2. 内蒙古自治区农牧业科学院, 呼和浩特 010031
2. Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010031, China
乳蛋白是评价牛奶质量的重要指标之一。乳成分前体物的组成与含量直接影响乳腺内乳蛋白的合成，进而影响乳品质。蛋氨酸(Met)作为乳蛋白前体物，是乳蛋白合成的主要必需氨基酸，是奶牛第一限制性氨基酸[1]，是乳蛋白合成翻译开始的第1个氨基酸，也是机体中最重要的甲基直接供体，蛋白质翻译过程被激活的必需要素就是5′端帽子结构连接核苷酸的核糖需要被甲基化[2]。因此，从Met的角度研究对乳蛋白合成的影响及机理，对调控乳腺内乳成分的合成和改善乳品质具有重要意义。Wang等[3]研究发现，向奶牛饲粮中添加蛋氨酸羟基类似物能够显著提高奶牛的乳产量、乳蛋白含量。然而，用于乳蛋白合成的氨基酸并非全部由血液中的游离氨基酸来供给，乳腺组织还可以摄取小肽和蛋白质等非游离态氨基酸以满足乳蛋白合成的需要[4]。小肽能够弥补乳腺组织对氨基酸摄取的不足，而且能在乳腺蛋白质代谢过程中发挥作用。毕微微[5]的研究发现，蛋氨酸-蛋氨酸(P-Met-Met)和蛋氨酸-赖氨酸(P-Met-Lys)二肽能促进奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖以及β-酪蛋白(CSN2)基因的表达。以BMECs为模型，用P-Met-Met和P-Met-Lys等量替代与它们对应的游离氨基酸，二肽组的αs1-酪蛋白(CSN1S1)基因表达与培养液中酪蛋白浓度均显著高于游离氨基酸组[6]。这些研究结果均表明，氨基酸及小肽都在一定程度上影响了奶牛乳蛋白的合成。因此，研究二肽等量替代游离氨基酸对乳蛋白合成的影响，对深入了解乳蛋白前体物对奶牛乳蛋白合成的影响机理及不断提高牛奶品质具有一定理论与实际意义。然而，目前相关的研究较少。鉴于此，本试验以BMECs为体外培养模型，研究不同种类的含Met二肽对乳蛋白合成相关基因和氨肽酶氮(APN)基因表达以及细胞内外氨肽酶(APA)含量的影响，筛选出促进效果明显的二肽组合，为建立适用于奶牛泌乳所需要的二肽营养模式提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器胶原酶Ⅱ、DMEM/F12培养基、胰岛素转铁蛋白溶液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)和双抗均购自Gibco公司；氢化可的松、表皮生长因子、催乳素、Met、赖氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)均购自Sigma公司；P-Met-Met、P-Met-Lys、蛋氨酸-色氨酸(P-Met-Trp)、蛋氨酸-苯丙氨酸(P-Met-Phe)、蛋氨酸-苏氨酸(P-Met-Thr)、蛋氨酸-异亮氨酸(P-Met-Ile)、蛋氨酸-亮氨酸(P-Met-Leu)、蛋氨酸-缬氨酸(P-Met-Val)8种二肽均购自上海科肽生物公司(产品编号分别为PO14103105、PO14103106、PO14103107、PO14103108、PO14103109、PO14103110、PO14103111、PO14103112) ；噻唑蓝(MTT)、二甲亚基砜(DMSO)和两性霉素均购自Amresco公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购自HyClone公司；SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ、PrimeScript RT Master Mix购自TaKaRa公司；RNAprep pure Cell/Bacteria Kit购自TIANGEN公司。
主要仪器有：倒置显微镜(Olympuse公司)；全自动酶标仪(Synergy H4，BioTek公司)；细胞计数仪(Cytorecon，ECI公司)；二氧化碳恒温培养(HF-240，力康生物医疗科技控股有限公司)；荧光定量PCR仪(ABI-7500，ABI公司)；电泳仪(Bio-Rad公司)。
1.2 试验设计本试验分为3部分，均采用单因子完全随机试验设计，试验中使用的DMEM/F12培养基中Met的含量为17.24 μg/mL，Met的添加浓度及培养时间参考本课题组前期研究结果分别定为60 μg/mL(0.402 mmol/L)、48 h。第1部分，研究8种含Met二肽(P-Met-Met、P-Met-Lys、P-Met-Trp、P-Met-Phe、P-Met-Thr、P-Met-Ile、P--Met-Leu、P-Met-Val)对BMECs内乳蛋白合成相关基因表达的影响，分为对照组(不添加二肽)和8个分别添加8种含Met二肽的试验组，使每种二肽的浓度均为0.402 mmol/L。第2部分，研究与8种二肽相对应的游离氨基酸(F-Met-Met、F-Met-Lys、F-Met-Trp、F-Met-Phe、F-Met-Thr、F-Met-Ile、F-Met-Leu、F-Met-Val)对BMECs内乳蛋白合成相关基因表达的影响，分为对照组(不添加游离氨基酸)和8个分别添加8种游离氨基酸混合溶液试验组。游离氨基酸混合溶液中每种氨基酸的浓度与第1部分相应的二肽组中的氨基酸浓度一致。第3部分，研究用含Met的二肽等物质的量替代相应的游离氨基酸后对乳蛋白合成相关基因表达的影响，试验分为8个独立的组合，每个组合为1种含Met的二肽组与相应的游离氨基酸组构成，将每个组合的二肽组与游离氨基酸组进行对比分析，二肽和氨基酸添加浓度与试验第1、2部分一致。在3个试验中，每组均为6个重复，培养基中不加FBS。
1.3 原代BMECs体外培养BMECs采用胶原酶消化法获得。取健康荷斯坦奶牛乳腺组织，去除组织表层，于深处取约1 cm3的组织块，放入4 ℃预冷的PBS中。在超净台内用PBS将组织块初步洗净后，再去除组织块的表层，并将组织剪成糊状。加入0.5%胶原酶Ⅱ溶液，于37 ℃和5% CO2的条件下消化1 h，每隔20 min缓慢摇晃离心管。消化液用孔径为80目的细胞滤网过滤，收集细胞滤液，179×g离心5 min，弃上清。加入完全培养基，吹打均匀，然后转入25 cm2细胞培养瓶中，在37 ℃和5% CO2培养箱中培养。当细胞融合度达到80%~90%时，依据BMECs和成纤维细胞对胰蛋白酶消化敏感性不同的特点，对细胞进行纯化并传代。将传至第3代的BMECs悬液接种于25 cm2培养瓶中，置于37 ℃和5%CO2培养箱中培养[7]。
1.4 测试指标与方法 1.4.1 BMECs内乳蛋白合成相关基因的表达量将第3代的BMECs，以2×105个/孔密度接种于6孔培养板上，每组6个重复。培养结束后，细胞总RNA按照RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒的方法提取，总RNA的完整性和纯度用1.5%的琼脂糖凝胶电泳和酶标仪检测。反转录PCR采用PrimeScriptRT Master Mix试剂盒的方法进行，得到的cDNA用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒进行荧光定量PCR，反应体系为20 μL。用磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，对乳蛋白合成相关基因[αs1-酪蛋白(CSN1S1)、CSN2、κ-酪蛋白(CSN3)、β-乳球蛋白(LGB)、Ⅱ型小肽转运载体(PEPT2)和APN]的表达量进行测定，引物序列及参数见表 1。荧光定量PCR反应程序为：95.0 ℃(预变性)30 s；95.0 ℃(变性)30 s；退火温度30 s；72.0 ℃(延伸)20 s，40个循环；72 ℃(延伸)7 min。熔解曲线程序为：70~95 ℃，每6 s升温0.5 ℃，共51个循环，荧光定量PCR结果采用2-△△Ct法进行相对定量分析。
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表 1 引物序列及参数 Table 1 Primer sequences and parameters |
细胞培养48 h后，将细胞培养液15 000×g/min在4 ℃离心10 min，取上清；将细胞用PBS清洗3遍，向每孔加入70 μL的细胞裂解液，4 ℃孵育30 min后刮下细胞，4 ℃ 15 000 g/min离心10 min，取上清。提取出的APA采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒说明书的步骤进行检测。
1.5 数据处理与分析所有数据用Excel进行计算整理。试验数据采用SAS 9.0软件进行统计，第1部分与第2部分的数据用ANOVA程序进行单因素方差分析，并用Duncan氏法进行多重比较；第3部分二肽组与游离氨基酸组的数据用t检验进行分析。P＜0.05表示差异显著，0.05≤P＜0.10表示差异趋于显著。
2 结果 2.1 含Met的二肽对BMECs内乳蛋白合成相关基因表达量的影响表 2结果表明，对于CSN1S1基因表达量，P-Met-Met组较对照组和其他二肽组显著提高(P＜0.05) ，P-Met-Lys组较对照、P-Met-Leu和P-Met-Val组显著提高(P＜0.05) ；对于CSN2基因表达量，P-Met-Met、P-Met-Lys组较对照组、P-Met- Thr、P-Met-Trp、P-Met-Leu、P-Met-Ile和P-Met-Val组显著升高(P＜0.05) ，P-Met-Phe组较P-Met-Thr、P-Met-Leu、P-Met-Ile和P-Met-Val组显著升高(P＜0.05) ；对于CSN3基因表达量，P-Met-Met、P-Met-Lys、P-Met-Phe和P-Met-Ile组较P-Met-Thr、P-Met-Trp、P-Met-Leu和P-Met-Val组显著提高(P＜0.05) ；8种二肽对LGB、PEPT2和APN基因表达量均无显著影响(P>0.05) 。
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表 2 含Met的二肽对BMECs内乳蛋白、PEPT2和APN基因表达的影响 Table 2 Effects of dipeptides containing Met on gene expressions of milk proteins, PEPT2 and APN in BMECs |
表 3结果表明，F-Met-Met、F-Met-Lys组的CSN1S1基因表达量显著高于对照组和其他游离氨基酸组(P＜0.05) ；F-Met-Met、F-Met-Lys、F-Met-Phe和F-Met-Leu组的CSN2基因表达量显著高于F-Met-Thr组(P＜0.05) ；对于CSN3基因表达量，F-Met-Met、F-Met-Phe、F-Met-Trp和F-Met-Leu组较F-Met-Thr组显著升高(P＜0.05) ，F-Met-Lys组较F-Met-Phe、F-Met-Thr、F-Met-Trp、F-Met-Leu、F-Met-Ile和F-Met-Val组显著升高(P＜0.05) ；对于PEPT2基因表达量，F-Met-Met组较F-Met-Trp、F-Met-Leu、F-Met-Ile和F-Met-Val组显著升高(P＜0.05) ，F-Met-Lys组较F-Met-Ile组显著提高(P＜0.05) ；各组LGB和APN基因表达量均无显著差异(P>0.05) 。
2.3 二肽等量替代游离氨基酸对BMECs内乳蛋白合成相关基因表达及BMECs内外APA含量的影响表 4结果表明，与F-Met-Met组相比，P-Met-Met组显著上调了CSN1S1、CSN2和CSN3基因的表达量(P＜0.05) ；P-Met-Lys组和F-Met-Lys组相比，CSN2的基因表达量显著上调(P＜0.05) ，PEPT2的基因表达量趋于显著提高(P=0.09) ；与F-Met-Phe组相比，P-Met-Phe组显著提高了CSN1S1和APN基因的表达量(P＜0.05) ；P-Met-Trp组的CSN1S1和PEPT2基因表达量显著高于F-Met-Trp组(P＜0.05) ，对APN基因的表达量有显著提高的趋势(P=0.06) ；与F-Met-Leu组相比，P-Met-Leu组的CSN2基因的表达量显著降低(P＜0.05) ，PEPT2基因的表达量显著升高(P＜0.05) ，APN基因表达量有显著升高的趋势(P=0.06) ；与F-Met-Ile组相比，P-Met-Ile组的CSN1S1、CSN3和PEPT2基因的表达量显著上调(P＜0.05) ；P-Met-Val组PEPT2和APN基因表达量显著高于F-Met-Val组(P＜0.05) 。
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表 3 游离氨基酸对BMECs内乳蛋白、PEPT2和APN基因表达的影响 Table 3 Effects of free amino acids on gene expressions of milk protein, PEPT2 and APN in BMECs |
在细胞外，P-Met-Met组和P-Met-Lys组的APA含量趋于显著地低于相应的游离氨基酸组(P=0.06，P=0.07) ，其他二肽替代游离氨基酸后APA的含量变化均不显著(P＞0.05) ；在细胞内，8种二肽替代游离氨基酸后对APA含量影响不显著(P＞0.05) 。
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表 4 二肽等量替代游离氨基酸对BMECs内乳蛋白、PEPT2、APN基因表达及BMECs内外APA含量的影响 Table 4 Effects of substitution of free amino acids with dipeptides on gene expressions of milk protein, PEPT2 and APN in BMECs and APA content inside and outside BMECs |
牛奶乳蛋白的90%是由奶牛乳腺组织以氨基酸为原料合成的，并且用于乳腺内从头合成乳蛋白的氨基酸，90%以上是从血液当中吸收的[9]。然而有研究表明，乳腺组织不仅能从血液中单纯地摄取游离氨基酸合成乳蛋白，而且也能摄取以肽形式结合的必需氨基酸合成乳蛋白，但机理尚不明确[10]。周苗苗等[11]研究含Lys二肽对BMECs中乳蛋白合成的影响发现，添加Lys二肽能促进乳蛋白的合成。小肽被动物组织吸收利用依赖于其独立的转运载体系统，主要靠依赖H+和Ca2+的逆浓度梯度进行转运的，小肽转运载体具有转运速率快、吸收耗能低及不易饱和等特点[12]，而游离氨基酸转运载体与之相反，因此动物组织对小肽的利用效率在理论上绝对高于游离氨基酸。PEPT2是一种低容量、高亲和力的肽载体[13]，主要转运二肽和三肽类营养物质或仿肽类药物[14]。泌乳奶牛乳腺外植体试验研究指出，PEPT2的转运功能受到抑制会明显减少乳蛋白合成[15]。Zhou等[16]的研究指出，BMECs能摄取苯丙氨酸-苯丙氨酸(P-Phe-Phe)二肽促进PEPT2基因的表达并用于乳蛋白的合成，说明PEPT2可能在乳腺摄取小肽的过程中发挥着重要的作用。BMECs的表面存在一种能够将小肽水解成游离氨基酸的APA，APA是乳腺组织为乳蛋白合成提供氨基酸的肽酶之一[17]，当氨基酸水平不能满足机体泌乳需要时，细胞内或细胞外会发出代谢信号调节其表达活性。因此，小肽能够通过小肽转运载体和APA水解2个途径被乳腺组织吸收利用[17-18]。刘辉等[19]研究山羊乳腺对大豆小肽的吸收利用影响发现，灌注小肽促进了APN基因的表达，同时显著促进了乳蛋白合成。本试验结果表明，与对照组相比，P-Met-Met和P-Met-Lys组提高了CSN1S1和CSN2基因的表达，促进了乳蛋白的合成，以P-Met-Met组的效果更好，并且除P-Met-Met、P-Met-Phe和P-Met-Thr组外，其他二肽组的PEPT2基因表达量均显著或趋于显著地高于游离氨基酸组；通过对APA含量进行检测发现，在细胞内和细胞外均存在APA，且除P-Met-Met、P-Met-Lys和P-Met-Ile组外，其他二肽组的APN基因表达量均显著或趋于显著地高于游离氨基酸组，说明BMECs能产生APA，将二肽水解为游离氨基酸为乳蛋白的合成提供底物，并且可利用二肽合成乳蛋白。
一项含Met的肽的试验研究发现，不同种类的含Met二肽被BMECs利用效率不同，二肽形式结合的Met被利用的效率相当于游离蛋基酸利用效率的35%~122%，其中P-Met-Val、P-Met-Leu和亮氨酸-蛋氨酸(P-Leu-Met)二肽的利用能力要高于对应的游离氨基酸[20]。本试验得出，BMECs中用含Met的8种二肽等量替代相应的游离氨基酸后，除P-Met-Val和P-Met-Leu外，其他二肽比游离氨基酸能更好地促进CSN1S1、CSN2和CSN3基因的表达，尤其以P-Met-Met的促进效果更好，与F-Met-Met相比分别增加了23.1%、15.3%和18.5%；其次是P-Met-Phe和P-Met-Lys，分别较相应的游离氨基酸组增加了12.5%、6.1%、11.8%和8.0%、15.8%、3.7%。说明BMECs对二肽的利用效率高于相应的游离氨基酸。二肽组PEPT2和APN基因表达量也高于对应的游离氨基酸组，进一步说明BMECs能通过既摄取二肽也摄取氨基酸来合成乳蛋白，而且小肽与游离氨基酸相比能更有效地促进乳蛋白的合成。然而，小肽是如何进入细胞被利用以及二肽与游离氨基酸保持多大比例更适于乳蛋白的合成，本试验尚未进行研究，其确切的机理需要进一步探讨。
4 结论含Met二肽等物质的量替代对应的游离氨基酸能够促进乳蛋白基因的表达，其中以P-Met-Met、P-Met-Lys、P-Met-Phe和P-Met-Ile的促进效果较好，尤以P-Met-Met的效果最明显。
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