还原状态，并能在一定程度上减缓空肠细胞凋亡。
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