水温是鱼类生长过程中的重要环境因子之一，水温与鱼类的生长和摄食密切相关，适宜的水温对于鱼类的行为、生理变化及生长发育等都具有重要的意义[1-5]。投喂水平作为养殖过程中的一个重要环节，同样影响着鱼类的消化吸收和生长发育。在自然条件下，由于季节变化、环境改变、种内竞争等方面的原因，鱼类获得食物的量十分不确定，经常因饥饿或摄食不足影响其正常的生长发育。而在养殖条件下，各种环境因素较为稳定，鱼类的生长受投喂水平的影响较大，投喂不当或投喂不及时可能导致鱼类摄食不足，从而影响其存活、生长和发育[6]。但是过量投喂同样不利于鱼类的生长[7]。目前，关于水温对水生动物影响的研究较多，但多数都是在恒温条件下进行的。而在自然界中，水生动物的生存水温是有周期性变化的，如昼夜变化、季节变化等。已有研究发现，实验室得到的某些水生动物的最适生长温度与野外的试验数据并不一致，可能与恒温条件下得到的结果同野外实际变温情况下存在差异有关[8]。为此，一些学者对周期性变温对水生生物生长的影响进行了相关方面的研究[9-14]。但在变温条件下不同投喂水平对鱼体相关酶活性影响方面还未见报道。
施氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt)是我国重要的大型名贵经济鱼类，具有个体大、生长快的特点，其卵制成的鱼子酱具有极高的经济价值[15]。本文以施氏鲟幼鱼为研究对象，在变温条件下研究了不同投喂水平对施氏鲟幼鱼消化酶、代谢酶及抗氧化酶活性的影响，旨在探讨水温变化对鲟科鱼类消化、代谢等酶学方面的影响机制，为施氏鲟工厂化养殖提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料施氏鲟幼鱼由中国水产科学研究院鲟鱼繁育中心提供。运回后在室内循环水族箱内暂养2周。暂养用水为曝气自来水，暂养期间饱食投喂鲟鱼商品鱼苗种配合饲料，每天换水1/3，水温为(21.0±0.5) ℃。
1.2 试验设计试验水温设恒温[(22.0±0.1) ℃]和变温[(22±2) ℃]2种模式，并根据投喂水平分为6组，分别为恒温100%饱食组(HW-100组)、变温100%饱食组(BW-100组)、变温90%饱食组(BW-90组)、变温80%饱食组(BW-80组)、变温70%饱食组(BW-70组)、变温60%饱食组(BW-60组)。变温投喂组的温度通过可编程智能温度控制仪进行控制，控制模式为：从06:00最低温度开始逐渐升温，到13:00上升到最高温度，13:00到18:00保持在最高温度；从18:00后开始逐渐降温，到次日01:00逐渐降到最低温度，从01:00到06:00保持最低温度，以24 h为单位进行循环。温控系统温度感应元件的灵敏度为0.1 ℃。
1.3 养殖管理暂养结束后，取健康且规格均匀的个体[平均体重为(34.9±0.8) g]转移至不同温度处理的水族箱中进行养殖试验，每组4个重复，每个重复15尾鱼。试验过程中，每天换水1/3以上，每天3次(08:00、13:00和17:00)投喂鲟鱼商品鱼苗种配合饲料(饲料基本成分见表 1)，投喂量按照各组设定的量进行计算。根据鱼体摄食情况，各组每7 d左右调整1次投喂量。养殖过程中定期清除残饵和粪便。整个试验期间溶解氧浓度>6.0 mg/L，光照周期12明(L) : 12暗(D)，pH 7.5±0.2。养殖周期为42 d。
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表 1 饲料基本成分(干物质基础) Table 1 Basic composition of the diet (DM basis) |
养殖试验结束后停食24 h，从每个重复中随机取鱼5尾，每组20尾。经过麻醉剂(MS-222)麻醉后，用注射器在鱼体臀鳍下方动脉抽血，血液注入离心管中后在4 ℃冷藏，静置分层后用10 000 r/min离心10 min至完全分层后取上层血清，置于-80 ℃冰箱保存待测。测定指标包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及总抗氧化能力(T-AOC)。以上指标均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定，具体方法参照试剂盒所附说明书。
1.5 消化酶活性测定将取完血的试验鱼在冰盘上迅速解剖，分别取胃、十二指肠和瓣肠，保存于-80 ℃冰箱备用。样品测定前在4 ℃冰箱中解冻，用预冷(0~4 ℃)的0.86%生理盐水洗涤，再用滤纸吸去表面水分，分别称重后用9倍质量比的预冷的0.86%生理盐水进行稀释，于冰水浴中用高速组织匀浆机匀浆，匀浆液经离心(4 ℃，3 500 r/min，10 min)后，将上清液分装后保存于-20 ℃，作为组织粗酶液用于测定消化酶活性。
蛋白酶活性采用福林-酚法测定，淀粉酶和脂肪酶活性均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定，具体方法参照试剂盒的说明书。组织蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。
1.6 统计分析应用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。对数据先进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，然后进行Duncan氏多重比较检验，试验结果采用平均值±标准差(mean±SD)表示，以P < 0.05作为差异显著性的标志。
2 结果 2.1 蛋白酶活性各组施氏鲟幼鱼的蛋白酶活性见表 2。变温条件下，在60%~80%范围内，随着投喂水平的降低，胃及瓣肠蛋白酶活性均显著升高(P < 0.05)。与HW-100组相比，BW-60组与BW-70组的胃蛋白酶及瓣肠蛋白酶活性显著升高(P < 0.05)，而各变温投喂组十二指肠蛋白酶活性与HW-100组相比差异均不显著(P>0.05)。
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表 2 各组施氏鲟幼鱼的蛋白酶活性 Table 2 Protease activity of juvenile Amur sturgeon in different groups |
各组施氏鲟幼鱼的淀粉酶活性见表 3。胃淀粉酶活性各组之间均没有显著差异(P>0.05)。变温条件下，十二指肠和瓣肠淀粉酶活性均随着投喂水平的降低呈先升高后下降的趋势。BW-80组十二指肠淀粉酶活性显著高于HW-100组及BW-100组(P < 0.05)，与其他组相比差异均不显著(P>0.05)。BW-80组和BW-90组瓣肠淀粉酶活性显著高于其他各组(P < 0.05)。
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表 3 各组施氏鲟幼鱼的淀粉酶活性 Table 3 Amylase activity of juvenile Amur sturgeon in different groups |
各组施氏鲟幼鱼的脂肪酶活性见表 4。胃和十二指肠脂肪酶活性各组之间均没有显著差异(P>0.05)。变温条件下，瓣肠脂肪酶活性随着投喂水平的降低表现出先上升后下降的趋势，所有变温投喂组瓣肠脂肪酶活性均显著低于HW-100组(P < 0.05)。
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表 4 各组施氏鲟幼鱼的脂肪酶活性 Table 4 Lipase activity of juvenile Amur sturgeon in different groups |
各组施氏鲟幼鱼的血清代谢酶活性和抗氧化指标见表 5。血清AST活性各组之间差异均不显著(P>0.05)。除BW-70组外，各变温投喂组血清ALT活性均显著高于HW-100组(P < 0.05)，而ALT活性在不同变温投喂组之间差异均不显著(P>0.05)。在变温条件下，当投喂水平降低至70%后，血清SOD活性显著降低(P < 0.05)。与HW-100组相比，BW-60组、BW-70组血清SOD活性显著降低(P < 0.05)，其他变温投喂组未产生显著变化(P>0.05)。在变温条件下，鱼体血清T-AOC和XOD活性均随着投喂水平的降低整体呈先下降后上升的趋势，且均在投喂水平为80%时降至最低值。与HW-100组相比，BW-60组、BW-70组及BW-100组血清T-AOC显著升高(P < 0.05)，且BW-60组和BW-90组血清XOD活性显著升高(P < 0.05)。
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表 5 各组施氏鲟幼鱼的血清代谢酶活性和抗氧化指标 Table 5 Serum metabolic enzyme activities and antioxidant indices of juvenile Amur sturgeon in different groups |
水温和投喂水平是影响鱼体生长发育的重要因素[16]。作为变温动物，鱼类的消化道温度与水温变化密切相关，环境温度变化直接影响鱼体的消化酶活性，其活性高低决定着鱼体对营养物质消化吸收的能力。关于水温对鲟鱼生长和消化酶活性等的研究[17-22]较多，但是在变温模式下对施氏鲟消化酶活性的研究还未见报道。在养殖条件下，投喂量不足会影响鱼类生长[23-24]，过量投喂则增加鱼体胃肠道负担，导致其消化和吸收的效率低下[25]，从而降低饲料的利用率[26]。本试验结果显示，变温条件下，施氏鲟幼鱼胃及瓣肠蛋白酶活性随着投喂水平的降低总体呈显著升高，表明在变温条件下，施氏鲟幼鱼通过增加蛋白酶活性的方式来补偿其对饲料蛋白质摄入的不足，通过该方式可提高鱼体对饲料蛋白质的消化效率。本研究中，在变温条件下，十二指肠和瓣肠淀粉酶活性以及瓣肠脂肪酶活性均随着投喂水平的降低呈先升高后下降的趋势，这表明，在变温条件下当饲料摄入不足时，施氏鲟幼鱼通过增加淀粉酶和脂肪酶活性的方式来补偿其对饲料淀粉和脂肪摄入不足的能力有限，当投喂水平降低至饱食量的70%时，鱼体对饲料中淀粉和脂肪消化的补偿能力显著降低。本试验结果显示，与恒温100%饱食组相比，变温100%饱食组施氏鲟幼鱼的瓣肠脂肪酶活性显著降低，而其瓣肠蛋白酶活性则显著升高，表明变温在一定程度上抑制施氏鲟幼鱼肠道脂肪酶活性的同时可促进肠道蛋白酶活性的升高。
AST和ALT作为氨基酸转氨酶，在鱼类的蛋白质合成和分解代谢过程中发挥着重要作用。在肝脏细胞蛋白质代谢过程中，ALT将丙氨酸的氨基转移给α-酮戊二酸，将α-酮戊二酸的羰基转移给丙氨酸，这样丙氨酸就成为丙酮酸，α-酮戊二酸就成为谷氨酸。本研究结果显示，与恒温100%饱食相比，各变温投喂水平均可提高鱼体血清ALT活性，由此推断一定幅度的变温条件可能促进施氏鲟幼鱼机体蛋白质的代谢作用。通常情况下，当鱼类机体内自由基增多时，机体为了抵御外源亲电基团的氧化，通常会增加抗氧化酶活性[22]，而SOD是防御生物体内活性氧或自由基伤害的最重要酶类[27]。有研究指出，SOD活性与生物体免疫水平密切相关[28-29]。本研究中，当投喂水平低于80%时，施氏鲟幼鱼血清SOD活性显著降低，表明在变温条件下当投喂水平不足时，施氏鲟幼鱼机体的免疫防御能力明显降低。T-AOC是反映机体抗氧化能力的综合指标。研究表明，鱼类抗氧化能力与水温之间具有较高的相关性[30]。本试验结果显示，与恒温100%饱食相比，变温条件下不同投喂水平施氏鲟幼鱼的血清T-AOC普遍增高，说明变温有助于提高施氏鲟幼鱼机体的抗氧化能力。在变温条件下，血清T-AOC随着投喂水平的降低整体呈先下降后上升的趋势，可能与摄入饲料不足引起饥饿胁迫后机体的反应程度有关。XOD是动物机体在受外界胁迫等非正常状态下机体产生自由基的主要催化酶[22]。本研究中，与恒温100%饱食组相比，变温70%、80%和100%饱食组的血清XOD活性均保持在较低水平，表明施氏鲟幼鱼在这3个投喂水平下受到的环境胁迫较小，不足以刺激其血清XOD活性升高。
4 结论①在周期性变温条件下，施氏鲟幼鱼可通过提高蛋白酶活性，即提高对饲料蛋白质消化效率的方式来补偿其对饲料蛋白质摄入的不足。
②与恒温100%饱食相比，变温条件下各投喂水平均可提高施氏鲟幼鱼血清ALT活性。
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