2. 中国科学院大学, 北京 100039;
3. 湘潭大学, 湘潭 411005;
4. 广东省旺大集团猪清洁饲料技术研发院士工作站, 广州 510663;
5. 湖南畜禽安全生产协同创新中心, 长沙 410128
, CUI Zhijie1,2,3, HE Liuqin1,2, YAO Jiming4
, WU Fei1,2, HAN Hui1,2, FAN Wenjun4, LI Tiejun1,4,5
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China;
3. Xiangtan University, Xiangtan 411105, China;
4. Guangdong Wangda Group Academician Workstation for Clean Feed Technology Research and Development in Swine, Guangzhou 510663, China;
5. Hunan Co-Innovation Center of Animal Production Safety, Changsha 410128, China
近年来随着养猪业集约化发展，其所产生的粪污排放和饲料原料浪费问题也日趋严重。猪饲料中50%以上的氮以粪和尿素的方式排出体外，大部分被氧化成硝酸盐流入江河湖泊，进一步造成更广泛的环境污染[1]。如今解决氮的过量排放和减少饲粮蛋白质原料的浪费是养猪业面临的重大课题。不少学者认为在提高或不影响生产性能的情况下，可通过降低饲粮蛋白质水平、补充合成氨基酸，提高饲料利用率和减少对环境的污染[2-3]。据研究，饲粮蛋白质水平降低后，其限制性氨基酸的种类增多、限制性程度增大[4]。因此，在应用“氨基酸平衡模式”配制低蛋白质水平饲粮时，需补充人工合成的赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)等限制性氨基酸以满足动物需要。本研究通过颈动脉血管插管技术，研究了不同蛋白质水平饲粮对断奶仔猪血清氨基酸含量和生化参数的动态影响，监控断奶仔猪采食饲粮前后血清氨基酸和生化指标的变化，以期为降低饲粮蛋白质水平、提高饲料利用率和减少环境污染提供科学参考。
1 材料与方法 1.1 试验设计选取18头35日龄平均体重为(10.0±1.0) kg三元(杜×长×大)杂交断奶阉公仔猪(购自湖南新五丰永安分公司)，随机分为3个组，每组6个重复，每个重复1头猪，单栏饲养，分别饲喂蛋白质水平为14%(LP)、17%(MP)和20%(HP)的饲粮。饲粮配制参照NRC (2012)[5]推荐的断奶仔猪营养需要标准，饲粮的蛋白质来源一致，且平衡Lys、Met、Thr、Trp 4种氨基酸水平，并保持该4种氨基酸含量和能量水平相同，饲粮组成及营养水平与本项目组前期研究[6]一致。
1.2 试验材料和仪器氨基酸分析仪(L-8800，日本)，XC4型全自动血液生化分析仪(Beckman公司，美国)，TG16W微量高速离心机(中国)，磺基水杨酸(中国)。
1.3 饲养管理和颈动脉血管插管手术仔猪饲养于通风良好、温度为(23±1) ℃的干净猪舍内，自由采食和饮水，分别饲喂各自不同蛋白质水平饲粮5 d后，在第6天空腹(禁食12 h，自由饮水)称重，按组分别对每头试验仔猪实施颈动脉血管插管手术，术前先注射阿托品(0.05 mg/kg，浙江制药股份公司新昌制药厂)，15 min后肌肉注射舒泰50(0.1 mg/kg，法国维克)，10~15 min后动物处于麻醉状态，对仔猪颈部右侧消毒、刮毛。颈动脉血管插管手术方法参照李铁军等[7]和Morris等[8]的方法。
1.4 术后管理手术进行过程中手术室保持25 ℃左右。术后仔猪单栏饲喂于代谢笼中，禁食1 d，仅饲喂5%葡萄糖。术后第2天饲喂相应组的试验饲粮，自由采食和饮水，并在每天08:00、16:00和23:00，用无菌注射器从血管插管处抽取少量新鲜血液，后灌注10 mL的肝素钠溶液(400 IU/mL)，以确保插管畅通。术后恢复5 d (仔猪正常采食)，开始正式试验。
1.5 样品的采集和保存术后第6~8天，每次喂料前以及采食后30、60、120、180和300 min连续采集血液样品。每次每头用10 mL注射器采取10 mL血液于10 mL离心管中，4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液分装至1.5 mL离心管中，保存于-80 ℃冰箱，用于血清氨基酸含量和生化指标测定。
1.6 测定指标 1.6.1 血清游离氨基酸含量测定取1 mL血清加入1 mL 8%的磺基水杨酸漩涡混匀，静置过夜(3 ℃)，12 000 r/min离心15 min (4 ℃)，取上清液用过滤器(孔径0.22 μm)过滤，取500 μL过滤液于氨基酸分析仪进行氨基酸分析。
1.6.2 血清生化指标分析用全自动生化分析仪测定刚分离出的血清中尿素、总蛋白(total protein, TP)、白蛋白(albumin, ALB)、免疫球蛋白M (immunoglobulin M, IgM)和免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)含量以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性。
1.7 统计分析采用SPSS 21.0软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计分析，差异显著性用Duncan氏法进行多重比较，以P < 0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果 2.1 血清必需氨基酸Lys、Met、Thr和Trp对不同蛋白质水平饲粮的动态响应本研究是在本项目组前期研究的基础上进行的，前期研究表明，在满足Lys、Met、Thr、Trp需要量的条件下，断奶仔猪(10~30 kg阶段)饲粮蛋白质水平由20%降低至17%，不影响平均日增重、平均日采食量和饲料转化率，但降低至14%，生长性能则受到显著影响[9]。由图 1可知，降低蛋白质水平，补充4种必需氨基酸(Lys、Met、Thr和Trp)，仔猪采食前后各时间点血清中游离Lys、Met、Thr、Trp含量无显著差异(P > 0.05)。采食后，各组之间随着时间的延长，血清游离Lys、Met、Thr、Trp含量呈现先上升后下降最后趋于平稳的趋势，但随时间延长变化不显著(P > 0.05)。
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字母a代表同一时间HP和MP组差异显著(P < 0.05)，字母b代表同一时间HP和LP组差异显著(P < 0.05)，字母c代表同一时间MP和LP组差异显著(P < 0.05)，无字母标注表示差异不显著(P > 0.05)。下图同。 Letter a means significant difference between HP and MP group at the same time point (P < 0.05), b means significant difference between HP and LP group at the same time point (P < 0.05), c means significant difference between MP and LP groups at the same time point (P < 0.05), and no letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05). The same as below. 图 1 不同蛋白质水平饲粮对断奶仔猪血清游离Lys、Met、Thr和Trp含量的影响 Figure 1 Effects of diets with different protein levels on contents of free Lys, Met, Thr and Trp in serum of weaned piglets |
由图 2可知，各组血清游离支链氨基酸(Val、Ile、Leu)和Arg含量随饲粮蛋白质水平的降低而降低。采食前后，HP组血清中游离Val和Ile含量显著高于MP和LP组(P < 0.05)，MP组Val含量在采食后120、180 min与Ile含量在采食后180 min显著高于LP组(P < 0.05)，其余时间点MP和LP组无显著差异(P > 0.05)。采食前，HP组的Leu含量显著高于MP和LP组(P < 0.05)；采食后30、60 min，LP组和MP组Leu含量有上升趋势，HP组(24.34和26.70 μg/mL)、MP组(18.42和21.16 μg/mL)和LP组(22.32和23.39 μg/mL)间无显著差异(P > 0.05)；采食后120 min及以后各时间点LP组Leu含量显著低于HP组(P < 0.05)；采食后300 min HP组Leu含量显著高于MP组(P < 0.05)，其余各时间点LP与MP组Leu含量无显著差异(P > 0.05)。采食前，HP组Arg含量显著高于LP组(P < 0.05)，HP与MP组无显著差异(P > 0.05)。采食后30~180 min，HP组Arg含量显著高于MP和LP组(P < 0.05)，300 min时3组Arg含量无显著差异(P > 0.05)。各组不同时间点之间，血清游离Val、Ile、Leu和Arg含量随时间变化差异不显著(P > 0.05)。
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图 2 不同蛋白质水平饲粮对断奶仔猪血清游离Val、Ile、Leu和Arg含量的影响 Figure 2 Effects of diets with different protein levels on contents of free Val, Ile, Leu and Arg in serum of weaned piglets |
由图 3可知，除游离Pro和Cys含量外，各时间点各组之间仔猪血清游离Asp、Ser、Gly和Glu含量均无显著差异(P > 0.05)。Pro含量在采食前，HP组(20.34 μg/mL)显著高于MP (10.81 μg/mL)和LP组(13.90 μg/mL)(P < 0.05)，采食后180 min Pro含量显著高于LP组(P < 0.05)；其余各时间点，HP组与MP组、MP组与LP组间无显著差异(P > 0.05)。除游离Cys和Gly含量外，非必需氨基酸Asp、Ser、Pro和Glu含量随饲粮蛋白质水平降低而降低，Cys和Gly含量随饲粮蛋白质水平降低而升高。每组不同时间点之间，随时间变化血清非必需氨基酸Pro、Asp、Ser、Gly、Cys和Glu含量无显著差异(P > 0.05)。
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图 3 不同蛋白质水平饲粮对断奶仔血清游离Pro、Asp、Ser、Gly、Cys和Glu含量的影响 Figure 3 Effects of diets with different protein levels on contents of free Pro, Asp, Ser, Gly and Glu in serum of weaned piglets |
由图 4-A、4-B和4-C可知，不同时间点血清LP组TP、ALB含量和ALP活性均高于其他2组。除采食前外，在其他时间点LP组血清TP含量显著高于HP和MP组(P < 0.05)，MP和HP组无显著差异(P > 0.05)。血清ALB含量在采食后120、180和300 min，LP组(25.96、25.36和25.60 g/L)显著高于HP组(22.52、22.86和22.54 g/L)和MP组(22.98、22.86和22.54 g/L)(P < 0.05)；其余时间点，3组之间差异不显著(P > 0.05)。采食后60 min以及之后的时间段，LP组血清ALP活性显著高于HP组(P < 0.05)；采食后60和180 min，LP组血清ALP活性显著高于MP组(P < 0.05)；其余时间点，各组无显著差异(P > 0.05)。血清ALP活性随饲粮蛋白质水平降低而升高。每组不同时间点之间血清TP、ALB含量和ALP活性随时间变化均差异不显著(P > 0.05)。
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图 4 不同蛋白质水平饲粮对断奶仔猪血清TP、ALB、尿素、IgG和IgM含量及ALP活性的影响 Figure 4 Effects of diets with different protein levels on contents of TP, ALB, urea, IgG, IgM and ALP activity in serum of weaned piglets |
由图 4-D可知，各时间点之间，HP组血清尿素含量显著高于LP组(P < 0.05)；采食前及采食后30和300 min，HP组显著高于MP组(P < 0.05)；采食后120~300 min，MP组显著高于LP组(P < 0.05)。每组不同时间点之间血清尿素含量随时间的变化无显著差异(P > 0.05)。由图 4-E和4-F可知，采食后120 min，LP组血清IgG和IgM含量显著低于HP组(P < 0.05)；其余时间点，各组IgG和IgM含量无显著差异(P > 0.05)。每组不同时间点之间血清IgM和IgG含量随时间变化无显著差异(P > 0.05)。
3 讨论 3.1 断奶仔猪血清Lys、Met、Thr和Trp含量对不同蛋白质水平饲粮的动态响应有研究表明降低饲粮蛋白质水平，同时补充Lys、Met、Thr和Trp可以提高饲粮蛋白质的利用率，减少粪尿氮的排放[10-11]。本研究通过降低3和6个百分点的饲粮蛋白质水平，应用“氨基酸平衡模式”补充合成的Lys、Met、Thr和Trp研究血清游离氨基酸含量变化规律。试验结果发现降低3和6个百分点的饲粮蛋白质水平对血清Lys、Met、Thr和Trp含量无显著影响，且补充的这4种氨基酸含量随饲粮蛋白质水平的降低而升高。但当饲粮蛋白质水平降低6个百分点后，断奶仔猪食后0~120 min，血清游离Lys、Met、Thr和Trp含量高于其他2组，这与邓敦等[12]研究结果一致。这可能是由于随着饲粮蛋白质水平降低，饲粮中补充的Lys、Met、Thr和Trp这4种氨基酸含量增加，仔猪采食饲粮中合成氨基酸进入胃肠道后不需要蛋白酶的分解，直接被胃肠道吸收。这表明适当降低蛋白质水平，补充满足仔猪机体所需的合成氨基酸，能在一定程度上提高断奶仔猪胃肠道对Lys、Met、Thr和Trp的吸收。
3.2 断奶仔猪血清Val、Ile、Leu和Arg含量对不同蛋白质水平饲粮的动态响应血清游离氨基酸含量在一定程度上可以反映动物氨基酸的需要量，当饲粮氨基酸含量不足时，血清游离氨基酸含量将处于较低状态，随着进食，血清中游离氨基酸将迅速积累[13]。当饲粮蛋白质水平降低3或6个百分点时，测得各时间点仔猪血清游离支链氨基酸(Val、Ile、Leu)和Arg含量显著低于饲喂20%蛋白质水平的饲粮。这表明降低饲粮蛋白质水平，断奶仔猪血清中必需氨基酸含量将会受到显著影响。这可能是由于降低饲粮蛋白质水平引起饲粮所提供的Val、Ile、Leu和Arg必需氨基酸不能满足仔猪生长需求[12]。另外这也说明合成氨基酸与饲粮蛋白质本身提供的必需氨基酸是有区别的，因此，合成氨基酸不可完全替代饲粮蛋白质本身分解的氨基酸。支链氨基酸Val、Leu、Ile与机体蛋白质和能量代谢有密切关系，Leu通过雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路调节机体能量和蛋白质的代谢，促进动物生长和健康[14-15]。据相关研究表明降低蛋白质水平补充支链氨基酸能够改善仔猪生产性能，提高采食量和肌肉生长[16]。本研究发现降低饲粮蛋白质水平并补充Lys、Met、Thr、Trp 4种必需氨基酸，血清中游离的支链氨基酸含量依然较低，因此，这一结果提示我们饲粮在补充Lys、Met、Thr、Trp前提下，同时适量补充支链氨基酸才能满足仔猪生长和健康的需要。
3.3 断奶仔猪血清Pro、Asp、Ser、Gly、Cys和Glu含量对饲粮不同蛋白质水平的动态响应饲粮蛋白质水平降低3或6个百分点，对食后各时间点仔猪血清游离非必需氨基(除Pro和Cys外)含量无显著影响。血清游离非必需氨基酸含量随时间变化无显著变化，但各组仔猪血清中非必需氨基酸(除Gly和Cys外)含量随饲喂饲粮蛋白质水平的降低而降低。研究表明，当饲粮提供的非必需氨基酸不能满足动物机体需求时，动物机体能通过一系列转氨反应合成非必需氨基酸以满足动物的需求[17-18]。另外，本试验中降低蛋白质水平造成血清中Pro含量降低，但可提高Gly和Cys含量。这一结果可能是由于Pro作为判断肠道是否应激和帮助蛋白质分解的一个重要指标，它对维持断奶仔猪健康生长非常重要[19-23]，而降低蛋白质水平会直接引起内源Pro的不足，进一步影响仔猪的正常生长发育。血清中Gly和Cys对机体脂肪代谢和解毒作用有重要作用[24-26]，降低饲粮蛋白质水平本身对断奶仔猪是一个应激，为了满足机体需求，自身上调血清中Gly和Cys含量，以期减缓饲粮蛋白质水平不足造成的影响。不过，断奶仔猪血清中Pro、Gly和Cys对降低蛋白质水平的不同响应机理还需进一步研究。
3.4 断奶仔猪血清生化参数对不同蛋白质水平饲粮的动态响应血清生化指标的变化是机体新陈代谢机能和组织细胞通透性变化的综合反映。血清TP在一定程度上代表了饲粮中蛋白质的营养水平及动物对蛋白质的消化吸收程度。ALB由肝实质细胞合成，是血清中含量最多的蛋白质，占血清总蛋白质的40%~60%，合成效率受饲粮中蛋白质水平的影响[27]。当TP和ALB含量升高时蛋白质代谢旺盛，饲料利用率提高。研究表明降低鸡和鹅[28-29]饲粮蛋白质水平3个百分点，血清中TP含量显著上升，对血清ALB含量无显著影响。这一结果与本试验结果类似。当饲粮蛋白质水平降低6个百分点时，血清中TP和ALB含量显著增加，这表明饲粮降低6个百分点的蛋白质水平可以提高仔猪对饲粮中蛋白质水平的消化吸收程度，同时有助于提高肝脏白蛋白的合成能力。
血清中的尿素是蛋白质的最终产物，反映了体内蛋白质的代谢情况，与饲粮中氮的利用率呈反比[30-31]。同时氮营养素在不同组织器官中的代谢主要通过谷氨酰胺、丙氨酸和尿素等氮代谢关键产物进行协同整合[32-35]。本试验数据显示血清中尿素的含量随饲粮蛋白质水平降低而降低，表明适当降低饲粮蛋白质水平可以提高饲料中氮的利用率，从而减少氮的排放量。同时这一结果与郑春田等[36]、张敏等[37]和Toledo等[38]研究结果一致。
ALP是消化代谢的关键酶，能产生磷酸，与钙生成磷酸钙沉淀，参与骨骼钙化过程，是动物成骨细胞活动的重要指标[39]。本研究发现，断奶仔猪饲喂14%蛋白质水平饲粮，血清ALP活性显著偏高。这可能是由于饲粮蛋白质降低6个百分点时，将会造成肝功能异常，从而引发相关疾病。因有研究报道人体患有阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等肝功能疾病时，肝细胞过度制造ALP，引起血清中的ALP活性偏高[40]。
体液免疫是动物机体抵抗疾病的重要机制，这种免疫力取决于免疫球蛋白质的种类和数目[41]。机体受病原体感染后，IgM最先与病原体结合，溶解病原体。IgG有抗菌和抗病毒作用[42]。本研究发现，饲粮降低蛋白质水平6个百分点，仔猪食后120 min血清IgG和IgM含量显著降低。其他时间点对血清IgG和IgM含量没有影响，与侯永清等[43]研究蛋白质水平为20%和18%饲粮对早期断奶仔猪血清IgG含量影响的结果类似。这表明降低饲粮蛋白质水平，对仔猪血清IgG和IgM的含量基本无影响，所以适量降低蛋白质水平不会降低仔猪的免疫能力，但对仔猪食后120 min血清IgG和IgM含量降低的现象还需进一步研究。
4 结论在本试验条件下，饲粮蛋白质降低3个百分点，同时补足Lys、Met、Thr和Trp，不影响血清该类氨基酸、Leu以及非必需氨基酸Asp、Ser、Gly、Cys和Glu的含量；同时不影响血清IgM、IgG、尿素、TP、ALB含量以及ALP活性；但显著降低血清必需氨基酸Val、Ile和Arg含量。饲粮蛋白质降低6个百分点，同时补足Lys、Met、Thr和Trp必需氨基酸时，显著降低血清必需氨基酸Leu和尿素含量，提高血清TP、ALB含量和ALP活性。因此，在考虑生长性能不受影响的条件下，适量降低断奶仔猪饲粮蛋白质水平(17%)，除需满足Lys、Met、Thr和Trp外，还需针对Val、Leu、Ile和Arg需要量进行考究，这样才能进一步为提高饲料利用率和减少氮的排放量提供科学指导。
致谢: 感谢中国科学院亚热带农业生态研究所公共技术服务中心对本文血清氨基酸含量及生化参数检测提供的帮助。| [1] | 张乃锋, 邓柏林, 张永发, 等. 低排放日粮对育肥猪及粪便氮磷排放量的影响[J]. 猪业科学, 2013 (6) :74 –76. |
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