2. 广东省农业科学院动物科学研究所, 广州 510640;
3. 广东省动物育种与营养公共实验室, 广州 510640;
4. 广东省畜禽育种与营养研究重点实验室, 广州 510640
2. Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China;
3. Guangdong Public Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Guangzhou 510640, China;
4. Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Guangzhou 510640, China
黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)属鲶形目,鲿科,黄颡鱼属,其蛋白质含量高、营养丰富、味道鲜美,近年来养殖规模日渐扩大,对配合饲料的数量和质量要求均不断提高。饲料的氧化酸败是影响饲料品质和动物生长的重要因素。试验证明,黄颡鱼摄食被氧化的饲料后会降低机体生长性能和免疫抗氧化功能[1]。因此,通过提高黄颡鱼机体的抗氧化能力,降低饲料中氧化物质对其生长性能和抗氧化能力的影响,将对黄颡鱼的健康养殖产生积极的促进作用。
精氨酸作为鱼类的必需氨基酸,在生物体内参与多种代谢反应,如蛋白质、尿素和鸟氨酸的合成,谷氨酸和脯氨酸的代谢,肌酸和多胺的合成,胰岛素和胰高血糖的排泄等,对促进鱼类生长、增强鱼体免疫、提高抗应激能力有着重要的作用[2-4]。已有研究表明,饲料中添加精氨酸可以促进青石斑鱼(Epinephelus awoara)[5]、金鲳鱼(Trachinotus ovatus)[6]等鱼类的生长性能,增强斑点叉尾(Ictalurus punctatus)[7]、黄颡鱼[8]、条纹鲈鱼(Morone chrysops×Morone saxatilis)[9]等鱼类的抗氧化能力。本实验室前期研究亦表明,常规饲料中添加一定量的精氨酸可以促进黄颡鱼幼鱼的生长性能,提高抗氧化能力,其适宜添加量为2.74%~2.81%饲料[10]。然而,目前关于精氨酸对氧化鱼油所致鱼体损伤的干预作用尚未见报道。为进一步揭示精氨酸对黄颡鱼抗饲料氧化因子能力的影响,本试验以黄颡鱼幼鱼为研究对象,研究了饲料中添加氧化鱼油和精氨酸不同组合对其生长性能、体成分、血清生化指标和血清、肝脏抗氧化指标的影响,分析了氧化鱼油的抑制效果和精氨酸的干预作用,以便为精氨酸在黄颡鱼饲料中的合理利用提供进一步的理论依据。
1 材料与方法 1.1 氧化鱼油的制作氧化鱼油的制作参考殷永风等[11]的方法,并略作改进。将500 g新鲜鱼油装到1 L的大容量烧瓶中,在50 ℃恒温水浴的条件下连续充气氧化。每隔2 d取少量氧化鱼油测定过氧化值(POV),测定方法参照文献[12-13]。当氧化鱼油的POV达到预期值时停止充气,放置在-20 ℃的冰箱中保存备用。
1.2 试验饲料以鱼粉(粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量分别为73.7%、7.9%、13.1%)、豆粕(粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量分别为45.7%、2.6%、6.6%)、菜籽粕(粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量分别为32.4%、3.5%、6.3%)和玉米蛋白粉(粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量分别为62.0%、7.4%、2.0%)为主要蛋白质源,高筋面粉为主要糖源,豆油和鱼油为脂肪源,鱼油中新鲜鱼油:氧化鱼油(质量比)分别为2.5 : 0、1.5 : 1.0和0.5 : 2.0,配制3种试验饲料(FF、FO1、FO2)。在FF、FO1、FO2基础上分别添加0.48% L-精氨酸盐酸盐(纯度≥99%,购自宁波海德氨基酸工业有限公司),配制3种精氨酸饲料(FFA、FOA1、FOA2)。试验饲料组成及营养水平如表 1所示。饲料原料经粉碎后过60目筛,按配方准确称取,各种饲料成分逐级混匀后,分别添加相应的油脂,用混合机混合,混合均匀后,加适量水在搅拌机中搅拌均匀,用SLX-80型双螺杆挤压机(华南理工大学科技实业总厂生产)制成直径为1.5 mm条状,再由G-500型造粒机(华南理工大学科技实业总厂生产)制成颗粒饲料,55 ℃烘干,自然冷却后放入密封袋中,置于-20 ℃冰箱中保存备用。
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表 1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
采用出口动植物油脂POV检测方法(SN/T 0801.3-2011)测定6种饲料FF、FO1、FO2、FFA、FOA1、FOA2的POV,其结果分别为12.70、14.09、33.70、12.15、14.06、34.00 meq/kg。
1.3 试验鱼与饲养管理试验用黄颡鱼幼鱼购自广东省清远市黄沙渔业基地。试验开始前将黄颡鱼在室外水泥池中暂养2周,期间投喂商品饲料,每天2次。养殖试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室室内循环水养殖系统中进行,系统由直径80 cm、高70 cm的圆柱形玻璃纤维桶组成,容水量约为300 L。试验开始时,选取初始体均重为(4.41±0.05) g的黄颡鱼幼鱼600尾,随机分为6组,每组4个重复,每个重复25尾鱼,分别投喂6种试验饲料,标记为FF、FO1、FO2、FFA、FOA1和FOA2组。试验期间每天08:30和18:30各投喂1次,投喂量为体重的5%~6%,采用表观饱食投喂。养殖系统采取循环水过滤,养殖用水为曝气的自来水,进水速率为1.5 L/min,定时换水。试验期间自然光源,水温29.5~33.0 ℃,氨氮浓度 < 0.20 mg/L,亚硝酸盐浓度 < 0.01 mg/L,溶氧浓度>6.0 mg/L,pH 7.4~7.9。养殖试验为期56 d。
1.4 样品采集养殖试验结束后停食24 h,然后记录每桶鱼的总尾数,并称量每桶鱼的总重。从每个重复随机选取18尾鱼,放入120 mg/L的MS-222溶液中麻醉。其中3尾置于-20 ℃保存,用于测定全鱼常规营养成分;5尾测定体重、体长、内脏重、肝脏重和肠道重,用于计算生长性能指标和形态学指标;10尾用于尾静脉取血,室温静置4 h,4 000 r/min离心10 min制备血清,取上清液分装,置于-80 ℃冰箱保存,用于测定血清生化指标和抗氧化指标。
肝脏上清液的制备:称取一定质量的肝脏样品,加9倍体积的0.86%预冷生理盐水,在冰水浴中进行匀浆,3 000 r/min离心10 min,取上清液,于-20 ℃冰箱保存,用于测定肝脏抗氧化指标。
1.5 指标测定及分析 1.5.1 生长性能和形态学指标计算
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水分含量采用105 ℃烘箱烘干至恒重的方法(GB/T 6435-1986)测定,粗蛋白质含量利用半自动凯氏定氮仪采用凯氏定氮法(GB/T 6432-1994)测定,粗脂肪含量采用乙醚抽提的方法(GB/T 6433-1994)测定,粗灰分含量采用550 ℃灼烧至恒重的方法(GB/T 6438-1992)测定。
1.5.3 血清生化指标分析血清白蛋白、球蛋白、甘油三酯、胆固醇、葡萄糖、尿素氮含量和谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶活性由广州金域医学检验中心采用日立7600全自动生化分析仪测定。
1.5.4 抗氧化指标分析血清和肝脏上清液用试剂盒进行抗氧化指标测定,试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,具体测定方法参照试剂盒所附说明书。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用羟胺法测定,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性采用比色法测定,过氧化氢酶(CAT)活性采用可见光法测定,总抗氧化能力(T-AOC)采用比色法测定,丙二醛(MDA)含量采用2-硫代巴比妥酸(TBA)法测定。
1.6 数据统计试验数据用平均值±标准差(mean±SD,n=4)表示,采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),利用Duncan氏法分析比较各组之间的数据,当P < 0.05时,组间差异显著。采用SAS 9.0软件进行双因素方差分析(two-way ANOVA),差异显著性水平为P < 0.05。
2 结果 2.1 生长性能和形态学指标由表 2可知,各组黄颡鱼的存活率均为100.00%,未出现死亡情况。在FF、FO1、FO2组中,随着氧化鱼油添加量的增加,黄颡鱼的增重率、特定生长率和蛋白质沉积率均逐渐下降,且均在FO2组有最低值,与其他2组差异达到显著水平(P < 0.05);饲料系数和摄食率呈现相反变化,且在FO2组有最高值,与其他2组显著达显著水平(P < 0.05)。在FFA、FOA1、FOA2组中,黄颡鱼的增重率、特定生长率、蛋白质沉积率、饲料系数和摄食率没有显著性差异(P>0.05)。FOA1、FOA2组黄颡鱼的增重率与FO1、FO2相比分别升高3.0%和9.9%,饲料系数分别降低2.7%和7.4%,但差异未达显著水平(P>0.05)。经双因素方差分析,氧化鱼油对黄颡鱼增重率和摄食率的影响达到显著水平(P < 0.05),氧化鱼油和精氨酸对黄颡鱼特定生长率、蛋白质沉积率、饲料系数的影响存在交互作用(P < 0.05)。
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表 2 氧化鱼油和精氨酸对黄颡鱼生长性能的影响 Table 2 Influences of oxidized fish oil and Arg on growth performance of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) |
由表 3可知,6组黄颡鱼的肥满度没有显著差异(P>0.05)。FO2组脏体比显著低于FOA1组(P < 0.05),其他组间差异不显著(P>0.05)。FF组肝体比显著高于FO1组(P < 0.05),其他组间差异不显著(P>0.05)。FO2组肠体比与FFA和FOA2组相比显著降低(P < 0.05)。经双因素方差分析,精氨酸对黄颡鱼肠体比的影响达到极显著水平(P < 0.01),氧化鱼油和精氨酸对肝体比的影响存在交互作用(P < 0.05)。
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表 3 氧化鱼油和精氨酸对黄颡鱼形态学指标的影响 Table 3 Influences of oxidized fish oil and Arg on biometric parameters of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) |
由表 4可知,6组黄颡鱼全鱼干物质、粗蛋白质和粗灰分含量无显著差异(P>0.05),但FOA1组粗脂肪含量比FO1组显著降低(P < 0.05)。经双因素方差分析,精氨酸对全鱼粗脂肪含量的影响达到显著水平(P < 0.05)。
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表 4 氧化鱼油和精氨酸对黄颡鱼全鱼常规营养成分含量的影响(干物质基础) Table 4 Influences of oxidized fish oil and Arg on whole body unconventional nutritional contents of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) (DM basis) |
由表 5可知,6组黄颡鱼血清白蛋白、球蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素氮、葡萄糖含量和谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶活性均无显著差异(P>0.05)。
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表 5 氧化鱼油和精氨酸对黄颡鱼血清生化指标的影响 Table 5 Influences of oxidized fish oil and Arg on serum biochemical indexes of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) |
由表 6可知,在FF、FO1、FO2组中,随氧化鱼油添加量的增加,黄颡鱼血清SOD活性呈现下降趋势,GSH-Px活性和MDA含量呈现上升趋势,但均无显著差异(P>0.05);血清T-AOC逐渐降低,FO2组显著低于FF组(P < 0.05)。在含氧化鱼油饲料中添加精氨酸后,血清T-AOC分别升高77.0%(FOA1组vs.FO1组)和137.4%(FOA2组vs.FO2组),且后者达到显著水平(P < 0.05);血清MDA含量分别降低12.0%(FOA1组vs.FO1组)和17.4%(FOA2组vs.FO2组)。双因素方差分析结果显示,氧化鱼油和精氨酸对血清T-AOC的影响存在交互作用(P < 0.05),氧化鱼油对血清MDA含量的影响达到显著水平(P < 0.05)。
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表 6 氧化鱼油和精氨酸对黄颡鱼血清抗氧化指标的影响 Table 6 Influences of oxidized fish oil and Arg on serum antioxidant indexes of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) |
由表 7可知,6组黄颡鱼肝脏SOD、CAT活性,T-AOC和MDA含量均无显著差异(P>0.05),但在FF、FO1、FO2组中,随氧化鱼油添加量的增加,肝脏SOD活性和MDA含量呈现上升趋势。FO2、FOA1组肝脏GSH-Px活性显著高于FF、FO1和FOA2组(P < 0.05)。
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表 7 氧化鱼油和精氨酸对黄颡鱼肝脏抗氧化指标的影响 Table 7 Influences of oxidized fish oil and Arg on liver antioxidant indexes of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) |
本试验结果显示,饲料中添加一定量的氧化鱼油会降低黄颡鱼幼鱼的增重率、特定生长率和蛋白质沉积率,并升高饲料系数。刘伟等[14]发现,摄食氧化油脂的鲤鱼(Cyprinus carpio),其饲料转化率和增重率均下降。彭士明等[15]研究表明,饲料中添加氧化鱼油显著降低黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)的增重率、饲料效率和蛋白质效率。韩雨哲等[16]报道,花鲈(Lateolabrax maculatus)在摄食含氧化鱼油饲料后会减缓其生长。陈科全等[17]在饲料中添加氧化鱼油后发现会降低草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的生长速度、饲料效率和脂肪沉积率。薛继鹏[18]指出,瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)的特定生长率和肥满度均因饲料中添加氧化鱼油而呈现下降趋势。高淳仁等[19]研究表明,氧化鱼油会降低真鲷(Sea bream)幼鱼的增重率和存活率,并且其增重率与饲料的POV呈现一定的线性关系。上述学者的报道和本试验结果均表明,饲料中氧化鱼油对不同水产动物生长性能具有抑制作用。但是,陈拥军[20]在大口黑鲈(Micropterus salmoides)幼鱼的研究中发现,饲料中氧化鱼油的添加会促进大口黑鲈幼鱼的生长。出现这种差异的原因除了饲料的营养价值下降外,还可能与氧化产物引起的氧化胁迫压力抑制鱼体正常生长有关,再者不同鱼种可能对氧化油脂的耐受度不同。本试验结果显示,随着饲料中氧化鱼油添加量的增加,黄颡鱼饲料系数和摄食率逐渐升高,进一步说明氧化鱼油在不影响饲料适口性的基础上,其营养价值明显下降。已有研究报道,精氨酸可促进军曹鱼(Rachycentron canadum)[21]、斑点叉尾[22]、杂交条纹鲈(Moront saxatuis)[23]、印度鲶鱼(Silurus asotus)[24]、印度鲤鱼(Parupeneus indicus)[25]、黑鲷[26]、黄颡鱼[27]的生长,增强机体的抗氧化功能。本试验结果显示,在含1.00%和2.00%的氧化鱼油饲料中添加一定量的精氨酸,黄颡鱼增重率分别升高3.0%和9.9%,饲料系数分别下降2.7%和7.4%,并且经双因素方差分析,氧化鱼油与精氨酸对黄颡鱼特定生长率、蛋白质沉积率、饲料系数的影响存在交互作用,说明精氨酸能够缓解氧化鱼油对黄颡鱼生长性能的抑制作用。其原因可能在于精氨酸通过提高黄颡鱼机体内的抗氧化相关酶活性来缓解氧化鱼油对机体造成的氧化胁迫压力,或是通过对机体的内在调解来满足其本身的营养需求,其具体作用机理有待进一步研究。在本试验中,饲料中氧化鱼油与精氨酸对黄颡鱼肝体比的影响存在交互作用。该结果与任泽林等[28]在鲤鱼、黄凯等[29]在奥尼罗非鱼上的研究结果相反。其原因可能是不同鱼种对氧化油脂的耐受度有所不同,或是因为养殖周期的长短不同,使肝脏内氧化产物的积累量不同,导致肝脏细胞不同的发展趋势。已有研究发现,精氨酸参与调节机体多种生理生化过程,可以维护肠道形态,促进肠黏膜上皮细胞增殖,抑制肠黏膜上皮细胞凋亡[30]。Cheng等[9]在条纹鲈鱼上的研究结果显示,饲料中添加适量精氨酸能促进条纹鲈鱼生长激素和胰岛素的分泌。本试验通过双因素方差分析可知,饲料中精氨酸对黄颡鱼肠体比的影响达到极显著水平。其原因可能是饲料中适宜含量的精氨酸可加速肠黏膜上皮细胞增殖来提高肠道对饲料中营养物质的消化吸收,从而满足鱼体正常生长对营养物质的需求。
3.2 氧化鱼油对黄颡鱼全鱼常规营养成分含量的影响及精氨酸的干预作用本试验结果显示,随着饲料中氧化鱼油添加量的增加,黄颡鱼全鱼干物质、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量均呈现先上升后下降的趋势,但差异均未达到显著水平,但精氨酸对黄颡鱼全鱼粗脂肪含量具有显著影响。任泽林等[28]研究表明,在氧化产物剂量偏低时,鲤鱼机体通过增加全鱼粗脂肪含量来消弱其氧化稳定性;当氧化产物剂量过高时,全鱼粗脂肪含量下降的原因可能是肝脏等组织器官的脂肪酸合成代谢能力下降所致。本试验中,在氧化鱼油饲料中添加适量精氨酸,可能通过改变黄颡鱼全鱼粗脂肪含量来影响机体的氧化稳定性,其原因可能是精氨酸刺激某些酶类的分泌,从而调控脂肪酸合成和分解代谢途径。
3.3 氧化鱼油对黄颡鱼血清和肝脏抗氧化指标的影响及精氨酸的干预作用SOD、GSH-Px是生物体抗氧化防御系统重要的物质,可清除体内活性氧自由基,保护细胞膜及细胞内的核酸[31]。本试验结果显示,随着饲料中氧化鱼油添加量的增加,黄颡鱼血清SOD活性呈现下降趋势。该结果与唐筱等[32]及王珺[33]在大黄鱼(Pseudosciaena crocea R.)上的研究结果一致,但与Mourente等[34]在金头鲷(Sparus aurata L.)上的研究结果相反。其原因可能是不同鱼种对氧化油脂的耐受度有所不同。本试验结果显示,随着饲料中氧化鱼油添加量的增加,黄颡鱼血清GSH-Px活性呈现上升趋势。该结果与黄凯等[29]在奥尼罗非鱼上的研究结果相一致。其原因可能是氧化鱼油摄入体内后,会提高细胞中氧自由基等生物活性物质的含量,增加抗氧化酶反应底物浓度,进而提高GSH-Px活性。但是当氧化产物含量积累过高时,鱼体内的抗氧化相关酶类的平衡被打破,进而对机体造成毒副作用。T-AOC是用于衡量机体抗氧化系统功能的综合指标,其大小可以反映机体对外来刺激的代偿能力和机体自由基代谢的状态[31]。本试验结果显示,饲料中添加氧化鱼油可降低黄颡鱼血清T-AOC,并在FO2组达到显著水平,说明随着饲料中氧化物质含量的升高,黄颡鱼对外源氧化产物刺激的代偿能力和对机体自由基清除能力逐渐减弱。但在含氧化鱼油饲料中添加适量精氨酸后,黄颡鱼血清T-AOC分别升高77.0%(FOA1组vs.FO1组)和137.4%(FOA2组vs.FO2组)。这说明氧化鱼油饲料中添加适量精氨酸可提高黄颡鱼血清的抗氧化能力,从而缓解黄颡鱼对外源氧化产物刺激所造成的机体抗氧化能力下降。这与精氨酸减缓氧化鱼油对黄颡鱼生长性能的抑制效果相一致。MDA含量常常反映机体内脂质过氧化的程度,间接反映细胞受损伤程度[35-36]。本试验中,随着饲料中氧化鱼油添加量的增加,血清MDA含量呈现上升趋势。经双因素方差分析可知,氧化鱼油对黄颡鱼血清MDA含量的影响达到显著水平,该结果与彭士明等[31]在黑鲷上的研究结果一致,说明随着氧化产物的积累,黄颡鱼机体内脂质过氧化物质的积累量增多,原因可能是体内细胞膜受到损伤,失去选择透过性功能,导致细胞内液外流。该现象间接表明机体内细胞的损伤程度进一步加深。在含氧化鱼油饲料中添加适量精氨酸后,血清MDA含量分别降低12.0%(FOA1组vs.FO1组)和17.4%(FOA2组vs.FO2组)。这可能在于精氨酸通过减少机体内细胞的损伤,或是促进体内细胞增殖,从而替换受损细胞来改善氧化鱼油对机体细胞造成的毒副作用。
在黄颡鱼肝脏中,随着饲料中氧化鱼油添加量的增加,SOD、GSH-Px活性和MDA含量呈现上升趋势。该结果与黄凯等[29]在奥尼罗非鱼和韩雨哲等[16]在花鲈上的研究结果相一致。然而,任泽林等[37]报道,氧化鱼油会降低鲤鱼肝胰脏中SOD和CAT活性;陈拥军[20]则报道,氧化鱼油会降低黑鲈肝胰脏中GSH-Px活性。之所以会出现不同的结果,可能是因为饲料营养成分、养殖条件、试验周期和鱼油氧化程度不同及不同水产动物对油脂耐受能力不同所致。在本试验中,饲料中添加适量精氨酸后,黄颡鱼肝脏GSH-Px活性呈现先上升后下降趋势,但肝脏T-AOC没有出现与在血清中的相似变化规律,其原因和机理有待于进一步研究。
4 结论在饲料中添加一定量的氧化鱼油会抑制黄颡鱼的生长并降低血清的抗氧化能力,但添加一定量的精氨酸可以缓解氧化鱼油对黄颡鱼生长的抑制作用,并增强其机体的抗氧化能力。
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