, HE Xueman, DENG Haifeng, LI Xiaobin, LIU Zhen, MA Jun, GAN Jianrong, TANG Xuemei, YANG Kailun
维生素B1、维生素B2是维持动物正常生理功能的一类微量有机物质[1]。维生素B1又称硫胺素，在动物体内主要以硫胺素单磷酸(thiamine monophosphate, TMP)、焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate, TPP)、硫胺素三磷酸(thiamine triphosphate, TTP)3种形式存在[2]，维生素B1以TPP的形式存在并以辅酶的形式参与调节体内糖、脂肪和蛋白质的代谢[3]；维生素B2又称核黄素，在体内主要以黄素单核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)的形式存在，它们是多种氧化酶的辅助因子，在生物氧化过程中参与氢的传递，在能量代谢中，促进碳水化合物、蛋白质、脂肪、核酸的代谢[4]。根据营养学研究，马匹长期缺乏维生素B1出现生长受阻现象、被毛光泽下降、痢疾、精神萎靡、神经错乱、运动失调等症状[5]；马匹长期缺乏维生素B2出现眼睑炎、食欲不振、体重减轻等症状[6]。伊犁马是我国著名的培育品种之一，具有性情温顺、体质结实紧凑、遗传性能较稳定、力速兼备等特点。但是伊犁马对营养物质明确的需要量尚不完善，特别是对于维生素类营养物质的适宜需要量没有明确的参考依据。因此，本试验以12月龄伊犁马公马为研究对象，通过在饲粮中添加不同水平的维生素B1、维生素B2，综合评定维生素B1、维生素B2摄入量对血浆中维生素B1、维生素B2的含量，红细胞转酮酶活性(erythrocyte transketolase activity, E-TKA)，TPP效应，红细胞谷胱甘肽还原酶活性系数(erythrocyte glutathione reductase activity coefficient, E-GRAC)，尿液维生素B1、维生素B2排出量的影响，从而确定12月龄伊犁马对维生素B1、维生素B2的需要量，为今后对伊犁马科学饲养提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计本试验选择12月龄±5日龄、平均体重为(245.28±18.36) kg的伊犁马公马35匹，随机分为5组，分别为试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组、试验Ⅴ组，每组7匹。每天每匹马饲喂2 kg精料补充料，自由采食粗饲料(苜蓿干草)。试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组、试验Ⅴ组每天每匹马分别添加0、16、32、48和64 mg的维生素B1(纯度为99.1%，购自江西天新药业有限公司)和0、10、20、30和40 mg的维生素B2(纯度为99%，购自广济药业有限公司)，进行为期20 d的饲养试验。
1.2 饲养管理在试验期所有试验马匹采用分槽分栏饲喂，自由采食粗饲料，自由饮水；将精料补充料平均分为4份，分别进行补喂；将每匹马需要添加的维生素B1、维生素B2分别装入胶囊，补喂精料补充料的同时进行添加。在试验第15~20天记录每匹马每天的采食量及收集每匹马每天的尿样，并在试验第20天采集血样。试验马匹的饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis) |
在试验第15~20天，分别记录每天每匹马的采食量及排尿量。
1.3.2 样品的采集及保存 1.3.2.1 饲草料样品的采集及保存在第14天采集马匹精料补充料样品及粗饲料样品各1 kg，将风干的样品经粉碎机40目粉碎，待测。
1.3.2.2 尿样的采集及保存在试验第15~20天全天收集马匹尿液，将全天尿液充分混匀，量取尿液总体积的10%为待测样品，记录、-20 ℃冷冻保存。最终将同一匹马6 d的尿样全部混匀，于-20 ℃避光冷冻保存，待测。
1.3.2.3 血样的采集及保存在试验第20天早晨空腹颈部静脉采用肝素钠抗凝管采集血样，将血样迅速以1 500×g离心15 min后分离血浆，于-20 ℃避光冷冻保存。
1.3.2.4 血红细胞样的采集及保存在试验第20天早晨空腹颈部静脉采用肝素钠抗凝管采集血样，将血样迅速以1 500×g离心15 min后弃去血浆层，在管中加入10 mL生理盐水，用塑料滴管轻轻吹吸混匀，再以429×g离心10 min，弃上清液得到红细胞，以此方法重复2次后得到红细胞，于-20 ℃避光冷冻保存。
1.4 指标测定 1.4.1 维生素B1含量的测定血浆的处理：取完全解冻、混匀后的血浆样品500 μL，加入100 μL 3 mol/L三氯乙酸溶液，充分混合均匀，4 286×g离心10 min后吸取上清液300 μL加入900 μL水饱和乙醚混匀，混匀后4 286×g离心5 min，吸取下层液200 μL进行衍生[7]。取室温解冻、充分混匀后的尿原液，用针头式过滤器过滤后稀释100倍，吸取200 μL进行衍生[8]。称取饲草料样品1.00 g置于50 mL棕色容量瓶中，加入0.1 mol/L盐酸溶液35 mL，超声波水浴中超声3 min，在高压灭菌锅内121 ℃保持30 min，取出后轻摇数次，加入混合酶液(淀粉酶和木瓜蛋白酶各3 g溶于100 mL 2 mol/L乙酸钠溶液中)37 ℃恒温培养箱中12 h，取出冷却至室温后加水定容至50 mL，样品经4 286×g离心3 min，取上清液200 μL进行衍生[9]。衍生时在处理液中加入40 μL 12 mmol/L的碱性铁氰化钾溶液，涡旋使其充分混匀15 s；加入8 μL 5 mol/L磷酸终止反应。色谱条件[7]：PRP-1反相柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)；流动相为15 mmol/L磷酸二氢钠:四氢呋喃=90 : 10(V/V)；柱温25 ℃；流速0.5 mL/min；一元等梯度洗脱。检测波长：激发波长(λex)=365 nm，发射波长(λem)=435 nm。进样量10 μL。
1.4.2 E-TKA及TPP效应的测定参照Takeuchi等[10]的方法，分别在540、510 nm的波长下比色，利用7-景天庚酮糖的含量表示E-TKA；TPP效应是通过体外试验测定加入TPP前后的E-TKA，两者之差占基础活性的百分率。
1.4.3 维生素B2含量的测定取充分解冻、混匀后的血浆样品0.2 mL，加入等体积的15 mmol/L 10%乙酸镁，充分混匀静置5 min，65 ℃水浴15 min，加0.1 mL 10%三氯乙酸，4 286×g离心10 min后取上清液，避光放置于4 ℃冰箱，供高效液相色谱(HPLC)分析[11]。取室温解冻、充分混匀后的尿原液，用针头式过滤器过滤，滤液稀释5倍后进行HPLC分析[12]。色谱条件[11]：XB-C18(4.6 mm×100 mm，5 μm)色谱柱；流动相为10 mmol/L pH 3.4的磷酸钾缓冲液:乙腈=85 : 15(V/V)；柱温25 ℃；流速1 mL/min；一元等梯度洗脱。检测波长：λex=445 nm，λem=530 nm。进样量10 μL。
1.4.4 E-GRAC的测定参照李丽花[13]的方法进行。
1.5 数据处理试验结果均以平均值±标准差(mean±SD)表示。试验数据采用SPSS 18.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行方差分析，各组间的多重比较采用Duncan氏法进行。
2 结果与分析 2.1 维生素B1不同摄入量对12月龄伊犁马血浆维生素B1含量、E-TKA、TPP效应及尿液维生素B1排出量的影响由表 2可知，随着实际摄入维生素B1量的增加，12月龄伊犁马血浆维生素B1含量逐渐升高，以试验Ⅰ组血浆维生素B1含量(6.18 μg/L)最低，显著低于试验Ⅲ组(P < 0.05)，极显著低于试验Ⅳ组、试验Ⅴ组(P < 0.01)；当实际摄入维生素B1量达到或超过33.49 mg/d (试验Ⅱ组)时，血浆维生素B1含量达到较高水平(7.04~8.12 μg/L)，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组、试验Ⅴ组之间差异均不显著(P＞0.05)，即血浆维生素B1含量从试验Ⅱ组之后逐渐趋于稳定。以血浆维生素B1含量为评价指标，得到12月龄伊犁马对维生素B1的需要量为33.49 mg/(匹·d)。
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表 2 维生素B1不同摄入量对12月龄伊犁马血浆维生素B1含量、E-TKA、TPP效应以及尿液维生素B1排出量的影响 Table 2 Effects of different intakes of VB1 on plasma VB1 content, E-TKA, TPP-effect and urinary VB1 content of 12-month-old Yili horses |
随着实际摄入维生素B1量的增加，12月龄伊犁马E-TKA逐渐提高，以试验Ⅰ组E-TKA (10.20 U/mL红细胞)最低，极显著低于试验Ⅲ组、试验Ⅳ组和试验Ⅴ组(P < 0.01)；当实际摄入维生素B1达到或超过48.27 mg/d (试验Ⅲ组)时，E-TKA达到较高水平(17.43~21.29 U/mL红细胞)，试验Ⅲ组、试验Ⅳ组、试验Ⅴ组之间差异不显著(P＞0.05)，即E-TKA从试验Ⅲ组之后逐渐趋于稳定。以E-TKA为评价指标，得到12月龄伊犁马对维生素B1的需要量为48.27 mg/(匹·d)。
随着实际摄入维生素B1量的增加，12月龄伊犁马TPP效应逐渐降低，以试验Ⅰ组TPP效应(53.83%)最高，显著高于试验Ⅲ组(P < 0.05)，极显著高于试验Ⅳ组、试验Ⅴ组(P < 0.01)；当实际摄入维生素B1量达到或超过48.27 mg/d (试验Ⅲ组)时，TPP效应达到较低水平(6.62%~30.05%)。以TPP效应为评价指标，得到12月龄伊犁马对维生素B1的需要量为48.27 mg/(匹·d)。
随着实际摄入维生素B1量的增加，12月龄伊犁马尿液维生素B1排出量逐渐增加，以试验Ⅰ组尿液维生素B1排出量(2.03 mg/d)最少，极显著低于试验Ⅲ组、试验Ⅳ组、试验Ⅴ组(P < 0.01)；当实际摄入维生素B1量达到或超过48.27 mg/d (试验Ⅲ组)时，尿液维生素B1排出量达到较高水平(6.41~7.34 mg/d)。以尿液维生素B1排出量为评价指标，得到12月龄伊犁马对维生素B1的需要量为48.27 mg/(匹·d)。
2.2 维生素B2不同摄入量对12月龄伊犁马血浆维生素B2含量、E-GRAC及尿液维生素B2排出量的影响由表 3可知，随着实际摄入维生素B2量的增加，12月龄伊犁马血浆维生素B2含量出现波动变化，以试验Ⅰ组血浆维生素B2含量(11.79 μg/L)最低，显著低于试验Ⅲ组、试验Ⅳ组(P < 0.05)，极显著低于试验Ⅱ组、试验Ⅴ组(P < 0.01)；当实际摄入维生素B2量达到或超过31.68 mg/d (试验Ⅱ组)时，血浆维生素B2含量达到较高水平(14.12~15.19 μg/L)，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组和试验Ⅴ组之间差异均不显著(P＞0.05)，即血浆维生素B2含量从试验Ⅱ组之后逐渐趋于稳定。以血浆维生素B2含量为评价指标，得到12月龄伊犁马对维生素B2的需要量为31.68 mg/(匹·d)。
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表 3 维生素B2不同摄入量对12月龄伊犁马血浆维生素B2含量、E-GRAC及尿液维生素B2排出量的影响 Table 3 Effects of different intakes of VB2 on plasma VB2 content, E-GRAC and urinary VB2 output of 12-month-old Yili horses |
随着实际摄入维生素B2量的增加，12月龄伊犁马E-GRAC逐渐降低，以试验Ⅰ组E-GRAC (1.03)最高，极显著高于试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组、试验Ⅴ组(P < 0.01)；当实际摄入维生素B2量达到或超过31.68 mg/d (试验Ⅱ组)时，E-GRAC达到较低水平(0.68~0.72)，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组、试验Ⅴ组之间差异均不显著(P＞0.05)，即E-GRAC从试验Ⅱ组之后逐渐趋于稳定。以E-GRAC为评价指标，得到12月龄伊犁马对维生素B2的需要量为31.68 mg/(匹·d)。
随着实际摄入维生素B2量的增加，12月龄伊犁马尿液维生素B2排出量逐渐增加，以试验Ⅰ组尿液维生素B2排出量(3.6 mg/d)最少，极显著低于试验Ⅲ组、试验Ⅳ组、试验Ⅴ组(P < 0.01)；当实际摄入维生素B2量达到或超过31.68 mg/d (试验Ⅱ组)平时，尿液维生素B2排出量达到较高水平(5.23~7.10 mg/d)，试验Ⅲ组、试验Ⅳ组、试验Ⅴ组之间差异均不显著(P＞0.05)，即尿液维生素B2排出量从试验Ⅱ组之后逐渐趋于稳定。以尿液维生素B2排出量为评价指标，得到12月龄伊犁马对维生素B2的需要量为31.68 mg/(匹·d)。
3 讨论 3.1 维生素B1不同摄入量对血浆维生素B1含量、E-TKA、TPP效应以及尿液维生素B1排出量的影响维生素B1是一种维持正常糖代谢以及保证神经、消化系统功能正常的物质，对维持动物的生长、健康、发育、繁殖、免疫均具有十分重要的意义。马属动物维生素B1缺乏的临床表现是食欲不振、心率降低，慢性症状表现为腹泻、厌食症、心搏过缓、肌肉松弛抽搐、感觉过敏、共济失调和痉挛等[14-15]。因此，维生素B1是马属动物维持机体正常代谢不可缺少的营养物质。维生素B1在机体的营养状况评价常用指标有血浆维生素B1含量、E-TKA、TPP效应及尿液维生素B1排出量等，根据不同维生素B1摄入量对血浆维生素B1含量、E-TKA、TPP效应及尿液维生素B1排出量等指标的影响，从而确定动物机体对维生素B1的适宜需要量。Tallaksen等[16]以血浆维生素B1含量为评价指标，得到30位酒精肝患者对维生素B1的需要量为52.50 mg/d；Reinken等[17]通过E-TKA和TPP效应评价了1月龄至14周岁儿童的维生素B1营养状况。Ziporin等[18]研究发现，当大量摄入维生素B1时，尿液中维生素B1的含量迅速增加，当维生素B1摄入量在0.6~2.0 mg/d时，根据维生素B1摄入量对尿液维生素B1排出量的影响，得到8位健康的男青年对维生素B1的需要量为0.81 mg/d。
本试验测得5组12月龄伊犁马血浆中维生素B1的含量分别为6.18、7.04、7.59、8.39、8.12 μg/L，Hünsche等[19]研究表明马匹血浆维生素B1的含量范围为5.05~23.8 μg/L，本试验中各组试验马匹血浆维生素B1含量均在此范围内，随着实际摄入维生素B1量的增加，血浆中维生素B1的含量先增加最后逐渐趋于稳定，因此，根据不同维生素B1摄入量对血浆维生素B1含量的影响，得到12月龄伊犁马对维生素B1的需要量为48.27 mg/(匹·d)。
转酮酶(transketolase，TK)是动物红细胞中的一种酶，其辅酶成分是维生素B1的磷酸衍生物TPP，维生素B1的满足程度将影响到红细胞中转酮酶活性的高低，因此，动物E-TKA经常用于判定动物机体的维生素B1营养状况；TPP效应是通过体外试验测定加入TPP前后的E-TKA的差值得到的，加入TPP后，E-TKA增加越多说明维生素B1缺乏越严重，TPP效应是目前评价维生素B1营养状况较为常用的指标[20]。在本试验中，增加维生素B1摄入量增加了E-TKA，降低了TPP效应，因此，根据不同维生素B1摄入量对E-TKA、TPP效应的影响，得到12月龄伊犁马对维生素B1的需要量为48.27 mg/(匹·d)。
饲粮中摄入的维生素B1经小肠吸收进入血液后主要从肾脏系统中排出，当额外添加大量的维生素B1时，可通过肾小球过滤作用将机体中多余的维生素B1随尿液排出体外[21]。由本试验结果可知，以尿液维生素B1排出量为评价指标，得到12月龄伊犁马对维生素B1的需要量为48.27 mg/(匹·d)。
3.2 维生素B2不同摄入量对血浆维生素B2含量、E-GRAC及尿液维生素B2排出量的影响根据营养学研究，机体内长期缺乏维生素B2会影响机体基础代谢，出现生长受阻现象、严重缺乏会导致被毛粗乱、脱落，皮质溢性皮肤等症状。Mc Dowell[22]研究表明，瘤胃发育不全的犊牛和羔羊会发生维生素B2缺乏症，主要表现为口腔黏膜充血、口角发炎、流涎、流泪及厌食、腹泻及生长不良等非特异性症状。因此，维生素B2对于动物机体有至关重要的作用。对动物机体维生素B2营养状况的评价指标有血浆维生素B2、FAD、FMN的含量、红细胞中维生素B2、FAD、FMN的含量，E-GRAC以及尿液维生素B2排出量等指标[23]，这些指标是评价动物机体维生素B2营养状况的敏感指标，已经被广泛用于评价畜禽维生素B2需要量的研究中。Hustad等[24]研究发现，以血浆维生素B2含量为评价指标，大于60岁的维生素B2缺乏的老人，补充维生素B2的量为16 mg/d。陈金文等[25]在肉用仔鸡维生素B2需要量研究中，以E-GRAC为评价指标得到肉用仔鸡维生素B2需要量为6.4 mg/d；Bates等[26]研究表明，以E-GRAC为评价指标，非洲哺乳期女性需额外添加2.0 mg/d。郭长江等[27]以尿液维生素B2排出量为评价标准，得到重度劳动军人对维生素B2的需要量为1.8 mg/d；Lo[28]研究报道，以尿液维生素B2排出量为评价指标，得到1~19岁青年对维生素B2的需要量为1.5~2.0 mg/d。
血浆中维生素B2的含量可以直接反映机体维生素B2的营养状况[29]。本试验中，随着实际摄入维生素B2量的增加，血浆中维生素B2含量出现了波动变化；以血浆维生素B2含量为评价指标，得到12月龄伊犁马对维生素B2的需要量为31.68 mg/(匹·d)。
谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)主要存在于红细胞中，额外加入FAD，把未活化的GR激活，可测的GR的总活性。总的GR消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)比活化型GR消耗的多，在反应体系中，将额外加入FAD的吸光度值和未加入FAD的吸光度值的比值称为E-GRAC[30]。在本试验中，随着实际摄入维生素B2量的增加，E-GRAC逐渐降低，以E-GRAC为评价指标，得到12月龄伊犁马对维生素B2的需要量为31.68 mg/(匹·d)。
尿液中维生素B2的排出量是评价动物机体较常用的指标，一般常用方法有4 h尿负荷试验、24 h尿液维生素B2排出量等方法，在本试验中利用24 h尿液维生素B2排出量测定12月龄伊犁马对维生素B2的需要量。以24 h尿液维生素B2排出量为评价指标，得到12月龄伊犁马对维生素B2的需要量为31.68 mg/(匹·d)。
3.3 伊犁马对维生素B1和维生素B2需要量的探讨在本试验条件下，以血浆维生素B1含量、E-TKA、TPP效应以及尿液维生素B1排出量和，综合评价得到12月龄伊犁马对维生素B1的需要量为48.27 mg/(匹·d)；以血浆维生素B2含量、E-GRAC以及尿液维生素B2排出量为评价指标，综合评价得到12月龄伊犁马对维生素B2的需要量为31.68 mg/(匹·d)。而NRC (2007)[31]标准中以成熟体重为400 kg计算，12月龄马匹对维生素B1的需要量为19.30 mg/(匹·d)，对维生素B2的需要量为12.80 mg/(匹·d)；以成熟体重为500 kg计算，12月龄马匹对维生素B1的需要量为24.10 mg/(匹·d)，对维生素B2的需要量为16.1 mg/(匹·d)，本试验结果比NRC (2007)标准需要量偏高。这可能与本试验马匹能量、蛋白质摄入量高有关。李丽花[13]研究发现，饲粮中糖类物质含量的增加显著提高动物对维生素B1的需要量。Ferraris等[32]研究发现，高糖、高蛋白质会增加机体对维生素B2的需要量。在本试验中，12月龄伊犁马粗蛋白质(CP)摄入量为970.0 g/d，无氮浸出物(NFE)为3 670 g/d、消化能(DE)摄入量为114.68 MJ/d，而NRC (2007)标准提供的成熟体重为400 kg的12月龄马匹对CP的需要量为677 g/d、DE为62.76 MJ/d，成熟体重为500 kg的12月龄马匹对CP的需要量为846 g/d、DE为78.66 MJ/d。本试验12月龄马匹摄入的是高能量、高蛋白质饲粮，提高了机体对维生素B1、维生素B2的需要量，这可能是导致本试验所得12月龄伊犁马维生素B1、维生素B2需要量高于NRC (2007)标准的主要原因。
4 结论在本试验条件下，以血浆维生素B1含量、E-TKA、TPP效应及尿液维生素B1排出量为评价指标，综合评价得到12月龄马对维生素B1的需要量为48.27 mg/(匹·d)；以血浆维生素B2含量、E-GRAC及尿液维生素B2排出量为评价指标，综合评价得到12月龄伊犁马对维生素B2的需要量为31.68 mg/(匹·d)。
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