2. 河北农业大学生命科学学院, 保定 071001
2. College of Life Science, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China
微贮玉米秸秆是利用微生物菌剂对玉米、稻草等农业废弃物进行发酵处理，以期降低秸秆中纤维素、木质素的含量，提高微贮后秸秆的适口性，促进营养物质消化吸收。目前试验证实，经微贮后，秸秆中纤维素、半纤维素和木质素聚合物的酯键发生酶解反应，使其中的木质素[1]和纤维素的含量显著降低，并可提高饲料的消化率，进而促进动物的日增重，降低了料重比[2]。饲粮类型、组成、加工方式等在很大程度上影响瘤胃液pH、瘤胃内微生物区系的平衡[3]，进而影响挥发性脂肪酸(VFA)的生成量，最终影响饲粮的消化吸收利用率。瘤胃的酸度对维持瘤胃内环境相对恒定具有主导作用，瘤胃液pH可以综合反映瘤胃微生物状态、VFA产生、吸收、排出等的情况，而VFA是反刍动物瘤胃内消化吸收的重要指标，反刍动物机体所需75%左右的能量均由VFA提供[4]，同时它还能为瘤胃微生物的生长与繁殖提供一个较为理想的酸性环境，利于瘤胃微生物对饲料进行发酵[5]，从而影响瘤胃上皮吸收运转，最终影响动物的采食量[6]。微贮玉米秸秆不仅对秸秆中的木质素、纤维素有降解作用，同时也可以提高发酵后秸秆中粗蛋白质的含量，利用微贮玉米秸秆进行饲粮配制，可提高饲粮中粗饲料的添加比例，降低精饲料的添加比例。本试验通过研究微贮玉米秸秆对道寒杂交[无角道赛特羊(♂)×小尾寒羊(♀)]断奶羔羊瘤胃发酵及微生物区系的影响，旨在为微贮玉米秸秆促进营养物质消化吸收提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计选取80只体况良好、健康的平均体重为(24.62±3.59) kg的道寒杂交断奶羔羊，采用单因子完全随机试验设计将供试羊随机分成5组(表 1)，分栏饲养，每组16只。预试期为15 d，期间对试验羊的健康状况进行检查，并编号。正试期为60 d，每天分别在08：00和16：00饲喂，自由饮水，定期对羊舍进行清扫及消毒，保证羊舍干燥卫生。
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表 1 试验设计 Table 1 Experimental design |
微贮玉米秸秆制作：添加发酵菌剂(枯草芽孢杆菌N-8 :枯草芽孢杆菌N-10 :酵母菌=4 : 4 : 3，活菌数均为1.0×1010 CFU/g，每吨秸秆添加100 g)和硫酸铵(每吨秸秆添加3%)混合均匀后厌氧发酵30 d，启用。试验所用微贮玉米秸秆与青贮玉米秸秆的营养成分见表 2。
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表 2 青贮玉米秸秆与微贮玉米秸秆的营养成分(干物质基础) Table 2 Nutrient components of silage corn straw and microbial fermented corn straw (DM basis) |
参考NRC (2007)饲养标准制订全混合日粮(TMR)配方(表 3)。随着羊体重的增加，按日增重200 g左右进行饲喂量的调整，共3期，每期20 d。第1期每天每只羊干物质饲喂量为1.0 kg，第2期和第3期逐渐增加到1.1 kg左右，以保证羊只生长的需要。
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表 3 全混合日粮组成及营养水平(风干基础) Table 3 Composition and nutrient levels of TMR (air-dry basis) |
饲养试验结束当天，对照组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组饲喂时间分别为07:00、10:00、13:00、16:00、19:00，屠宰时间分别为11:00、14:00、17:00、20:00，屠宰后立即采集瘤胃液。每组选取5只进行屠宰，采用4层纱布过滤进行瘤胃液的采集，每只采集10 mL，采集后立即测定pH (pHS-3C pH测定仪)。
1.4.2 瘤胃液细菌计数将瘤胃液取5 mL放入冰盒中，带回实验室后取1 mL瘤胃液采用10倍梯度稀释法稀释至10-5、10-6、10-7 3个稀释度，涂布于营养琼脂(NA)培养基上，9 cm平板的接种量为100 μL，每个稀释度至少3个平行，37 ℃厌氧恒温培养48 h，选择菌落数为30~300的平板进行计数。
1.4.3 瘤胃液VFA含量的测定将瘤胃液经4层纱布过滤，滤液经7 500 r/min离心5 min，过微孔滤膜，参照Mkhize等[7]的方法利用气相色谱(Agilent MSD-5975C)-质谱仪(Agilent GC-7890A)直接进样分析瘤胃液中VFA的含量。采用自动进样器(Agilent 7683B Series)，毛细管柱(Agilent HP-INNOWA：30 m×0.250 mm×0.25 μm；火焰离子化检测器(FID)。
色谱条件：载气为氮气(N2)(144.58 kPa，总流量24 mL/min)；进样口温度250 ℃；质谱仪四极杆温度150 ℃；离子源温度230 ℃；采用程序升温，初始温度100 ℃，时间3 min，以5 ℃/min的速率升温至150 ℃，运行13 min，再以30 ℃/min的速率升温至210 ℃；进样量为1 μL。
1.4.4 瘤胃液中菌群丰度的测定取饲喂4 h后的瘤胃液，采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)手提法提取样品基因组总DNA。以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物GC-338F和518R (表 4)扩增样品16S rDNA高变区序列，为了在后续的变性梯度凝胶电泳(DGGE)中提高其分辨率，采用GC夹技术，即在其上游引物338F前加上GC重复序列。采用变性梯度为35%~55%、浓度为7%的聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲液中于150 V、60 ℃下电泳5 h。
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表 4 引物序列 Table 4 Primer sequences |
采用T-gradient PCR仪(Biometra，德国)进行PCR扩增，Gel-Doc2000凝胶成像仪(Bio-Rad，美国)进行成像。
PCR扩增体系(50 μL)为：10×PCR buffer 5 μL、dNTP (2.5 mmol/L)3.2 μL、rTaq (5 U/μL)0.4 μL、GC-338F (20 μmol/L)1 μL、518R (20 μmol/L)1 μL、模板DNA 50 ng，补双蒸水(ddH2O)至50 μL。
PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最终72 ℃延伸10 min。
PCR产物采用OMEGA公司的DNA Gel Extraction Kit纯化回收。测序结果采用DNAstar和Cluster软件进行序列分析，下载最相似的菌株序列作为系统发育树的参考序列，然后采用MEGA5.0软件利用邻接(neighbor-joining)法构建系统发育树，自展数(bootstrap)为1 000。
1.5 数据分析与统计试验数据采用Excel 2013软件进行整理，利用SPSS 17.0进行统计分析，通过单因素方差分析进行显著性检验，试验结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。P < 0.01为差异极显著，P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 微贮玉米秸秆对瘤胃发酵的影响 2.1.1 微贮玉米秸秆对瘤胃液pH和总菌数的影响由表 5可知，添加微贮玉米秸秆后，饲喂4 h后的瘤胃液pH除Ⅰ组有所下降外，其他试验组均呈上升趋势，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别较对照组提高了1.39%(P>0.05)、4.16%(P < 0.05)、7.45%(P < 0.01)，同时Ⅳ组还极显著高于Ⅰ组、Ⅱ组(P < 0.05)，但与Ⅲ组无显著差异(P>0.05)。各微贮玉米秸秆添加组瘤胃液总菌数均高于对照组，其中Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组与对照组相比分别增加了20.69%(P < 0.01)、17.24%(P>0.05)、34.48%(P < 0.01)、10.34%(P>0.05)。
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表 5 微贮玉米秸秆对瘤胃液pH和总菌数的影响 Table 5 Effects of microbial fermented corn straw on pH and total bacteria count in ruminal fluid |
由表 6可知，饲粮中添加不同量的微贮玉米秸秆后瘤胃液乙酸含量有不同程度下降，与对照组相比，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别下降了10.56%(P < 0.01)、2.81%(P>0.05)、7.83%(P < 0.01)、15.03%(P < 0.01)。与对照组相比，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组瘤胃液丙酸含量分别提高了0.59%(P>0.05)、2.01%(P>0.05)、4.73%(P>0.05)，但Ⅳ组则出现极显著降低(P < 0.01)。饲粮中添加不同量的微贮玉米秸秆后瘤胃液丁酸、异丁酸、戊酸含量表现为显著或极显著升高(P < 0.05或P < 0.01)，己酸含量表现为显著或极显著降低(P < 0.05或P < 0.01)。与对照组相比，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组瘤胃液总VFA含量分别升高了0.93%(P>0.05)、4.18%(P>0.05)、5.19%(P < 0.05)，Ⅳ组接近对照组，差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，第Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组瘤胃液乙酸/丙酸分别下降了12.44%(P < 0.05)、4.93%(P>0.05)、12.21%(P < 0.05)、9.86%(P < 0.05)。
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表 6 微贮玉米秸秆对瘤胃液VFA含量的影响 Table 6 Effects of microbial fermented corn straw on VFA contents in ruminal fluid |
DGGE图谱中所有样品均产生了清晰、丰富的条带，说明瘤胃液中微生物的菌种丰度均较高，同时也可看到不同组别的条带在数目和颜色深浅上有所差异，说明不同组瘤胃液中细菌种类和数量存在差异。DGGE图谱聚类分析表明，玉米秸秆微贮可以影响瘤胃的微生物区系。由图 1可知，5组样品聚成两大簇，其中对照组、Ⅰ组、Ⅱ组聚为一簇，Ⅲ组、Ⅳ组聚为一簇。由戴斯系数比较PCR-DGGE图谱的相似性可知，Ⅰ组、Ⅱ组之间的相似值大于0.61，说明这2个组之间瘤胃菌群的相似性较高；Ⅲ组与除对照组外的其他组之间的相似值均小于0.40，表明此组与其他3组的相似性较低。由此可见，随着玉米秸秆微贮添加量的增加，瘤胃内菌群的相似性逐渐降低。
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图 1 各组瘤胃液中菌群的聚类分析 Figure 1 Cluster analysis of microflora in ruminal fluid among groups |
按不同组中条带亮度的不同，选取16条DGGE凝胶条带(图 2中标注的16条条带)回收后，以GC-338F和518R为引物进行PCR扩增，获得目的DNA片段。PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆测序。测序结果与GenBank中的序列进行比对，得到条带所代表的细菌类型。每个回收条带选取3个克隆进行序列测定，序列比对分析结果见表 7。结果表明，切胶回收条带所代表的细菌与现有数据库中的细菌有很高的同源性，大部分在90%以上，有的同源性甚至达到了100%。
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图 2 DGGE电泳图 Figure 2 Electrophoretogram of DGGE |
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表 7 序列比对分析结果 Table 7 Results of sequence variation analysis |
由序列比对分析结果可知，条带1和8已鉴定与原虫相似性为99%。由DGGE图谱可知，随着微贮玉米秸秆添加量的增加，条带1和8的亮度先逐渐减弱后增强，均在添加量为100%时最亮；图谱上条带2、6、7已鉴定与拟杆菌门中的拟杆菌相似性在90%以上，在Ⅲ组中条带6、7亮度有增强的趋势；条带3、4与瘤胃普氏菌相似性为98%，是瘤胃中重要的纤维降解菌，随着微贮玉米秸秆添加量的增加，条带亮度逐渐增强；条带5、9、11已鉴定与不可培养瘤胃细菌类群相似，相似性达到99%，鉴定为不可培养瘤胃细菌，随着微贮玉米秸秆添加量的增加，条带5的亮度在Ⅲ组、Ⅳ组高于其他组，而条带9、11的亮度则是逐渐增强；条带10、16已鉴定为与变形杆菌门中的变形菌门类群的相似度为90%，随着微贮玉米秸秆添加量的增加，其亮度逐渐减弱；条带14、15与厚壁菌门类群的相似度分别为99%和98%，鉴定为反刍月形单胞菌，随着微贮玉米秸秆添加量的增加，其亮度逐渐增强；条带15鉴定为不可培养毛螺旋菌，随着微贮玉米秸秆添加量的增加，其亮度呈下降趋势，以对照组最亮。
采用MEGA5.0软件，邻接法构建系统发育树(图 3)，自展数为1 000，其中条带1和8的相似类群属于原虫，不参加构建系统发育树。
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图 3 系统发育树 Figure 3 Phylogenetic tree |
瘤胃发酵水平直接影响营养物质的利用率。瘤胃内环境的稳定主要体现在瘤胃液pH上，而pH的变动与饲粮的类型和采食后的时间密切相关[3]。当粗饲料占饲粮比例由2/3降低至1/4时，瘤胃液pH在饲喂4 h后由6.2下降至5.9，这可能是精料含量过多，瘤胃微生物快速降解碳水化合物，导致pH降低[8]；反之，饲粮中粗纤维的含量越高，瘤胃液pH越高，高的pH利于瘤胃纤维素降解菌的增殖。据报道，纤维素分解菌(如琥珀酸生成菌、白瘤胃球菌、黄瘤胃球菌等)对酸的耐受性较差，其最适pH为6.0~7.0，当瘤胃液pH下降至6.0时则抑制纤维素菌的生长[9-10]。本试验结果表明，在精粗比为1 : 2的条件下，通过添加微贮玉米秸秆配制TMR，在饲喂4 h后，随着微贮玉米秸秆添加量的增加，瘤胃液pH先下降后逐渐上升，其中添加75%和100%微贮玉米秸秆的组的瘤胃液pH分别为6.01和6.20，与对照组相比分别提高了4.16%和7.45%，差异显著或极显著。这可能是由于微贮玉米秸秆中含有可降解秸秆中纤维素和木质素的芽孢菌(枯草芽孢杆菌和酵母菌活菌)，饲喂4 h后，瘤胃微生物发酵产生VFA，导致瘤胃液pH降低，但是随着微贮玉米秸秆添加量的增加，瘤胃液pH有明显的升高，表明适量微贮玉米秸秆的添加有助于提高瘤胃的发酵水平，且微贮玉米秸秆中含有数量很高的活性芽孢菌，可短时间提高瘤胃内降解纤维素菌的数量，这与冯伟业[11]的报道一致。
纤维素菌数量增多，饲粮在瘤胃内发酵产生的VFA含量增加，表明微生物发酵能力增强。VFA是瘤胃中碳水化合物发酵的主要产物，主要包含乙酸、丙酸、丁酸等。乙酸主要用于氧化供能，丙酸则被肝脏转变为体组织成分，用于生长、繁殖，另外丙酸产量与甲烷的产生量之间呈负相关，因此，丙酸含量上升可以减少生成甲烷的能量损失[12]。VFA含量的变化与饲粮中粗饲料比例密切相关。当饲粮中粗饲料比例由30%提高至50%时，总VFA合成量增加，其中乙酸和丁酸产量下降，丙酸产量则上升[13-15]。从由不同精粗比(3 : 7、4 : 6、5 : 5)试验中得知，在饲喂0~4 h阶段，随着粗饲料比例的增加，乙酸含量呈下降趋势，而丙酸浓度呈上升趋势[16]。本试验采集饲喂4 h后的瘤胃液，随着微贮玉米秸秆添加量的增加，乙酸含量下降趋势增大，丙酸含量升高趋势降低，与对照组相比，添加75%微贮玉米秸秆的组瘤胃液乙酸含量降低了7.83%，丙酸含量增加了4.73%，总VFA含量增加了5.19%，乙酸/丙酸降低了12.21%，促进了营养物质的消化吸收。
瘤胃发酵水平的调节最终依靠的是瘤胃内强大的菌群，瘤胃内的细菌可帮助反刍动物消化纤维素和合成大量菌体蛋白。其中纤维的分解主要依靠真菌的强穿透能力和细菌的发酵特性，使植物纤维组织的内部张力先降低、组织变得疏松，细菌再进一步降解发酵[17]。粗饲料显著影响瘤胃微生物区系，粗饲料比例的升高可显著促进瘤胃内蛋白降解细菌、纤维素降解菌、乳酸菌等的增殖，降低瘤胃原虫的数量[18]。参照文献[19]，本试验利用DGGE技术对瘤胃液中菌群丰度进行了测定，试验所得DGGE图谱中各组样品均产生了清晰、丰富的条带，说明瘤胃液中各菌种丰度都较高，同时不同组间瘤胃液中细菌的种类和数量存在差异。由本试验结果可知，由于原虫为低等生物，用细菌引物也能扩增出来，瘤胃原虫对于细菌的吞食可导致氮在瘤胃中的无效循环，而原虫与甲烷菌关系密切，原虫数量降低促进甲烷菌的增殖[20]，进而降低能量的损耗，降低瘤胃原虫数量可促进营养物质的消化吸收利用率。随着微贮玉米秸秆添加量的增加，原虫数量先出现下降的趋势，以微贮玉米秸秆添加量为75%时条带亮度最低，但是在添加量为100%时原虫数量又出现增加，表明用微贮秸秆完全替代青贮玉米秸秆不利于瘤胃的发酵。瘤胃普氏菌是瘤胃重要的木质素降解菌，属拟杆菌门，其在进化树上形成了很大的簇，随着微贮玉米秸秆添加量的增加，瘤胃内瘤胃普氏菌和拟杆菌数量增加，表明木质素降解能力增强。此外，厚壁菌门类群中的反刍月形单胞菌是瘤胃内一种主要的乳酸发酵菌，占瘤胃细菌总数的50%以上，可对瘤胃内淀粉进行分解，微贮玉米秸秆添加量为75%和100%时瘤胃液中反刍月行单胞菌数量增多，可加快瘤胃内淀粉的降解。随着微贮玉米秸秆添加量的增加，DGGE图谱中变形菌门和不可培养毛螺旋菌条带的亮度逐渐降低，表明在饲喂4 h后蛋白质的降解速度减慢。由此可以看出，微贮玉米秸秆替代适量青贮玉米秸秆影响了瘤胃微生物区系，可促进木质素和纤维素、淀粉降解菌的增殖，降低蛋白质降解菌的增殖，加快碳水化合物的降解，促进营养物质的消化吸收。
4 结论①以微贮玉米秸秆替代75%青贮玉米秸秆配制TMR，在饲喂4 h后道寒杂交断奶羔羊瘤胃液pH即可达到6.01，利于瘤胃液纤维降解菌的增殖，同时降低蛋白质降解菌的数量。
②以微贮玉米秸秆替代75%青贮玉米秸秆配制TMR饲喂道寒杂交断奶羔羊，可促进瘤胃内总VFA的合成，利于营养物质的消化吸收。
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