茶多酚(tea polyphenols, TP)是从茶叶及其副产品中提取的天然抗氧化剂，是以α-苯基苯并吡喃为结构基础的类黄酮复合物，具有抗氧化、抗菌、抗病毒，改善畜禽生产性能和产品品质等功能。TP有极强的抗氧化活性，可提供氢离子(H+)与超氧阴离子自由基(·O2-)、羟自由基(·OH)、羧自由基(ROO·)和硝基自由基(·ONOO-)等自由基结合形成惰性化合物，终止自由基链式反应[1]；同时可螯合铁离子(Fe3+)以抑制芬顿(Fenton)反应中·OH的产生[2]。摄入多酚类物质能维持体内氧化-还原稳态，提高超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽还原酶(GR)等抗氧化酶活性，以抑制局部或全身性炎症反应，刺激核转录因子(Nrf2)活化，上调细胞内抗氧化酶表达水平[3]。研究表明，饲粮中添加TP可改善机体和禽蛋的抗氧化状态。玉米饲粮中添加120 mg/kg TP能显著提高肉鸭生长性能和血清抗氧化水平，其改善效果优于维生素E和二丁基羟基甲苯(BHT)[4]；100~200 mg/kg TP能延缓鸡蛋在储藏过程中哈夫单位的降低，降低蛋黄胆固醇和丙二醛(MDA)含量[5]；饲粮中含400 mg/kg白藜芦醇(又称芪三酚)能降低鹌鹑血清和蛋黄中硫代巴比妥酸反应物(TBARS)含量，提高血清维生素E浓度[6]。然而，TP在动物应用中的量效关系上缺乏系统性研究，其在蛋鸡饲粮中的推荐使用剂量及用量上限鲜见报道。因此，本试验旨在研究饲粮中不同水平TP对蛋鸡生产性能、蛋品质及血液、肝脏和蛋黄的抗氧化能力的影响，探讨TP在蛋鸡饲粮中的适宜添加剂量，为实际生产提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料TP由无锡太阳绿宝科技有限公司提供(纯度≥80%，批次号：505083)。采用《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》(GB/T 8313-2008)检测，TP含量为66.73%，儿茶素为37.25%。试验饲粮中TP以此实测结果为依据添加，逐级混合到配合饲料中。
1.2 试验动物与饲粮试验选用450只24周龄的健康海兰灰产蛋鸡，采用单因子完全随机设计，将试验鸡分为5个组，每组6个重复，每个重复15只鸡。试验包括预试期7 d、正试期56 d。在基础饲粮(表 2)中分别添加0、40、80、200和400 mg/kg的TP构成试验饲粮。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (as-fed basis) |
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表 2 TP对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of TP on performance of laying hens |
采用半开放式鸡舍3层立体笼养，自然光照加人工补光，光照时间16 h/d、光照强度16 lx，相对湿度50%~90%，自然通风结合纵向负压通风。饲喂干粉料，自由采食和饮水，每天布料、匀料、捡蛋、清粪各2次，每周消毒1次。常规防疫和管理。
1.4 指标测定与方法 1.4.1 样品采集与制备正试期，每天按重复记录产蛋数、称蛋重，计算平均蛋重和产蛋率。每2周以重复为单位计算平均日采食量和料蛋比。分别于正试期的第2、4、6和8周末，每重复采4枚蛋，测定蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋白高度、哈夫单位、蛋黄颜色和蛋形指数。
于正试期的第4和8周末，每组随机选取体重相近的蛋鸡，空腹无菌翅静脉采血，3 000 r/min离心10 min制备血浆，-20 ℃保存，待测血浆抗氧化指标。8周末，每组随机选取体重相近的蛋鸡，屠宰，摘取肝脏，液氮保存待用。
组织匀浆的制备：将肝脏用生理盐水冲洗，除去血液，滤纸吸干，称取约0.5 g，加9倍生理盐水，剪碎，置匀浆机中制成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液，-20 ℃保存待测，备检肝组织抗氧化指标。
1.4.2 测定方法蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋白高度、哈夫单位和蛋黄颜色采用以色列ORKA公司生产的系列鸡蛋品质测定仪测定；蛋形指数采用日本富士坪公司生产的蛋形指数测定仪测定，蛋黄和蛋壳重量采用万分之一天平测定；总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性采用黄嘌呤氧化酶法测定；MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定；GPx活性和总抗氧化能力(T-AOC)采用比色法测定。所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.5 数据处理试验数据以“平均值±标准差”表示。数据采用SPSS 19.0单因素方差分析(one-way ANOVA)程序进行方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较。TP添加水平的线性和二次线性效应采用正交多项式进行分析。以P < 0.05为差异显著性判断标准。
2 结果与分析 2.1 TP对蛋鸡生产性能的影响由表 2可知，与对照组相比，饲粮中添加TP未显著影响产蛋率和平均日采食量(P>0.05)。平均日采食量在试验后期(4~8周)和试验全期(1~8周)随TP添加水平升高呈二次曲线变化(P < 0.05)。与对照组相比，饲粮中添加TP对平均蛋重和料蛋比影响较为明显。试验前期(1~4周)，随着TP添加水平的升高，平均蛋重线性降低(P < 0.05)，400 mg/kg组平均蛋重显著低于对照组和40 mg/kg组(P < 0.05)；各组平均蛋重在试验后期及全期无显著差异(P>0.05)，但平均蛋重在试验后期随TP添加水平升高呈二次曲线趋势变化(P < 0.05)。试验前期，各组料蛋比无显著变化(P>0.05)；试验后期，料蛋比随TP添加水平升高呈二次曲线变化(P < 0.05)，其中200 mg/kg组料蛋比显著低于对照组(P < 0.05)，其他TP组与对照组无显著差异(P>0.05)。整个试验期，料蛋比随TP添加水平升高先降低后升高，200 mg/kg组料蛋比最佳。
2.2 TP对蛋品质的影响由表 3可知，第2、4、6、8周时，与对照组相比，TP对蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋白高度、哈夫单位和蛋黄颜色的影响均不显著(P>0.05)。试验第8周时，蛋壳强度随TP添加水平升高呈线性降低(P < 0.05)。
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表 3 TP对蛋品质的影响 Table 3 Effects of TP on egg quality |
由表 4可知，与对照组相比，TP组血浆MDA含量均降低(P＞0.05)，且第4和8周末，均以200 mg/kg组最低，但与其他组差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，TP可显著提高血浆T-SOD活性(P < 0.05)；第4周末，400 mg/kg组血浆T-SOD活性最高，与各TP组差异不显著(P>0.05)，但显著高于对照组(P < 0.05)；第8周末，血浆T-SOD活性随TP添加水平升高呈线性和二次曲线变化(P < 0.05)，且线性变化更为显著(P < 0.01)，其中以200 mg/kg组最高，除与400 mg/kg组差异不显著(P>0.05)外，均显著高于其他组(P < 0.05)。第4周末，与对照组相比，各TP组血浆T-AOC随TP添加水平升高而提高，但差异不显著(P＞0.05)；第8周末，各TP组血浆T-AOC随TP添加水平升高呈线性升高(P < 0.05)，其中以200 mg/kg组最高，除与80和400 mg/kg组差异不显著(P＞0.05)外，显著高于其他组(P < 0.05)。第4周末，各TP组血浆GPx活性均显著高于对照组(P < 0.05)；各TP组血浆GPx活性随TP添加水平升高线性升高(P < 0.05)，以400 mg/kg组最高，显著高于其他组(P < 0.05)；第8周，各TP组血浆GPx活性随TP添加量升高呈二次曲线变化(P < 0.05)，以200 mg/kg组最高，显著高于其他组(P < 0.05)。
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表 4 TP对蛋鸡血浆抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of TP on antioxidant indices in plasma of laying hens |
由表 5可知，与对照组相比，TP显著降低了肝脏MDA含量(P < 0.05)，其中200 mg/kg组最低，与400 mg/kg组差异不显著(P>0.05)，显著低于其他组(P < 0.05)；TP显著提高了肝脏T-SOD活性(P < 0.05)，其中200 mg/kg组最高，且显著高于其他组(P < 0.05)，80和400 mg/kg组显著高于对照组(P < 0.05)，但2组间差异不显著(P>0.05)；肝脏MDA含量和T-SOD活性随TP添加水平升高呈线性和二次曲线变化(P < 0.05)，且线性变化更为显著(P < 0.01)；200 mg/kg组肝脏T-AOC最高，与80和400 mg/kg组差异不显著(P>0.05)，但显著高于其他组(P < 0.05)。
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表 5 TP对蛋鸡肝脏抗氧化指标的影响 Table 5 Effects of TP on antioxidant indices in liver of laying hens |
由表 6可知，与对照组相比，各TP组蛋黄MDA含量均显著降低(P < 0.05)，其中400 mg/kg组最低，与80和200 mg/kg组差异不显著(P>0.05)；蛋黄T-SOD活性以400 mg/kg组最高，与80和200 mg/kg组差异不显著(P>0.05)，但显著高于其他组(P < 0.05)；蛋黄MDA含量和T-SOD活性随TP添加水平升高呈线性变化(P < 0.05)；各TP组蛋黄T-AOC显著提高(P < 0.05)，以200 mg/kg组最高，与其他TP组差异不显著(P>0.05)。
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表 6 TP对蛋黄抗氧化指标的影响 Table 6 Effects of TP on antioxidant indices in egg yolk |
本试验结果表明，TP影响平均蛋重和料蛋比，未影响产蛋率和平均日采食量。本试验中，400 mg/kg TP降低了试验前期的平均蛋重，与相关报道相近，如饲粮中添加0.67%茶叶提取物，略微降低平均蛋重[7]；1%绿茶粉可提高蛋重，而5%和10%绿茶粉显著降低了蛋重[8]。
料蛋比是蛋鸡生产上的重要指标之一。本试验中，与对照组相比，200 mg/kg TP组对蛋鸡试验前期料蛋比无显著影响，但显著降低了试验后期料蛋比，表明TP对降低料蛋比可能具有时间累积效应[9]。试验后期，400 mg/kg TP组料蛋比有升高趋势，表明较高剂量TP不利于蛋鸡生产。何柳青等[10]研究表明，200和400 mg/kg TP能显著降低料蛋比，100 mg/kg TP时蛋鸡生产性能最佳。饲粮中添加100 mg/kg TP料蛋比低于对照组，而150~200 mg/kg TP有降低产蛋率和升高料蛋比的趋势[5]，以上结果与本试验结果不相一致，可能因不同的TP样品，其实际含有的TP水平与宣称值不相一致，致实际饲粮TP剂量存在偏差(试验前期，已采购多种TP产品，进行TP及儿茶素含量测，实测值均与宣称值差异较大)。上述结果均提示，适宜TP水平有改善饲料效率的作用，较高TP影响饲料效率，降低了平均蛋重，可能的原因有：TP中含有的酚酸、咖啡碱及缩合单宁等抗营养因子，破坏或阻碍蛋鸡对营养物质的消化吸收；或儿茶素抑制了肠道对脂肪的吸收和脂肪合酶活性，蛋黄脂质形成受阻[7-8]，进而影响蛋重；多酚及其在肠道中代谢物能促进有益菌、抑制有害菌，选择性地调节肠道易感微生物的生长[11]，从而保证胃肠道微生物菌群健康，有利于营养物质的吸收与利用，改善饲料效率。高剂量TP影响生产性能，除与其含有抗营养因子等因素有关外，还可能由于TP属于黄酮类物质，具有植物雌激素活性，少量促进动物生长，过量可作为雌激素拮抗剂，影响动物生产性能[12]。
3.2 TP对蛋品质的影响本试验结果显示，TP未见显著影响蛋品质。有报道认为饲粮中添加0.5%绿茶提取物和1.5%绿茶粉对蛋品质无显著影响[13]；也有报道指出，5%和10%绿茶粉组蛋壳强度、蛋壳厚度和哈氏单位有降低的趋势，且10%组蛋壳厚度显著低于未添加组[8]；改善蛋品质报道指出，3%绿茶叶或0.15 L/kg绿茶提取物显著升高蛋壳厚度，蛋黄颜色随添加量升高而升高[14]；0.6%绿茶粉可显著提高鸡蛋贮存期开始、第5和10天的蛋白高度和哈氏单位[15]。以上研究结果与本试验结果不尽相同，可能与TP样品组成不同有关。
3.3 TP对蛋鸡抗氧化能力的影响生物体内，自由基作用于生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸，生成MDA、4-羟基壬烯酸等脂质氧化终产物。TP能清除体内自由基，抑制脂质过氧化，减少MDA，提高机体的抗氧化能力。SOD是机体内天然存在的·O2-清除因子，可将·O2-转化为过氧化氢，是生物体内重要的抗氧化酶。T-AOC是衡量抗氧化系统功能状况的综合性指标，可反映机体对外界刺激的代偿能力及机体自由基代谢的状态，主要由非特异性抗氧化物、生物金属螯合剂以及抗氧化酶类3类物质相互协同调节机体抗氧化系统。GPx是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，能催化过氧化氢和脂质过氧化物的还原。TP可再生和保护体内非特异性抗氧化物质维生素C和维生素E[16]，与金属离子络合，抑制以金属离子介导或催化的相关脂蛋白氧化和氧化酶的活性，上调细胞内SOD、CAT和GPx等抗氧化酶表达[17]，减免机体发生氧化损伤。本试验结果显示，与对照组相比，TP提高了蛋黄、肝脏和血浆中T-AOC、T-SOD活性，提高了血浆GPx活性，并降低了蛋黄和肝脏中MDA含量，且200和400 mg/kg组抗氧化效果较好。类似的报道也有很多，5~40 mg/kg TP可不同程度地降低蛋黄、肝脏及血浆中脂质过氧化物水平，但对肝脏的T-SOD活性影响不明显[18]；鹌鹑饲粮中添加200和400 mg/kg表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)可显著提高热应激条件下肝脏SOD活性，降低血浆和肝脏MDA含量[19-20]。
TP可提高蛋鸡正常或应激状态下机体的抗氧化能力，随着TP剂量增加，机体的抗氧化能力随之提高，但当TP超过一定剂量时，机体抗氧化能力不再升高，甚至会下降。本试验第8周时，200 mg/kg组血浆GPx活性显著高于400 mg/kg组以及其他试验组。前人研究表明，蛋鸡饲粮中添加橙皮素或柚皮素(类黄酮多酚物质)，血浆中SOD、CAT和GPx等抗氧化酶活性均在2%组最高，4%组下降[21]，提示TP或黄酮类物质与机体抗氧化水平存在最佳剂量效应，高剂量可影响机体抗氧化，酚类分子供H+或作为还原剂时，其分子本身也是较稳定的自由基，多酚与过渡金属离子的互作可使促氧化剂的产生，当体内酚类的氧化中间产物或氧化终产物(如半醌或醌类)浓度较高时，可作为促氧化剂损害机体健康[22-23]。
本试验第8周时血浆和肝脏中的T-SOD活性均以200 mg/kg TP组最高，蛋黄中T-SOD以400 mg/kg组最高；血浆和肝脏中MDA含量均以200 mg/kg组最低，蛋黄中MDA含量则以400 mg/kg组最低。可见，TP对蛋鸡血浆、肝脏和蛋黄抗氧化能力的改善效果不同。研究表明，大鼠连续口服0.6%茶多酚第28天，在食道、大肠、肾、膀胱和肺等器官中检出表没食子儿茶素(EGC)和表儿茶素(EC)，而其在肝、脾、心和甲状腺中含量较低，提示TP在体内代谢分布存在不均衡性[9]，这与本试验结果相一致。这可能是由于胃肠道中经过解聚或解离作用后的TP及其微生物代谢产物相继进行肝脏Ⅰ相与Ⅱ相代谢，后被血液循环系统运输到各组织器官以发挥生物学作用或经尿液排出体外[25]。代谢路径中，多酚及其代谢产物会因构象不断改变导致酚羟基数量及活性不断降低，使TP在不同器官部位的抗氧化活性不同[26]。综上，200、400 mg/kg TP组可显著提高蛋鸡机体抗氧化能力。
4 结论①饲粮添加400 mg/kg TP降低鸡蛋平均蛋重，200 mg/kg TP改善料蛋比；200和400 mg/kg TP可显著提高蛋鸡的抗氧化能力，但两者抗氧化效果无显著差异。饲粮中添加TP未显著影响鸡蛋品质。
②本试验条件下，添加200 mg/kg TP对蛋鸡生产性能及机体抗氧化效果最佳。
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