鱼类骨骼肌占鱼类躯体总质量的30%～80%^[1]。鱼类体增重很大程度上与骨骼肌质量增加有关。骨骼肌由有丝分裂后的多核肌纤维构成，未分化的单核成肌细胞增殖，退出细胞周期后，表达特殊蛋白质，融合形成多核肌管，最终发育为成熟肌纤维。因此，肌细胞的增殖分化对骨骼肌的生长发育具有非常重要的意义^[2]。精氨酸(arginine,Arg)在鱼体组织中含量丰富，有促进内分泌的作用^[3-4]。研究表明，Arg及其部分代谢产物[一氧化氮(NO)、肌酸]能直接或间接促进动物生长激素(growth hormone，GH)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)以及胰岛素(insulin，INS)的分泌，调节生肌过程中相关基因和蛋白质的表达，从而影响肌细胞的增殖分化。本文简要综述Arg对鱼类肌细胞增殖分化的影响及其机制，为进一步深入研究Arg对鱼类肌肉生长的调控作用及其机制提供参考。

1 Arg对鱼类肌细胞增殖分化的影响

肌细胞通过位于肌膜和基膜之间的梭形单核 干细胞有丝分裂进行增殖，最终表现为肌细胞数量增多。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是反映细胞增殖状态的指标。用2.87 mmol/L L-Arg处理大西洋鲑肌细胞，PCNA阳性细胞百分数显著提高^[5]，说明Arg能促进鱼类肌细胞的增殖。鱼类肌细胞的融合分化导致肌纤维肥大。Neu等^[6]在罗非鱼幼鱼饲料中添加L-Arg后发现可显著增加直径大于20 μm的白肌纤维数量，说明Arg能刺激肌肉纤维肥大生长，促进鱼类肌细胞分化。细胞总核密度是指苏木精-伊红(HE)染色后单位面积能观察到的细胞核数，可以反映细胞增殖情况。融合系数指肌管中的细胞核数占培养基中总细胞核数的百分比，表面肌管密度指肌管面积与培养面积的比值，两者反映肌细胞融合分化的程度。研究表明，用1 mmol/L L-Arg处理小鼠成肌细胞(C₂C₁₂细胞)，细胞总核密度增加了27%，细胞融合系数和表面肌管密度分别增加了77%和72%^[7]，说明Arg能刺激C₂C₁₂细胞增殖分化，促进肌管生成。

2 Arg调节肌细胞增殖分化的机制 2.1 Arg可能通过调控代谢生物活性分子的产生调节鱼类肌细胞的增殖分化 2.1.1 NO途径

Arg是生物体内NO合成的前体物质，鱼体能通过一氧化氮合酶(nitric oxide syntheses，NOS)利用Arg合成NO。在饲料中添加L-Arg后，异育银鲫血清中的NO含量呈剂量依赖性增加^[8]。NOS是NO合成的关键酶，其活性反映组织产生NO的能力。研究表明，在军曹鱼幼鱼饲料中添加2.57% L-Arg，血清总NOS活性提高30.9%^[9]；异育银鲫肝脏总NOS活性随饲料中L-Arg水平的增加而增强^[8]。由此可知，Arg能提高NOS活性，促进NO生成。NO是细胞内重要的信号分子，当肌肉组织损伤时，肌肉纤维释放出NO，活化静止的卫星细胞，介导肌细胞的增殖分化^[10]。亚硝基左旋精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methylester，L-NAME)是NOS的抑制剂，能使NOS活性受到抑制，阻断NO的产生。Long等^[7]用0.1 mmol/L L-NAME与1 mmol/L L-Arg联合处理C₂C₁₂细胞，使总核密度、细胞融合系数以及表面肌管密度分别下降15.8%、90.5%和92.9%。这表明L-NAME能抑制Arg对C₂C₁₂细胞的增殖分化作用，NO合成受阻能抑制Arg对C₂C₁₂细胞增殖分化的促进作用。因此，Arg可能通过上调NO合成来促进肌细胞的增殖分化。

配对盒基因7(paired box7，pax7)是肌细胞形成所必需的上游调节分子，调节肌细胞的增殖。成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen，MyoD)是成肌细胞形成相关的基因，在早期成肌过程中表达，参与成肌细胞增殖。肌形成蛋白(myogenin，MyoG)在分化末期表达，能控制肌细胞融合的起始，是肌管和肌纤维形成的必需因子。研究发现，用0.05 mmol/L L-Arg与L-NAME联合处理鸡胸肌细胞，pax7、MyoD和MyoG mRNA表达量显著降低^[11]。这说明L-NAME能下调Arg对pax7、MyoD和MyoG基因转录的促进作用，从而抑制肌细胞增殖分化。因此，Arg可能通过促进NO生成来上调pax7、MyoD和MyoG基因的转录，促进肌细胞增殖分化。但Arg是否通过NO途径介导鱼类肌细胞增殖分化有待进一步研究。

2.5 mmol/L L-Arg能抑制因生长因子和营养素缺乏导致的肌管萎缩，但2.5 mmol/L L-Arg和10 mmol/L L-NAME联合处理C₂C₁₂肌管的结果与之相比，肌管直径无显著变化^[12]。这说明L-Arg也可不依赖NO介导肌细胞融合。因此，除了NO途径，L-Arg还可能通过其他途径介导肌细胞增殖分化。但在鱼类上未见相关报道，有待进一步研究。

2.1.2 多胺途径

Arg能代谢产生鸟氨酸，后者经鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)合成腐胺，腐胺进一步代谢产生亚精胺和精胺，三者合称多胺。多胺是重要的生物活性物质，能参与蛋白质合成、细胞增殖分化，还能调节基因的表达。肌卫星细胞在肌肉受损后能增殖和自我更新。对小鼠进行肌肉切割术后发现多胺水平提高了2倍^[13]，表明多胺可能参与肌肉损伤后肌卫细胞的增殖过程。肌动蛋白聚合形成多聚纤维丝，多聚纤维丝进一步合成微丝，可参与肌原纤维的形成。0.5 mmol/L精胺和亚精胺使兔肌细胞肌动蛋白的聚合度达到90%^[14]；Erwin等^[15]研究发现，L6成肌细胞分化时伴随腐胺和亚精胺水平的提高，同时腐胺能缓解鸟氨酸脱羧酶不可逆抑制剂对L6成肌细胞分化的抑制作用。上述结果表明多胺参与了肌细胞分化过程。Tu等^[8]发现随着饲料中L-Arg水平的增加，异育银鲫肝脏中精氨酸酶的活性呈剂量依赖性增加。这表明Arg能提高精氨酸酶的活性，促进多胺前体物质的形成。因此，Arg可能通过促进多胺的生成参与调节鱼类肌细胞增殖分化。细胞内¹⁴C胸腺嘧啶脱氧核苷酸含量可反映细胞的增殖活性。GC7(N1-guanyl-1,7-diaminoheptane)是脱氧羟腐氨酸合成酶的抑制剂，能阻断亚精胺活化真核细胞翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A，eIF5A)介导的翻译起始。研究发现，25 μmol/L GC7显著降低C₂C₁₂细胞中的¹⁴C胸腺嘧啶脱氧核苷含量，定量PCR(qPCR)检测发现其特殊蛋白肌间蛋白1(Myom1)的表达量极显著下降，表明GC7显著抑制了C₂C₁₂细胞的增殖分化^[16]。因此，亚精胺能提高eIF5A的活性，上调肌细胞蛋白质的合成，促进肌细胞的增殖分化。但目前多胺的作用机制还不确定，Arg是否通过多胺来影响鱼类肌细胞的增殖分化有待进一步研究。

2.1.3 肌酸途径

Arg在咪基转移酶的作用下生成肌酸。肌酸能潜在治疗肌肉萎缩等肌肉疾病^[17-18]。用5 mmol/L肌酸处理C₂C₁₂细胞后肌管直径极显著增加^[17]，融合指数增加40%^[19]。生肌调节因子4(MRF4)作为重要的生肌调节因子，能调控肌管的分化，其蛋白活性的缺失将导致肌肉发育不良。5 mmol/L肌酸能使C₂C₁₂细胞MyoD mRNA的表达量提高1.3倍，MyoG和MRF4 mRNA的表达量分别提高56%和2.3倍^[17]。此外，肌酸还能提高肌细胞中肌球蛋白重链等肌肉特殊蛋白质的合成^[17]。上述结果说明Arg能促进C₂C₁₂细胞的增殖分化。因此，Arg可能通过肌酸上调生肌调节因子的转录以及相关肌肉特殊蛋白的合成，进而促进肌细胞的增殖分化。但目前缺乏肌酸对鱼类肌细胞增殖分化影响的相关研究报道。

p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路是MAPK级联中的一条信号途径，能参与调节肌细胞的增殖分化。肌酸能通过p38通路加快C₂C₁₂细胞分化过程^[19]。p38有4个异构体(α、β、γ、δ)，试验证明对肌细胞分化过程影响最大的是p38α。p38α基因缺失的小鼠肌细胞表现出过度增殖，单核肌细胞数量极显著增加，肌管数量极显著减少^[20]。这说明p38α对小鼠肌细胞的作用可能是抑制增殖促进分化。目前Arg调节p38 MAPK基因表达的途径尚不明确。Elisabeth等^[21]报道Arg能上调大西洋鲑肝脏p38 MAPK基因的表达，说明Arg可调节鱼类肝脏p38 MAPK信号通路的活性。Arg是否通过肌酸来上调鱼类肌肉p38 MAPK基因的表达来调节肌细胞的增殖分化还有待研究。

2.2 Arg可能通过调节内分泌激素的分泌间接影响鱼类肌细胞的增殖分化

GH、IGFs以及INS作为动物生长相关的激素，能够直接作用于组织细胞，增强新陈代谢，促进细胞生长和发育。

2.2.1 GH

GH由垂体产生，能刺激鱼类肌细胞的增殖分化^[22]。研究表明，饲料中添加Arg能显著提高大口黑鲈垂体中的GH mRNA的表达和血清GH水平^[3]。因此，Arg可能通过促进垂体GH合成和分泌来影响肌细胞的增殖分化。但是，L-Arg对斑点叉尾 血清GH水平无显著影响^[23]，其原因可能与：1)鱼的种类有关；2)鱼的大小有关。Arg可提高体重为51.6 g的异育银鲫垂体中GH mRNA的表达和血清GH水平，而对体重为147.8 g的异育银鲫垂体中GH mRNA的表达和血清GH水平却无影响^[8]。

鱼类骨骼肌的形成受到一些生肌调节因子的调控，其中MyoD和Myf5在成肌细胞增殖过程中表达，而MyoG与MRF4在分化过程中表达。用GH处理金头鲷肌细胞，MyoD2和Myf5 mRNA的表达量显著提高^[24]。GH转基因斑马鱼肌肉中MyoG过量表达^[25]。虹鳟腹腔注射重组牛GH后能显著提高白肌中肌球蛋白重链的蛋白质表达量^[26]。上述研究表明GH可通过调节Myf5、MyoD和MyoG和肌球蛋白重链的转录水平促进鱼类肌细胞的增殖分化。因此，Arg也可能通过调控GH分泌，从而上调生肌调节因子的表达和相关蛋白质的合成来促进鱼类肌细胞的增殖分化。此外，Uretsky等^[27]研究表明NO能促进金鲫GH的分泌，说明Arg也可能通过NO介导此过程的发生。

GH与其受体结合后能活化贾纳斯激酶2(Janus kinase，JAK2)，进而使信号转导及转录激活因子(signal transduction and activator of transcriptions，STATs)磷酸化，与DNA结合，调节基因的表达^[28]。那么，Arg能否通过GH/JAK2/STATs途径上调Myf5、MyoD和MyoG等基因的表达，促进鱼类肌细胞的增殖分化还有待进一步研究。

2.2.2 IGFs

GH对生长的促进作用可通过IGFs来实现。IGFs可通过自分泌和旁分泌途径作用细胞^[26]，对细胞的增殖分化有重要作用。IGFs包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ 2种亚型，二者均能促进金头鲷肌细胞的增殖分化，但IGF-Ⅱ对增殖的作用强于IGF-Ⅰ^[24]，而IGF-Ⅰ对分化的作用强于IGF-Ⅱ^[29]。目前在鱼类上，Arg对IGFs作用的研究主要集中在IGF-Ⅰ。Tu等^[8]和Chen等^[3]研究表明，饲料中添加L-Arg可显著增加异育银鲫和大口黑鲈血清IGF-Ⅰ和肝脏IGF-ⅠmRNA的表达。但是，Pohlenz等^[23]报道Arg对斑点叉尾 血清IGF-Ⅰ水平无显著影响，肝脏IGF-ⅠmRNA的表达量随饲料L-Arg水平的增加而显著下降。上述结果说明Arg对不同鱼类的IGFs作用不尽相同。Jiménez-Amilburu等^[29]用重组人IGF-Ⅱ处理金头鲷肌肉细胞后发现能显著上调MyoD2 mRNA的表达，说明IGF-Ⅱ可能通过上调MyoD2的表达促进金头鲷肌细胞的增殖；同时用100 nmol/L重组人IGF-Ⅰ处理金头鲷肌细胞，其MyoG mRNA的表达量可提高2～3倍^[29]，说明IGFs可通过调节MyoD2和MyoG的表达来促进金头鲷肌细胞的增殖分化。因此，Arg可能通过上调IGFs的合成和分泌来提高相关生肌调节因子的表达，进而促进鱼类肌细胞的分化。此外，Arg在代谢过程中能产生肌酸。Louis等^[17]报道5 mmol/L肌酸能使C₂C₁₂细胞IGF-Ⅰ mRNA的表达量提高133%。因此，Arg可能通过肌酸来上调IGF-Ⅰ的转录，增强肌细胞的增殖分化能力，同时也暗示肌酸对C₂C₁₂细胞增殖分化的促进作用可能通过IGF-Ⅰ实现。目前在鱼上未见相关的研究报道。

值得注意的是，Sotiropoulos等^[30]认为，GH促进小鼠肌细胞融合的过程中可能并不依赖于IGF-Ⅰ，即GH能直接作用于肌细胞的融合。Bower等^[31]发现氨基酸能单独刺激IGFs基因的表达量增加，说明IGFs对肌细胞的作用不一定需要GH参与，Arg可能直接作用于鱼类肌细胞，促进IGFs合成。但这一猜想有待验证。

2.2.3 INS

INS是一种肽类激素，与IGF-Ⅰ有着相似的肽结构，都属于胰岛素超家族^[32]。Erwin等^[15]研究表明，1 μmol/L胰岛素能使L6肌管中的细胞核数量提高2倍，说明胰岛素能刺激L6肌细胞的融合分化。Arg能显著提高虹鳟^[4](腹腔注射)和条斑星鲽^[33](肌肉注射)血清胰岛素水平。因此，Arg可能通过提高鱼体胰岛素水平来促进肌细胞分化。多胺参与调节肌细胞的增殖分化，研究发现胰岛素能提高L6成肌细胞中多胺的水平^[15]，说明Arg可能通过提高胰岛素的分泌诱导多胺生成，进而促进肌细胞的增殖分化。目前Arg促进鱼类胰岛素释放的机制尚不明。布氏体(brockmann body，BB)是一些硬骨鱼类胰岛组成部分，包含胰岛A、B和D细胞^{[4, 34]}。有研究者通过体外研究推测Arg可以直接作用BB^{[4, 34]}，使胰岛素分泌增加。因此，Arg可能通过调节鱼类体内胰岛素水平促进肌细胞分化，具体作用机制有待研究。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mamalian target of rapamycin，mTOR)能调节蛋白质的转录翻译，是调节细胞生长和细胞周期重要枢纽，是骨骼肌的重要功能因子^[35]。IGF-Ⅰ和INS可通过鱼类肌细胞内磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号联级活化mTOR^[36]。Ham等^[12]发现雷帕霉素(mTOR抑制剂)能显著抑制肌管直径的增加，阻遏Arg对C₂C₁₂肌管的作用。这说明mTOR的活化是Arg促进肌细胞融合分化所需的必要环节。Arg能上调异育银鲫^[8]和建鲤^[37]肌肉中mTOR mRNA的表达。因此，Arg可能通过直接活化mTOR^[38]或间接通过调节体内生长因子(IGFs、INS等)水平经PI3K/Akt信号通路活化mTOR^[36]，促进鱼类肌细胞的分化。吴海青等^[35]认为，mTOR可能通过降低STAT1的核转运，减少STAT1与MyoD1结合的机会，进而促进MyoD调控MyoG的表达，促进山羊骨骼肌卫星细胞的分化。Arg是否能通过活化鱼类肌细胞mTOR，并以类似途径调节肌细胞的增殖分化，还有待研究。

2.3 Arg可能通过调节肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)影响鱼类肌细胞增殖分化

MSTN，也被称为生长分化因子-8，是转化生长因子超家族成员。MSTN是哺乳动物骨骼肌发育和生长的一个负调节蛋白，主要在骨骼肌中表达，能抑制成肌细胞的增殖分化^[39]。但目前在鱼类上的研究发现，50 nmol/L重组小鼠MSTN能抑制虹鳟肌细胞数量的增加，同时上调虹鳟肌细胞MyoG mRNA的表达和肌球蛋白重链水平^[40]。这说明重组小鼠MSTN对虹鳟肌细胞的作用可能是抑制增殖而促进分化^[40]。但100 nmol/L重组人MSTN对虹鳟肌细胞分化的影响不显著。上述结果说明不同种类不同剂量的MSTN对虹鳟肌细胞产生的作用存在差异，MSTN对虹鳟肌细胞分化的作用还存在争议。还值得注意的是，在鱼类上不同MSTN亚型可能具有不同的生理作用^[40]。在禽类上，用0.01 mmol/L L-Arg处理鸡胸肌细胞，噻唑蓝(MTT)值显著降低，MSTN mRNA表达量显著提高^[11]，表明Arg可能通过提高MSTN基因的转录，抑制鸡胸肌细胞增殖活性。但目前还缺乏Arg通过调节MSTN来影响鱼类肌细胞增殖分化的相关研究。

3 小 结

综上所述，Arg及其代谢产物NO、多胺和肌酸对哺乳动物肌细胞的增殖分化有促进作用，但能否介导鱼类肌细胞的增殖分化需进一步研究。Arg能否直接或间接活化p38 MAPK、mTOR信号途径，通过调节生肌调节因子的转录翻译以及特殊肌肉蛋白质的合成，进而影响鱼类肌细胞的增殖分化需进一步研究。Arg能否通过调节MSTN影响鱼类肌细胞的增殖分化及其作用途径有待深入研究。