王不留行黄酮苷(vaccarin, VAC)和葛根异黄酮(puerain, PUE)作为安全、天然的饲料添加剂，具有多种生物学功能，如促进雌激素(estrogen, E)分泌、促进乳蛋白(milk protein，MP)合成、促进细胞增殖和抗氧化功能。王不留行的有效成分王不留行黄酮苷能够刺激乳腺细胞增殖和MP的合成[1]。在哺乳母猪饲粮中添加含王不留行的添加剂，母猪泌乳力显著增加，仔猪20日龄窝重显著提高[2-3]。目前王不留行的应用虽多，但对其有效成分王不留行黄酮苷在母猪生产上的研究较少。 补饲葛根提取物有提高奶牛日均产奶量的趋势[4]，葛根中的异黄酮类物质有雌激素样作用[5]，其中的有效成分葛根素对小鼠乳腺导管有促进作用，给小鼠注射葛根素，小鼠血清中生长激素(growth hormone, GH)含量提高，生长激素与催乳素(prolactin, PRL)有协同作用，促使泌乳增多[6]。葛根异黄酮能使泌乳增加，但在母猪生产上还没有相关的研究，本试验通过研究王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对哺乳母猪泌乳性能及血清激素和抗氧化指标的影响，看其是否有增乳效果及两者合用是否可行，为寻求安全可靠的饲料添加剂提供理论依据，进而使养猪业持续健康发展。
1 材料与方法 1.1 试验材料王不留行黄酮苷(纯度为10%，批号为HY20150503) 和葛根异黄酮(纯度为40%，批号为HY20150418) 均购自陕西浩洋生物科技有限公司。
1.2 试验设计与饲养管理选择胎次和预产期相近的经产长白母猪24头，随机分为4个组，每组6头。试验采用2×2双因子随机设计，选取2个水平的王不留行黄酮苷(0、2 g/kg)以及2个水平的葛根异黄酮(0、2.5 g/kg)添加于哺乳母猪饲粮中。试验设计如表 1所示。试验期为产前7 d至21 d断奶，预试期7 d，正试期21 d。
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表 1 试验设计 Table 1 Experiment design |
试验在黑龙江省大东北种猪场进行。试验期间，每天按时清理试验猪舍，保证猪舍环境清洁。预产前1周将母猪从妊娠舍转到分娩舍饲养，试验全期的饲养管理由同一饲养员负责。从预试期开始限饲，直到分娩，每头母猪每天喂料3 kg，饲喂3次，自由饮水。产前第4天开始每天减料0.5 kg，分娩当天停料。分娩后第1天饲喂2 kg，随后每天增加0.5 kg，4 d后自由采食，每天饲喂3次。小猪出生7 d后肌内注射右旋糖酐铁，其免疫程序按照场内要求进行，并于21日龄断奶。
1.3 试验饲粮试验基础饲粮为按照NRC(1998) 猪饲养标准配制的玉米-豆粕型饲粮，基础饲粮组成及营养水平如表 2所示。
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表 2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验母猪分娩时在其前、中、后乳腺用手挤奶共采初乳30 mL，哺乳第10天早上饲喂母猪后，耳缘静脉注射缩宫素4 mL。在每头母猪前、中、后乳腺共采常乳30 mL，采常乳前45 min将仔猪隔离。采乳后取初乳、常乳各5 mL分别放于10 mL离心管中，4 ℃下用离心机3 500 r/min离心20 min弃去脂肪，将脱脂乳于-20 ℃下保存在冰箱中，用于乳中相关激素的测定。剩余乳样于4 ℃冰箱保存，用于测定乳脂肪(milk fat，MF)、乳糖(lactose，LA)和MP含量。
1.4.2 血样的采集在母猪分娩当天，哺乳第10、21天早晨饲喂前耳缘静脉采血10 mL于采血管内，置于室温下倾斜静置凝固后，4 ℃下3 000 r/min离心20 min，将上清液转移到Ep管中，-20 ℃冰箱冷冻保存，用于测定血清激素和抗氧化指标。
1.5 指标测定及方法 1.5.1 生产性能指标自分娩日开始详细记录每头试验母猪的日采食量用于计算哺乳期的平均日采食量(average daily feed intake, ADFI)。分娩后12 h内以及试验第7、14、21日龄的清晨空腹称重并记录每窝仔猪头数，用于计算哺乳仔猪饲养全期及不同段的平均日增重(average daily gain, ADG)和平均窝重(average litter weight, ALW)。根据Lawlor等[7]的方法，母猪泌乳量与仔猪增重的效率为4 : 1作合理调整间接计算每头母猪泌乳期21 d的总泌乳量(total lactation, TL)：
总泌乳量(kg)=仔猪个体ADG×窝仔数×泌乳天数×4。
1.5.2 乳成分指标乳中的常规成分(MF、LA和MP)采用FOSS乳品成分快速分析仪(MilkoScan FT120型，阿尔巴尼亚)测定。乳中激素胰岛素样生长因子I(insulin-like growth factor I, IGF-Ⅰ)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法测定，测定过程均遵照试剂盒说明书操作，试剂盒为猪IGF-Ⅰ ELISA试剂盒(HL50114) ，购自上海哈灵生物科技有限公司。
1.5.3 血清激素指标母猪血清中催乳素、雌激素、生长激素的含量采用ELISA的方法测定，测定过程遵照试剂盒说明书操作，试剂盒购自上海哈灵生物科技有限公司，分别为猪催乳素ELISA试剂盒(HL50440) 、猪雌激素ELISA试剂盒(HL50108) 、猪生长激素ELISA试剂盒(HL50121) 。
1.5.4 血清抗氧化指标血清中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)活性采用ELISA的方法测定，测定过程遵照试剂盒说明书操作，试剂盒购自上海哈灵生物科技有限公司，分别是猪MDA ELISA试剂盒(HL50263) 、猪GSH-Px ELISA试剂盒(HL50445) 、猪T-SOD ELISA试剂盒(HL50442) 。
1.6 数据统计与分析本试验所得数据以采用SPSS 19.0统计软件一般线性模型(GLM)程序对试验数据进行双因素分析，并用Duncan氏多重比较法进行比较分析。主效应分别用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行差异显著性分析，试验结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对乳猪生产性能和哺乳母猪泌乳性能的影响如表 3所示，各组之间哺乳第1周、第3周及哺乳全期乳猪ADG和第7天ALW差异不显著(P>0.05) ；哺乳第2周，与对照组相比，各添加组ADG均有升高的趋势，混合组升高最多且与对照组差异显著(P＜0.05) 。各添加组母猪ADFI均高于对照组，混合组与对照组差异显著(P＜0.05) ，对照组、王不留行黄酮苷组、葛根异黄酮组之间差异不显著(P>0.05) 。
主效应分析发现，饲粮添加葛根异黄酮显著提高了乳猪第2周的ADG，第14、21天的ALW及母猪ADFI、TL(P＜0.05) ，饲粮添加王不留行黄酮苷及二者互作对乳猪ADG、ALW及母猪的ADFI、TL影响均不显著(P>0.05) 。
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表 3 王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对乳猪生产性能和哺乳母猪泌乳性能的影响 Table 3 Effects of VAC and PUE on performance of suckling piglets and lactation performance of lactating sows |
如表 4所示，饲粮添加葛根异黄酮和王不留行黄酮苷对各组的初乳和常乳中MF、LA、MP含量无显著影响(P>0.05) 。各添加组初乳中MF含量均高于对照组，混合组最高且与对照组差异显著(P＜0.05) 。各添加组初乳和常乳中IGF-Ⅰ含量均显著高于对照组(P＜0.05) ，各添加组间常乳中IGF-Ⅰ含量差异显著(P＜0.05) 。
主效应分析表明，添加葛根异黄酮、王不留行黄酮苷均显著提高初乳中IGF-Ⅰ含量(P＜0.05) ，二者互作对各指标的影响不显著(P>0.05) 。
2.3 王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对哺乳母猪血清激素指标的影响如表 5所示，哺乳第1、10天各组间血清中雌激素含量差异均不显著(P>0.05) ；第21天，各添加组血清中雌激素含量均高于对照组，混合组与对照组差异显著(P＜0.05) 。哺乳第1、21天，各添加组血清中生长激素含量均高于对照组，且葛根异黄酮组、混合组与对照组差异显著(P＜0.05) 。
主效应分析表明，饲粮单独添加葛根异黄酮对哺乳全期催乳素、生长激素含量均有显著影响(P＜0.05) 。饲粮单独添加王不留行黄酮苷对哺乳第1天催乳素含量有显著影响(P＜0.05) 。二者互作对哺乳全期血清中雌激素、生长激素含量影响均不显著(P>0.05) 。
2.4 王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对哺乳母猪血清抗氧化指标的影响如表 6所示，王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对哺乳母猪第1天血清中GSH-Px活性无显著影响(P>0.05) ；各添加组第10、21天血清中GSH-Px活性显著高于对照组(P＜0.05) ，混合组血清GSH-Px活性最高。第1、21天，王不留行黄酮苷组、混合组血清中MDA含量均显著低于对照组(P＜0.05) ；第10天，各添加组血清中MDA含量显著低于对照组(P＜0.05) ，且各添加组之间差异均不显著(P>0.05) 。第1、21天，葛根异黄酮组、混合组血清T-SOD活性显著高于对照组(P＜0.05) ，第10天各添加组血清T-SOD活性均高于对照组，混合组与对照组差异显著(P＜0.05) 。
主效应分析表明，饲粮添加葛根异黄酮使哺乳母猪第1、10、21天血清T-SOD和第10、21天血清GSH-Px活性显著提高(P＜0.05) 。饲粮添加王不留行黄酮苷使哺乳母猪第1、10、21天血清中MDA含量均显著降低(P＜0.05) ，第10、21天血清中GSH-Px活性显著提高(P＜0.05) 。二者互作对母猪哺乳第1天血清中T-SOD及第10、21天血清中GSH-Px活性影响显著(P＜0.05) 。
3 讨论 3.1 王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对乳猪生产性能和哺乳母猪泌乳性能的影响葛根和王不留行有促进乳腺发育、通乳和下乳的功能。张元中[8]将含有王不留行的中草药饲喂哺乳母猪，仔猪的ADG显著增加。刘英姿等[9]研究也发现，王不留行通过提高母猪泌乳使仔猪ADG增加、成活率提高。葛根异黄酮与大豆异黄酮类似，都有雌激素样作用。陈丰等[10]研究表明，饲粮中添加大豆异黄酮显著提高了分娩后第21天母猪的泌乳量，进而提高了仔猪断奶时窝重。本试验添加王不留行黄酮苷和葛根异黄酮能显著提高乳猪的ADG和母猪的泌乳量，结果与前人的一致。其原因可能有2种：一是葛根异黄酮类化合物弱的雌激素样活性能够调节体内的雌激素，直接作用于催乳素分泌细胞，促进催乳素分泌并改变其他垂体前叶激素分泌作用而促进泌乳，还可以增加细胞膜的通透性和细胞外液的积聚，增加血管和血流速度及RNA引导的细胞蛋白质的合成，进而促进乳腺的发育，提高泌乳量[11]，其具体机制有待进一步研究。二是王不留行提取物主要含有王不留行黄酮苷，Leonoudakis等[12]研究发现，王不留行黄酮苷具有促进乳腺上皮细胞增殖与分泌的功能。乳腺上皮细胞增多，乳腺发育较快，泌乳增多。
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表 4 王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对哺乳母猪乳成分的影响 Table 4 Effects of VAC and PUE on milk composition of lactating sows |
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表 5 王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对哺乳母猪血清激素指标的影响 Table 5 Effects of VAC and PUE on serum hormone indexes of lactating sows |
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表 6 王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对哺乳母猪血清抗氧化指标的影响 Table 6 Effects of VAC and PUE on serum antioxidant indexes of lactating sows |
MP、MF、LA等是评价乳品质的重要指标。李楠等[13]研究发现，王不留行能够显著增加奶牛LA、MP的分泌。TONG等[14]从王不留行中分离得到催乳活性物质，该物质使信号转导和转录活化蛋白(Stat)-5、p-Stat-5的表达提高，激活Stat-5信号传导通路，促进机体合成β-酪蛋白，还通过激活甾醇调节因子结合蛋白-Ⅰ的表达以及腺苷酸活化蛋白激酶下游靶基因乙酰辅酶A羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的表达来提高MF合成，使MP含量增加。本试验中添加王不留行黄酮苷和葛根异黄酮有提高乳中LA、MP含量的趋势，但差异不显著，与前人研究结果不同，这可能由于所用中草药中的有效成分含量或饲喂方式不同，饲喂动物有个体差异等所致。乳中激素主要来源于血液，由于乳腺有分泌功能，所以乳中激素含量的变化与血液中激素含量及乳腺的分泌有关。近年来，越来越多的试验证明，IGF-Ⅰ在乳腺发育和生成乳汁中起着重要作用[15]。IGF-Ⅰ可提高血流量，增加腺体中乳汁的前体物质，改变分泌细胞的合成能力，以及通过减缓乳腺的衰减率而增加泌乳。本试验中添加葛根异黄酮、王不留行黄酮苷及二者混合均能增加母乳中IGF-Ⅰ含量。有可能是IGF-Ⅰ介导乳腺发育，乳腺分泌IGF-Ⅰ，二者相互促进并使泌乳增加。
3.3 王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对哺乳母猪血清激素指标的影响本试验中王不留行黄酮苷和葛根异黄酮二者合用显著提高了母猪哺乳第21天血清中雌激素含量，单独添加影响不显著。雌激素能够促进催乳素的分泌，诱导泌乳的发动。一般认为，雌激素是通过促进催乳素及垂体分泌的其他激素的释放来诱导泌乳的启动。另外，雌激素和糖皮质激素一样能刺激乳腺细胞膜上催乳素受体，使其数目增加，因而在泌乳发动中雌激素与糖皮质激素、催乳素在细胞水平上有协同作用。
Kleinberg等[16]研究发现，王不留行能够提高血清中生长激素、催乳素的含量，进而促进乳腺发育，提高泌乳性能。高靖等[17]将葛根提取物添加到奶牛饲粮中，结果发现，与对照组相比，试验组雌激素、催乳素含量升高，但各组差异不显著。李德生等[18]将王不留行提取物饲喂哺乳母猪，结果表明血清中催乳素含量增加，雌激素含量减少。本试验将王不留行黄酮苷和葛根异黄酮合用，血清中雌激素、催乳素、生长激素含量显著增加，添加葛根异黄酮使催乳素、生长激素含量增加，与前人的结果不尽一致，可能是葛根异黄酮中的葛根素所具有的调节内分泌的功能，重新调节了体内各类激素之间的平衡关系。也可能由于葛根异黄酮和王不留行黄酮苷二者的交互作用，各添加组血清中催乳素、生长激素含量的升高也正好证明了饲喂王不留行黄酮苷、葛根异黄酮可以提高母猪的泌乳量。
3.4 王不留行黄酮苷和葛根异黄酮对哺乳母猪血清抗氧化指标的影响在分娩和泌乳的过程中，动物的生理状态与营养代谢会发生急剧的变化，内分泌系统、脂肪与蛋白质的代谢作用明显，在这些变化过程中，动物机体消耗大量的氧气和能量，并产生许多自由基[19-22]，使脂质发生过氧化作用，产生MDA、氢过氧基等，使细胞膜蛋白质构象破坏，膜蛋白功能受损。然而细胞内有多种自由基清除系统，如GSH直接清除活性氧自由基，并能够对自由基造成的损伤进行修复，从而对细胞起到保护作用。超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px作为机体细胞内清除自由基的主要内源抗氧化物酶[23-25]，在抗氧化防御系统中起重要作用，使机体一直处于动态平衡。MDA是各种氧自由基损伤机体的重要指标[26]。
研究发现，葛根异黄酮类化合物的主要成分之一葛根素能够直接清除自由基或阻断自由基形成进而减少脂质过氧化反应，减少自由基导致的红细胞膜脂质过氧化[27]。徐晓红等[28]研究发现，葛根素显著降低血清MDA含量，使衰老小鼠体内血清SOD的活性显著升高。李德生等[18]在母猪饲粮中添加王不留行，结果表明母猪血清中MDA含量降低，第21天GSH-Px活性降低。本试验中，王不留行黄酮苷和葛根异黄酮合用使血清中GSH-Px和T-SOD活性升高，血清MDA含量下降，这可能因为葛根和王不留行都含有多羟基酚类，其氢原子能与自由基结合，使其生成相应的分子和离子，抑制自由基的产生，终止自由基的连锁反应，因此能够增强机体的抗氧化能力。
4 结论综上所述，在本试验条件下添加葛根异黄酮和王不留行黄酮苷均有提高哺乳母猪泌乳性能的趋势，使血清中生长激素含量和抗氧化能力得到提高。葛根异黄酮效果优于王不留行黄酮苷，二者合用效果更佳。
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