2. 中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所, 儋州 571737
2. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China
粗饲料是家畜生产的基本生产资料，粗饲料的品质对动物生长发育起着决定性的作用，利用牧草间的组合效应进行科学搭配，不仅可以提高牧草饲料的利用率、降低饲养成本，还能通过组合间的增益效应来提高家畜生产性能。柱花草是我国热带、亚热带地区重要的放牧和刈割兼用型豆科牧草[1]，具有营养价值丰富、适口性好等特点，自1962年首次由国外引进后，在我国南方地区得到广泛种植，目前已审定品种12个[2]，其中热研2号柱花草(S. guianensis Sw. Reyan No. 2)是1991年由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所热带牧草研究中心选育出来的优良品种，也是现今我国南方地区种植面积最广、应用最为广泛的品种，而热研20号柱花草(S. guianensis Sw. Reyan No. 20)和热研21号柱花草(S. guianensis Sw. Reyan No. 21)是2011年选育的抗炭疽病新品种[3-4]。热研4号王草(Pennisetum purpureum×P.americanum cv. Reyan No. 4)是一种优质的热带刈割型禾本科牧草，具有产量高、抗逆性强、适口性好等特点，在我国南方各省已有大面积种植[5-6]。豆科牧草与禾本科牧草组合饲喂家畜一直以来都是畜牧生产实践中常用到的组合方式，也是当前畜牧方面研究的热点问题。由于柱花草属于优质豆科牧草且产量低于禾本科牧草，市场价格也往往较高，并且考虑到过量的饲喂豆科牧草容易引起反刍动物瘤胃臌胀病，本试验中柱花草的添加量最高为50%。于腾飞等[7]利用体外瘤胃发酵法研究花生蔓与4种粗饲料间组合效应，结果表明花生蔓与青贮玉米秸、干玉米秸和羊草均以20 ∶ 80组合效果最好。柱花草和王草作为我国南方地区常见的优质牧草，也常被农户混合饲喂，但其混合比例并未得到科学的指导。本试验将热研2号、20号和21号柱花草与热研4号王草分别以0 ∶ 100、10 ∶ 90、20 ∶ 80、40 ∶ 60、50 ∶ 50、100 ∶ 0组合，利用体外产气技术，分析不同比例的组合对产气量、产气参数、体外干物质消化率(IVDMD)、氨态氮(NH3-N)和微生物蛋白(MCP)含量的影响，计算各组合的单项组合效应值和综合组合效应值，进而筛选出各品种柱花草与王草的最佳比例。
1 材料与方法 1.1 试验材料供试植物为热研2号、20号、21号柱花草与热研4号王草(均为营养期)，于2015年8月24日采集于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部热带牧草种质圃。采集的植物样本通过110 ℃杀青30 min后用65 ℃烘48 h，粉碎过40目筛制成样品备测。瘤胃液取自3头年龄和体重相近的成年海南黑山羊。
1.2 试验设计热研2号、20号、21号柱花草干草粉分别与热研4号王草干草粉以0 ∶ 100、10 ∶ 90、20 ∶ 80、40 ∶ 60、50 ∶ 50、100 ∶ 0组合进行体外产气试验，每种组合3个重复。
1.3 体外产气试验体外产气技术采用Zhao等[8]的培养液的配制方法和试验方法。
缓冲液Ⅰ：23.5 g Na2HPO4·12H2O、12.5 g NaHCO3和11.5 g NH4HCO3溶于400 mL蒸馏水中；缓冲液Ⅱ：23.5 g NaCl、28.5 g KCl、6.0 g MgCl2·6H2O、2.63 g CaCl2·2H2O溶于1 000 mL蒸馏水中；混合培养液：取400 mL缓冲液Ⅰ和50 mL缓冲液Ⅱ混合，然后加入蒸馏水，使这种混合的缓冲液终体积达到500 mL。缓冲液Ⅰ和混合培养液现用现配。
选择3头年龄和体重相近的成年海南黑山羊，安装永久性瘤胃瘘管，在晨饲(09:00)前抽取瘤胃液，经4层纱布过滤，量取312.5 mL过滤后的瘤胃液于预先加入了1 000 mL蒸馏水并在38 ℃水浴中预热的真空容器中，然后加入250 mL预先配制好并在38 ℃水浴中预热的混合培养液，并持续通入CO2约10 min。称取按不同比例混合好的草粉干样0.2 g，倒入提前称好质量的尼龙袋(3 cm×5 cm)中，绑紧后放入注射器前端。取30 mL瘤胃液-缓冲液的混合液加到每一个注射器中，排净空气，使其保持真空状态，并封闭注射器口，记录活塞的位置，并在38 ℃的水浴摇床中培养。本试验设计在发酵开始后2、4、6、8、10、12、24、30、36、48、72 h读取这11个时间点的产气量，产气量为相应时间点的活塞的位置读数减去其初始位置读数和空白产气量(空白注射器中加入30 mL瘤胃液-缓冲液和1个空的尼龙袋，与试验注射器同时培养读数)。
1.4 测定指标与方法测定不同比例混合好的草粉干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、有机物(OM)含量，参照张丽英[9]的方法。体外产气试验末期(72 h)测定人工瘤胃液NH3-N及MCP含量，NH3-N含量测定采用凯氏定氮法[10]，MCP含量测定采用三氯醋酸(TCA)沉淀蛋白质法[11-12]。
1.5 相关计算公式 1.5.1 IVDMDIVDMD(%)=[(样本质量-残渣质量)/样本质量]×100。
1.5.2 体外发酵参数将各样品不同时间点的产气量代入由rskov等[13]提出的以下模型：
GP=a+b(1-e-ct)。
式中：GP为t时间点的产气量(mL)；a为饲料快速发酵部分产气量(mL)；b为慢速发酵部分产气量(mL)；c为b的速率常数(mL/h)；a+b为潜在产气量(mL)。
根据非线性最小二乘法原理，求出a、b、c。
1.5.3 组合效应值单项组合效应(single-factor associative effects,SFAE)值的计算采用以下公式：
单项组合效应值=(实测值-加权估算值)/加权估算值。
综合组合效应(synthetically associative effects,AEs)值的计算采用以下公式：
综合组合效应值(%)={[(GP实测值/GP加权估算值)×SUBGP/(SUBGP+SUBWCP)+
(MCP实测值/MCP加权估算值)×SUBMCP/
(SUBGP+SUBMCP)]-1×100}[7]。
式中：实测值为样品某一指标实测值；加权估算值=A饲料某一指标实测值×A饲料配比(%)＋B饲料某一指标实测值×B饲料配比(%)；SUBGP为用于生成气体所需的饲料底物样品质量(mg)，SUBGP=2.27(mg/mL)×产气量(mL)，2.27为每生成1 mL气体平均所需的饲料底物样品数量[14]；SUBMCP为用于生成MCP所需的饲料底物样品质量(mg)，SUBMCP=MCP(mg)/0.625，其中0.625为MCP干物质中蛋白质的含量[15]。
1.6 数据统计与分析采用Excel 2003对数据进行整理，并采用SAS 9.3软件包进行统计分析，用平均值±标准误表示测定结果，用Duncan氏法对各测定数据进行多重比较。
2 结果与分析 2.1 不同比例柱花草与王草组合的体外产气特性3个品种柱花草与王草按不同比例组合对体外产气特性的影响见表 1。不同品种柱花草与王草的不同比例组合间产气量、慢速发酵部分产气量、潜在产气量和慢速发酵部分产气量的速率常数之间差异均不显著(P＞0.05)，其中产气量与潜在产气量的变化规律基本一致；热研2号和20号柱花草与王草不同比例组合的快速发酵部分产气量差异达到显著水平(P＜0.05)，快速发酵部分产气量达到最大的组合比例分别为30 ∶ 70和50 ∶ 50，热研21号柱花草 ∶ 王草为10 ∶ 90时快速发酵部分产气量达到最大，但各比例间差异未达显著水平(P＞0.05)。
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表 1 不同比例柱花草与王草组合的体外产气特性 Table 1 In vitro gas production situations of combinations of stylosanthes with king grass at different proportions |
柱花草与王草组合的IVDMD均高于仅有王草，其中热研2号柱花草 ∶ 王草、热研21号柱花草 ∶ 王草分别为50 ∶ 50、40 ∶ 60时的IVDMD最高，与仅有王草做底物时差异显著(P＜0.05)，热研21号柱花草与王草各比例组合间IVDMD差异不显著(P＞0.05)。热研2号柱花草 ∶ 王草、热研20号柱花草:王草为30 ∶ 70时MCP含量最高，热研2号柱花草 ∶ 王草为30 ∶ 70时显著高于50 ∶ 50时(P＜0.05)，热研20号柱花草 ∶ 王草为30 ∶ 70显著高于0 ∶ 100、10 ∶ 90、20 ∶ 80、40 ∶ 60、100 ∶ 0时(P＜0.05)； 热研21号柱花草 ∶ 王草为50 ∶ 50时MCP含量最高，但与其他比例间差异不显著(P＞0.05)。NH3-N含量随着柱花草比例的递增出现先增高后降低的趋势，各品种柱花草与王草组合均以30 ∶ 70时最高。
2.2 不同比例柱花草与王草的组合效应值不同比例柱花草与王草的组合效应值见表 2。从单项组合相应指数来看，柱花草与王草不同比例的组合大部分为正组合效应，其中热研2号柱花草 ∶ 王草和热研20号柱花草 ∶ 王草为30 ∶ 70时MCP的组合效应值最高，热研2号柱花草 ∶ 王草为30 ∶ 70时显著高于50 ∶ 50时(P＜0.05)，热研20号 柱花草 ∶ 王草为30 ∶ 70时显著高于10 ∶ 90、20 ∶ 80、 40 ∶ 60时(P＜0.05)。从综合组合相应指数来看，3个品种柱花草与王草的综合组合效应值呈现了较为统一的规律性，都是随着柱花草比例的增大而呈现单峰型增长趋势，其中热研2号柱花草 ∶ 王草和热研20号柱花草 ∶ 王草为30 ∶ 70时综合组合效应值最高，分别为1.44和1.55，热研21号柱花草 ∶ 王草为20 ∶ 80时综合组合效应值达到最高，为1.37。
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表 2 不同比例柱花草与王草的组合效应值 Table 2 Associative effects index of combinations of stylosanthes with king grass at different proportions |
体外发酵产气量的多少取决于牧草中可发酵有机物的含量和反刍动物瘤胃微生物对有机物的分解能力[16]，牧草中营养成分的组成和质量决定了可发酵有机物的含量，而瘤胃微生物活力取决于瘤胃能氮平衡的程度。本试验中3个品种柱花草与王草各组合产气量最大的比例分别为40 ∶ 60、50 ∶ 50和20 ∶ 80，与潜在产气量的变化趋势基本对应，其中热研20号柱花草 ∶ 王草为50 ∶ 50时产气量和潜在产气量均高于另外2个品种；热研2号柱花草:王草、热研20号柱花草 ∶ 王草、热研21号柱花草 ∶ 王草快速发酵部分产气量最大的比例分别为30 ∶ 70、50 ∶ 50和10 ∶ 90，慢速发酵部分产气量则均为100 ∶ 0时最高，王草作为禾本科牧草，其碳水化合物含量通常高于豆科牧草，而产气量主要来源于植物中碳水化合物的发酵[17]，当加入柱花草后，潜在产气量的升高说明在王草基础饲粮中添加柱花草能提高山羊瘤胃微生物发酵性能。饲粮中可发酵碳水化合物和氮源的供应，即能氮平衡的程度，决定了饲料在瘤胃中的消化率[18]，本试验中添加柱花草的组合IVDMD均高于仅有王草，说明添加柱花草后补充了氮源，促进了山羊瘤胃中的能氮平衡，因而提高了山羊瘤胃的消化率。
山羊瘤胃微生物的数量和种类与消化率、生长发育息息相关，因为瘤胃作为反刍动物所特有的消化器官，其作用主要是对牧草中淀粉、纤维等有机物进行消化，尤其是对一些难降解的纤维物质，瘤胃微生物能够把粗纤维分解成碳水化合物和低级脂肪酸，将植物性蛋白质及NH3-N转化成MCP，将淀粉转化成糖等供山羊消化吸收。MCP能提供反刍动物蛋白质需要的40%～80%，是最主要的氮源供应者[19]。MCP含量的多少反映了培养体系中微生物种群的数量、活力及其利用NH3-N的能力[20]。本试验中，热研2号柱花草 ∶ 王草、热研20号柱花草 ∶ 王草、热研21号柱花草:王草MCP含量最高的比例分别为30 ∶ 70、30 ∶ 70和50 ∶ 50，说明在这些比例的组合下微生物的数量、活力达到最佳状态。
瘤胃液中NH3-N是蛋白质降解和MCP合成的中间产物，因此瘤胃液中NH3-N含量是衡量瘤胃微生物氮代谢的一个重要指标，而瘤胃液中NH3-N含量过高或过低都不利于微生物的生长繁殖[21]。研究表明，瘤胃液适宜NH3-N含量为3.3~8.0 mg/dL[22]，实际上NH3-N含量在1~76 mg/dL变化[23]，本试验中NH3-N含量为42.64~71.44 mg/dL，属于正常变化范围，但高于适宜范围，原因可能在于培养时间的不同，试验测定样液均是72 h最终发酵后的瘤胃液，由于体外产气发酵装置的局限性，容器内容物不能外移，造成发酵终产物积累使得瘤胃微生物的生存环境发生改变导致大量微生物死亡，细菌溶菌、纤毛虫自溶等释放出氨。
3.2 不同比例柱花草与王草的组合效应值柱花草作为豆科牧草，其在蛋白质含量上的优势大于禾本科牧草，而王草属于山羊常用禾本科粗饲料，具有高产和高能量等特性，本试验将两者进行一定比例的组合，不但表现了各自的优势还得到了相应的增益效果，促进了饲料间的能氮平衡，使之产生正组合效应。单项组合效应值显示，产气量只有热研2号柱花草 ∶ 王草为20 ∶ 80、50 ∶ 50和热研20号柱花草 ∶ 王草为20 ∶ 80时产生负组合效应，IVDMD只有热研20号柱花草 ∶ 王草为50 ∶ 50时为负组合效应，MCP为热研2号柱花草 ∶ 王草为50 ∶ 50和热研20号柱花草 ∶ 王草为10 ∶ 90时产生负组合效应，综合组合效应值均为正组合效应。单项组合效应无法全面反映饲料利用情况，因而计算其综合组合效应值。苏海涯[24]研究表明，综合组合效应值计算方法综合考虑了产气量与MCP含量的影响，用来评定桑叶与3种饼粕间的组合效应在变化趋势上更有规律性也更为合理。根据综合组合效应结果，热研2号、20号和21号柱花草与王草的最佳组合比例分别为30 ∶ 70、30 ∶ 70、20 ∶ 80。刘庭玉[25]通过体外法研究牧草的组合效应，发现豆科牧草与禾本科牧草之间的组合存在着明显的正组合效应，其中苜蓿:黑麦草为60 ∶ 40、苜蓿 ∶ 沙打旺 ∶ 狼尾草为40 ∶ 40 ∶ 20这2个配方显著改善了育肥羔羊生产性能和屠宰性能。孙国强等[26]利用体外瘤胃发酵法研究全株玉米青贮与花生蔓间的组合效应，发现当花生蔓添加量低于50%时，其24 h产气量和IVDMD均为正组合效应，最终得出全株玉米青贮与花生蔓以70 ∶ 30的比例组合最佳，与本试验结果相近。
4 结 论① 在王草中添加适宜比例的柱花草能够提高体外发酵的产气量、IVDMD和MCP含量，提高瘤胃微生物活力，产生正组合效应。
② 热研2号、20号柱花草与王草均以30 ∶ 70组合效果最佳，热研21号柱花草与王草以20 ∶ 80组合效果最佳。
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