肝脏是动物机体重要的免疫器官，也是机体进行物质和能量代谢的重要场所。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性细菌外膜特有的结构成分，能够造成机体免疫应激[1]。研究发现，动物处于免疫应激状态时，机体免疫细胞被激活并产生和释放大量炎性细胞因子，导致肝脏炎症反应，增加肝脏能量损耗，导致肝脏结构和功能的损伤[2]。
甘氨酸(glycine, Gly)是所有氨基酸中结构最简单的氨基酸，也是一种机体自身能合成的非必需氨基酸，在机体内发挥着重要的作用。作为一种功能性氨基酸，Gly能够抑制内毒素造成的肝脏损伤[3]，保护肝细胞免受三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)衰竭的影响[4]。此外，Gly作为生糖氨基酸，可以经过分解生成丙氨酸(alanine, Ala)，而Ala可进一步进入三羧酸循环，为机体提供能量[5]。Gly也是合成谷胱甘肽(glutathiose, GSH)的前体物质[5]，而还原型GSH可以参与体内三羧酸循环及糖代谢，使机体获得高能量[6]。Wang等[7]报道，饲粮中添加0.5%、1.0%和2.0%的Gly提高了哺乳仔猪抗氧化应激能力。仔猪饲粮中添加不多于2%的Gly，对其正常的生理功能和采食是安全且有益的[8]。但是，过多的Gly则会导致机体氨基酸平衡的破坏并产生毒性作用[9]。尽管Gly有很多重要的功能，但是关于Gly对仔猪肝脏能量代谢的影响还鲜有研究。因此，本试验通过给断奶仔猪注射LPS建立免疫应激模型[10]，选取1%和2% 2个浓度，研究Gly对LPS应激仔猪肝脏能量代谢障碍有无缓解作用及Gly的适宜添加量。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂Gly：有效成分>99.5%，购于武汉阿米诺科技有限公司。Ala：有效成分>99.5%，购于武汉阿米诺科技有限公司。LPS：大肠杆菌血清型O55 : B5，购于Sigma公司，以100 μg/kg BW剂量注射。
1.2 试验动物与设计选择24头体况相近的(21±1) 日龄断奶仔猪[杜×长×大，平均体重(7.17±0.41) kg]，按体重相近原则随机分配到4个组中，每组6个重复，每个重复1头猪，试验期为28 d。4个组分别为：1) 对照组(基础饲粮)；2) LPS组(LPS+基础饲粮)；3) 1.0%Gly组(LPS+基础饲粮+1.0%Gly)；4) 2.0%Gly组(LPS+基础饲粮+2.0%Gly)。用Ala对各组饲粮进行等氮处理。试验第28天，试验组仔猪腹膜注射100 μg/kg BW的LPS，对照组注射等量的生理盐水。饲养期间，猪舍温度控制在25～28 ℃。猪栏面积1.20 m×1.10 m。粉料饲喂，仔猪自由采食和饮水。
1.3 试验饲粮饲粮配制参照NRC(1998) 仔猪的营养需要，基础饲粮组成及营养水平见表 1。
1.4 肝脏样品采集仔猪腹膜注射LPS或生理盐水4 h后，静脉注射80 mg/kg BW的戊巴比妥钠麻醉，屠宰，取肝脏样品，立即投入液氮中冻存，随后转移至-80 ℃冰箱保存。
1.5 检测指标 1.5.1 肝脏相关能量指标浓度的测定肝脏中ATP、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)和一磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)浓度使用高效液相色谱法进行分析，参照Hou等[11]的方法。总腺苷酸(total adenine nucleotide, TAN)浓度和能荷(energy charges, EC)的计算参照下述公式：
TAN=ATP+ADP+AMP；EC=(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
相关基因测定包括：己糖激酶2(hexokinase2, Hexok2)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, L-PFK)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase, ICDH)、柠檬酸合成酶(citroyl synthetase, CS)、脂酰辅酶A氧化酶(acyl-coenzyme A oxidase, ACO)、肉碱酯酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1, L-CPT1)、腺甘酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)、沉默信息调节因子1(silent information regulator 1, Sirt1)以及过氧化物酶体增殖物活化受体协同刺激因子1α(proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α, PGC1α)。肝脏总RNA提取、cDNA合成、实时荧光定量PCR(real-time PCR)参照Liu等[12]的方法。real-time PCR引物序列(表 2)由宝生物工程(大连)有限公司合成。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参基因，目的基因的mRNA表达量计算采用Livak等[13]的2-ΔΔCT法。
1.6 统计分析采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析和LSD多重比较，结果用平均值±标准误来表示。以P＜0.05表示差异显著，P＜0.10表示具有显著性趋势。
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表 2 实时荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences of real-time PCR |
由表 3可知，与对照组相比，LPS刺激显著降低了肝脏ATP、ADP和TAN浓度(P＜0.05) 。与 LPS组相比，饲粮中添加1.0%Gly显著提高了肝脏ATP浓度和EC水平(P＜0.05) ，显著降低了AMP/ATP值(P＜0.05) ，并有降低AMP浓度的趋势(P＜0.10) ；饲粮中添加2.0%Gly有降低肝脏AMP/ATP值的趋势(P＜0.10) ，对其他指标无显著影响(P>0.05) 。
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表 3 肝脏腺苷酸水平(鲜重基础) Table 3 Adenylate purine levels in liver (wet weight basis) |
由表 4可知，与对照组相比，LPS刺激显著提高了肝脏糖酵解中Hexok2和PK以及三羧酸循环中ICDHβ和CS的mRNA表达量(P＜0.05) ，显著降低了肝脏L-PFK的mRNA表达量(P＜0.05) ，并有提高肝脏PDH的mRNA表达量的趋势(P＜0.10) 。与LPS组相比，饲粮中添加1.0%Gly显著降低了肝脏Hexok2和CS的mRNA表达量(P＜0.05) ；饲粮中添加2.0%Gly显著降低了肝脏Hexok2和PK的mRNA表达量(P＜0.05) ，并有降低肝脏CS的mRNA表达量的趋势(P＜0.10) 。
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表 4 肝脏糖酵解、三羧酸循环和脂肪酸β-氧化相关基因的mRNA表达 Table 4 mRNA expression of glycolysis, tricarboxylic acid cycle and fatty acids β-oxidation related genes in liver |
由表 5可知，与对照组相比，LPS刺激显著提高了肝脏AMPKα2和Sirt1的mRNA表达量(P＜ 0.05) 。与LPS组相比，饲粮中添加1.0%Gly显著提高了肝脏AMPKα1的mRNA表达量(P＜0.05) 。
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表 5 肝脏能量代谢相关调节因子的mRNA表达 Table 5 mRNA expression of energy metabolism related regulatory factors in liver |
机体内直接供能的物质是ATP。ATP水解为ADP和正磷酸或水解为AMP和焦磷酸时，能释放出大量的能量。TAN是ATP、ADP和AMP三者之和，其大小反映了线粒体生成高能磷酸化合物的能力、氧化呼吸的活性和细胞的能量储备[14]。EC水平反映了细胞内高能磷酸键在ATP、ADP和AMP之间的相互转换，可有效评估能量储备状态[15]。AMP/ATP值受ATP的调控，应激反应时，ATP产生减少或利用增加，可使细胞内AMP/ATP值升高，激活AMPK，进而激发一系列反应来恢复细胞内的能量平衡[14]。
本试验结果表明，在LPS注射4 h后，肝脏ATP、ADP和TAN浓度显著降低，表明LPS刺激抑制了肝脏线粒体能量代谢，ATP动态平衡被打破。Kang等[15]也发现了类似的结果。饲粮中添加Gly显著提高肝脏ATP浓度和EC水平，降低肝脏AMP浓度和AMP/ATP值。与我们的研究结果类似，周军利等[16]在乳鼠的研究发现，Gly处理可缓解心肌细胞ATP浓度下降，改善细胞能量状况。以上结果及分析表明，Gly可缓解LPS刺激导致的能量代谢障碍，促进能量生成。
糖酵解、三羧酸循环和脂肪酸β-氧化是机体中重要的能量代谢途径。Hexok2、PFK和PK可催化糖酵解中主要的不可逆反应，促使ATP和丙酮酸产生[17-19]。丙酮酸在PDH的作用下氧化脱羧，生成乙酰辅酶A，进而进入三羧酸循环产ATP[5]。CS是三羧酸循环第1步反应的限速酶，能决定乙酰辅酶A进入三羧酸循环的速率[20]。ICDH也是三羧酸循环中的关键酶，有3种形式，分别是ICDHα、ICDHβ和ICDHγ，其中ICDHβ和ICDHγ可以将细胞质中的代谢中间产物运往线粒体，进行三羧酸循环[21]。另外，脂肪酸β-氧化同样是机体产能的重要途径，ACO和L-CPT1是该过程中的关键酶[5]。
本试验结果显示，在LPS注射4 h后，糖酵解中Hexok2、PK、PDH以及三羧酸循环中ICDHβ和CS的mRNA表达量显著提高。与本试验结果相似，Sun等[22]研究表明，注射LPS的生长猪背最长肌中Hexok和PK的活性升高。饲粮中添加Gly显著降低了Hexok2、PK和CS的mRNA表达量。Moura等[23]研究表明，在幼鼠体内注射Gly显著抑制了脑纹状体CS的活性。这可能是因为Gly提高了ATP浓度，从而抑制了糖酵解和三羧酸循环限速酶的mRNA表达。本试验发现，Gly对脂肪酸β-氧化关键酶ACO和L-CPT1 mRNA表达量无显著影响，原因可能是在LPS刺激早期，Gly主要是通过影响肝脏糖酵解和三羧酸循环来对能量代谢进行调控，而对肝脏脂肪酸β-氧化无显著影响。
AMPK和Sirt1是细胞内的能量感受器，在能量限制的状态下可被激活，并通过磷酸化、去乙酰化作用激活PGC1α[14]。当细胞中能量储存减少时，AMP/ATP值升高，AMPK被激活，通过限制合成代谢和促进分解代谢，增加ATP的生成来维持机体稳态[14]。Sirt1与能量代谢包括糖异生和脂质累积等细胞生物学功能有着密切的关系[24]，它能够降低脂肪酸氧化相关基因mRNA的表达[25]。PGC1α是与能量代谢关系密切的转录辅助活化因子[26]，在葡萄糖和脂肪酸代谢等过程中起着重要作用[14]。本试验结果表明，LPS注射4 h后，仔猪肝脏AMPKα2和Sirt1的mRNA表达量显著提高。而饲粮中添加Gly也提高了肝脏AMPKα1的mRNA表达量，说明Gly不能缓解LPS刺激对AMPK相关信号的影响。这可能是因为Gly不是通过影响AMPK、Sirt1和PGC1α来影响肝脏能量代谢的。
4 结论① 饲粮中添加Gly能够通过调节糖酵解和三羧酸循环代谢途径中Hexok2、PK和CS等相关酶的表达，改善LPS刺激导致的断奶仔猪肝脏能量代谢紊乱。
② 饲粮中添加Gly对脂肪酸β-氧化无显著影响。
③ Gly不是通过影响AMPK、Sirt1和PGC1α来影响肝脏能量代谢的。
④ 考虑到不同水平Gly对仔猪肝脏能量水平的影响以及经济因素，建议采用1%Gly添加量。
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