2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306;
3. 辽宁省海洋与渔业厅, 沈阳 110000
, YE Baomin3, CHANG Qing1, CHEN Siqing1
, LIU Changlin1, HU Jiancheng1, YAN Junli1,2, LU Bin1,2
2. College of Fishers and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
3. Administration of Ocean and Fisheries of Liaoning Province, Shenyang 110000, China
近几年随着水产品工厂集约化养殖，水产养殖动物的食物残渣和排泄物会产生大量氨氮，大量的氨氮是诱发养殖水产动物发生病害的重要因素。对于硬骨鱼类，机体氮代谢的主要产物就是氨氮[1]，大多数硬骨鱼类对氨氮毒性反应敏感[2]。养殖水体中高浓度的氨氮可对鱼体抗氧化系统产生损害，使抗氧化酶的活性下降，氧自由基含量增加[3-4]，进而使机体非特异性免疫系统遭到破坏[5]，造成鱼类体内代谢系统紊乱，对外源细菌病毒的易感性增加[6]，使病害流行和爆发的隐患增加。
维生素C(vitamin C)，又称L-抗坏血酸，是动物生长、生产及维持正常生理功能必不可少的一种微量元素，对调节血脂代谢，维持正常的心脏、中枢神经和造血功能和机体内众多激素的合成起重要作用。维生素C可促进鱼类生长，缓解环境等不良应激反应，提高自身免疫力[7]。由于多数鱼类缺乏合成维生素C所必需的L-古洛糖酸内酯氧化酶，因此自身不能合成维生素C，必须从食物中获取[8]。已有试验表明，氨氮胁迫下，青鱼鳃丝中Na+/K+-ATP酶活性下降，鳃和肝脏组织及抗氧化系统等产生严重损伤[9]。圆斑星鲽(Verasper variegatus)是重要的经济养殖鱼类，在工厂集约化养殖中会出现水质突变(氨氮浓度骤升)和病害问题。本试验通过在饲料中添加维生素C，探讨饲料维生素C含量对圆斑星鲽幼鱼抗氨氮胁迫能力的影响，以期为维生素C调控圆斑星鲽抵御环境应激的能力提供科学的理论指导。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验用鱼试验用圆斑星鲽幼鱼来自烟台天源水产有限公司同一批次健康幼鱼，平均体重(38.0±0.8) g。
1.1.2 试验饲料本试验参考文献[10]中基础饲料配方配制粗蛋白质含量为50.2%、粗脂肪含量为8.6%的基础饲料，其组成及营养水平见表 1。以维生素C多聚磷酸酯(维生素C有效含量35%，购自青岛金海力水产科技有限公司)作为维生素C添加源，在基础饲料中分别添加0、1 500、3 000、4 500、6 000、7 500和9 000 mg/kg的维生素C磷酸酯，共配制7种试验饲料，7种试验饲料中对应的维生素C含量的实测值分别为10.2(对照)、249.1、402.8、616.2、769.5、909.4和1 177.8 mg/kg。将饲料原料粉碎后过60目筛，混匀并用制粒机制成粒径为5 mm的颗粒饲料，65 ℃烘干后于-20 ℃保存备用。
1.2 试验方法 1.2.1 饲养方法将试验鱼随机分为7个组，每组3个重复，每个重复30尾，以重复为单位在圆柱形水槽(直径为53 cm、高60 cm)内暂养1周，试验期为8周。每天饱食投喂试验饲料1次(14:00) ，连续充气增氧，保证充足的氧气，并保持环境安静，每天(08:00和15:00) 定时换水。试验期间水温(12.5±1.5) ℃，pH 7.8±0.2，溶解氧浓度6.0 mg/L以上，并用氨氮测定仪对水体氨氮浓度进行监测，总氨氮浓度不高于0.1 mg/L。
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表 1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
投喂试验结束后，分别对各桶中圆斑星鲽进行计数、称重后从每桶取10尾鱼，参照胡毅等[9]方法，用氯化铵母液调节水体总氨氮浓度为20 mg/L，氨氮胁迫24 h。胁迫期间连续充气，保证溶解氧浓度不低于5.0 mg/L，pH在7.31，胁迫后养殖水中非离子氨浓度为0.272 mg/L。非离子氨浓度计算公式[11]如下：
C1=1.216×f×C2/100；
f=100/(10pKa-pH+1) ；
pKa=0.090 18+2 729.92/T；
T=273.15+t。
式中:C1为非离子氨浓度(mg/L);f为氨的水溶液中非离子氨的摩尔百分比(%);C2为氨氮浓度(mg/L);pKa为酸碱解离常数；T为绝对温度(K);t为摄氏温度(℃)。
1.2.3 样品采集与指标测定分别对氨氮胁迫前后的试验鱼进行取样。每桶分别随机抽取5尾鱼，从尾部静脉取血2 mL左右，用1%的肝素钠抗凝，低温放置4 h后4 000 r/min离心10 min，分离的血清于-20 ℃保存，用于测定血清生化指标。试验鱼采血后进行解剖，分离出鳃、肝脏和肌肉，用于鳃丝Na+/K+-ATP酶活性及肝脏和肌肉维生素C含量测定。Na+/K+-ATP酶活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定，维生素C含量采用2，4-二硝基苯肼法测定。
1.3 统计分析试验结果以平均值±标准差表示，用SPSS 17.0软件的ANOVA过程进行单因素方差分析，P＜0.05为差异显著，差异显著者采用Duncan氏法进行多重比较检验。用t检验检测氨氮胁迫前后的变化。
2 结果 2.1 饲料维生素C含量对氨氮胁迫前后圆斑星鲽幼鱼组织中维生素C含量的影响由表 2可知，氨氮胁迫前，血清中维生素C含量随着饲料维生素C含量的增加呈上升趋势，组间差异显著(P＜0.05) ；肝脏、肌肉中维生素C含量随着饲料中维生素C含量的增加先呈显著上升(P＜0.05) ，当饲料维生素C含量达到769.5 mg/kg时，肝脏和肌肉中维生素C积累达到饱和，再继续升高饲料维生素C含量，肝脏、肌肉中维生素C含量不再显著升高(P>0.05) 。氨氮胁迫后，血清中维生素C含量以769.5和1 177.8 mg/kg维生素C组较高，显著高于其他各组(P＜0.05) ；肌肉和肝脏中维生素C含量均以769.5 mg/kg维生素C组最高，显著高于其他各组(P＜0.05) 。与氨氮胁迫前相比，氨氮胁迫后616.2 mg/kg维生素C组血清中维生素C含量显著降低(P＜0.05) ，而769.5和1 177.8 mg/kg维生素C组则显著升高(P＜0.05) ；氨氮胁迫后对照组以及769.5、909.4、1 177.8 mg/kg维生素C组肌肉中维生素C含量均出现显著降低(P＜0.05) ；氨氮胁迫后对照组以及616.2、909.4、1 177.8 mg/kg维生素C组肝脏中维生素C含量均出现显著降低(P＜0.05) 。
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表 2 饲料维生素C含量对氨氮胁迫前后圆斑星鲽幼鱼组织中维生素C含量的影响 Table 2 Effects of dietary vitamin C content on vitamin C content in tissues of juvenile spotted halibut before and after ammonia-nitrite stress |
由表 3可知，除1 177.8 mg/kg维生素C组外，无论是氨氮胁迫前还是氨氮胁迫后，各维生素C添加组圆斑星鲽幼鱼血清中CAT和SOD活性均显著高于对照组(P＜0.05) 。氨氮胁迫使血清中 CAT和SOD活性降低，但添加维生素C可以使降低的幅度减少，除616.2 mg/kg维生素C组血清中CAT活性在氨氮胁迫前后无显著差异(P>0.05) 外，其他组血清中CAT和SOD活性在氨氮胁迫前后均差异显著(P＜0.05) 。
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表 3 饲料维生素C含量对氨氮胁迫前后圆斑星鲽幼鱼血清抗氧化酶活性的影响 Table 3 Effects of dietary vitamin C content on serum antioxidant enzyme activities of juvenile spotted halibut before and after ammonia-nitrite stress |
由表 4可知，无论是氨氮胁迫前还是氨氮胁迫后，各维生素C添加组圆斑星鲽幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶活性均显著高于对照组(P＜0.05) ，各维生素C添加组间无显著差异(P>0.05) 。氨氮胁迫使圆斑星鲽幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶活性降低，但只有对照组及909.4和1 177.8 mg/kg维生素C组在氨氮胁迫前后有显著差异(P＜0.05) 。
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表 4 饲料维生素C含量对氨氮胁迫前后圆斑星鲽幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶活性的影响 Table 4 Effects of dietary vitamin C content on gill Na+/K+-ATPase activity of juvenile spotted halibut before and after ammonia-nitrite stress U/mg prot |
由表 5可知，氨氮胁迫前，饲料中添加维生素C对圆斑星鲽幼鱼血清中皮质醇和乳酸含量未产生显著影响(P>0.05) ，但显著升高了血清中葡萄糖含量和总铁结合力(P＜0.05) 。氨氮胁迫后，饲料中添加维生素C显著升高了血清中总铁结合力(P＜0.05) ，显著降低了血清中葡萄糖、皮质醇和乳酸含量(P＜0.05) 。氨氮胁迫使血清中葡萄糖、皮质醇和乳酸含量均有所升高，其中各组血清中葡萄糖和乳酸含量在氨氮胁迫前后均有显著差异(P＜0.05) ，血清中皮质醇含量仅对照组在氨氮胁迫前后有显著差异(P＜0.05) 。此外，氨氮胁迫使血清中总铁结合力降低，各组在氨氮胁迫前后均有显著差异(P＜0.05) 。
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表 5 饲粮维生素C含量对氨氮胁迫前后血清部分应激生化指标的影响 Table 5 Effects of dietary vitamin C content on serum part stress indices of juvenile spotted halibut before and after ammonia-nitrite stress |
饲料中添加维生素C可促进鱼类生长和生理代谢，但摄入过量维生素C对机体代谢反而产生抑制作用[12-13]。有研究表明，组织中维生素C含量与饲料维生素C含量呈正相关，但当饲料维生素C含量增加的一定水平后，组织中维生素C的积累量会达到饱和状态进入平台期[14]。本试验中，随着饲料维生素C含量的增加，肌肉、肝脏和血清中维生素C积累量均呈上升趋势，当维生素C含量达到769.5 mg/kg后，肝脏和肌肉中维生素C积累量达到饱和。组织中维生素C的积累储存主要是在肝脏中，其维生素C含量比肌肉中高很多，维生素C的代谢主要也是在肝脏中。氨氮胁迫对249.1、402.8、616.2 mg/kg维生素C组肌肉中维生素C含量无显著影响，对249.1、402.8、769.5 mg/kg维生素C组肝脏中维生素C含量无显著影响。维生素C具有抗氧化和增强机体免疫力的作用，是机体重要的生理调节因子，氨氮胁迫后，鱼体有可能通过释放肝脏中积累的维生素C来消除因胁迫应激机体产生的氧化自由基，进而缓解胁迫造成的氧化损伤，但对照组饲料维生素C含量低，不足以来缓解应激胁迫产生的氧化自由基。而胁迫后血清中维生素C含量降低不大甚至升高，可能与机体调节肝脏中的维生素C使组织中维生素C释放到血液中有关。本试验结果与周岐存等[14]对点带石斑鱼(Epinepheluscoioides)、Dabrowski等[15]对虹蹲(Oncorhynchus mykiss)和Wang等[16]对鹦鹉鱼(Oplegnathusfasciatus)的研究结果一致。
动物机体提高抗氧化能力，清除体内过多自由基的防御系统有酶系统和非酶系统。其中酶系统主要包括SOD和CAT等酶。SOD和CAT可以有效清除体内自由基，从而使自由基处于形成与消除的平衡状态，避免机体产生过氧化损伤[17]。当机体受到环境胁迫时，机体会产生大量自由基形成氧化胁迫，体内抗氧化酶活性和抗氧化物质含量下降，使机体抗氧化系统防御功能降低[9]。本试验结果显示饲料中添加维生素C可有效提高血清中SOD和CAT的活性，从而使机体抗氧化能力升高。氨氮胁迫后，各维生素C添加组中抗氧化酶活性降低幅度明显降低，说明维生素C可以缓解氨氮胁迫对圆斑星鲽抗氧化系统造成的损害。已有研究证明水产动物对抗酸[18]、盐[19]和氨氮[20]等胁迫环境的能力与体内维生素C的抗氧化能力有关，与本试验结果与此相符。
鱼类呼吸及渗透调节主要由鳃部完成，Na+/K+-ATP酶是鳃部泌氯细胞和细胞器膜上的一种蛋白酶[21]，在鱼体中主要参与渗透调节过程。有研究表明环境胁迫可使鳃丝Na+/K+-ATP酶活性降低[12]。本试验结果表明，饲料中添加维生素C后鳃丝中Na+/K+-ATP酶活性明显升高，氨氮胁迫后各组鳃丝中Na+/K+-ATP酶活性均出现不同程度的降低，但维生素C添加组的降低幅度较小。这说明饲料中添加维生素C可以缓解氨氮胁迫对鳃丝造成的负面影响，降低氨氮胁迫对圆斑星鲽鳃部渗透调节功能造成的损害。本试验结果与胡毅等[22]的研究结果一致，但Wang等[23]日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的研究表明，氨氮胁迫下下饲料中维生素C含量达到137.8 mg/kg时鳃丝Na+/K+-ATP酶活性受到抑制的结果不一致，可能与物种对维生素C需求量不同有关。
皮质醇是当鱼体受到外界环境刺激时，下丘脑-垂体-肾间组织(hypothalamus-pituitary-interrenal，HPI)轴分泌的一种应激激素[24]，血液皮质醇含量是反映鱼类应激的灵敏信号[25]。研究发现，随着血液皮质醇含量的升高，血液葡萄糖含量也会升高[26]，原因可能是皮质醇能激活糖异生过程中的关键酶如葡萄糖-6-磷酸酶等，从而加速糖异生和糖原分解过程[25]，以满足鱼体在应激过程中对能量的需求。本试验中，氨氮胁迫后对照组血清中皮质醇含量显著升高，616.2 mg/kg维生素C组氨氮胁迫前后无显著变化，说明饲料维生素C含量为616.2 mg/kg时可以提高圆斑星鲽幼鱼抵抗外界刺激的应激能力。有关研究表明，维生素C在调节皮质醇合成和应激反应中起重要作用。维生素C一方面通过阻碍不饱和脂肪酸的氧化进而减少类固醇的产生，阻止皮质醇的合成[27]，另一方面可利用神经调节因子，调节多巴胺和去甲肾上腺素在脑部的合成，从而控制其行为，使鱼类对应激反应的抵抗力增强[28]。葡萄糖是生物机体生理代谢的主要能量来源，因而血清中葡萄糖含量恒定对鱼类的正常生理活动有重要意义。氨氮胁迫后，各组血清中葡萄糖含量显著升高，尤其是对照组和1 177.8 mg/kg维生素C组，升高幅度较大。这与对许氏平鲉和花鲈[29]的研究结果相似，原因是鱼类遇到外界环境胁迫时，糖类被作为能源物质迅速用于供能，以葡萄糖的形式进入血液使血液中葡萄糖含量升高。
乳酸是无氧呼吸能量代谢的产物，可以反映呼吸代谢的方式。鱼类受到氨氮胁迫时，鳃组织受到一定程度的破坏影响气体交换，进而使鱼体缺氧，机体有氧代谢受阻启动无氧代谢，因此血液中乳酸含量升高。本试验中，氨氮胁迫后各组血清中乳酸含量均显著升高，此结果与对锦鲤[30]、长缟鲹[31]的研究结果相一致。血清中乳酸含量以对照组升高幅度最大，402.8 mg/kg维生素C组升高幅度最小，说明402.8 mg/kg维生素C能有效减轻氨氮胁迫对圆斑星鲽幼鱼有氧代谢的阻碍。结合血清中皮质醇、葡萄糖和乳酸含量的变化，得出饲料维生素C含量为402.8～616.2 mg/kg时可有效减轻氨氮胁迫对圆斑星鲽幼鱼的应激损伤。
铁是微生物繁殖代谢所必需的营养素。转铁蛋白的铁结合力很高，具有抑制微生物的生长繁殖的杀菌作用。本试验结果表明，各维生素C添加组血清中总铁结合力均显著高于对照组，且在维生素C含量为249.1～616.2 mg/kg时血清中总铁结合力较高，说明饲料中试验含量的维生素C可增强圆斑星鲽幼鱼的铁结合能力，进而提高其杀菌能力。氨氮胁迫后血清总铁结合力出现下降趋势，各维生素C添加组与对照组相比下降幅度较小，说明维生素C使圆斑星鲽幼鱼对抗环境刺激、抵抗病菌感染的能力增强。目前维生素C对水产动物血清总铁结合力的研究还没有报道，但是关于泛酸[32]和维生素B6[33]对幼健鲤血清总铁结合力的研究结果与本试验结果一致。
4 结论结合各项测定指标，圆斑星鲽幼鱼饲料中维生素C含量在402.8～616.2 mg/kg时可有效提高机体抗氨氮胁迫能力。
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