2. 动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室, 武汉 430064
, SHEN Jie1,2
, WEI Jintao1, ZHANG Wei1, CHEN Fang1, YANG Xuehai1, GUO Wanzheng1, DU Jinping1, HUANG Shaowen1
2. Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding, Wuhan 430064, China
饲粮中添加益生菌制剂能有效调节胃肠道的微生态环境，有益于菌群平衡，可以提高畜禽生长性能和防治疾病[1]。益生菌制剂的无耐药性和无残留等优点是抗生素所无法比拟的。优良的益生菌制剂要具备菌种非病原性和无毒性，耐胃酸、耐胆盐、耐高温高压等高抗逆性，肠道上皮细胞吸附性，生长繁殖速度快，能产生抑菌物质以及耐储存等特征。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)因为具有以上优势[2-6]，近年来，在猪、鸡等动物饲料中的应用逐步得到重视[7-10]。
凝结芽孢杆菌是产乳酸芽孢杆菌，属于硬壁菌门肠道乳酸菌[11]；菌体发酵方式为同型发酵，具有较广的抗菌谱，具有提高机体细胞免疫和体液免疫水平的作用[12]，能刺激动物免疫器官的发育，提高动物的抗病能力；可产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及木聚糖酶等活性物质[13]，促进营养物质的消化吸收；产生的维生素、短链脂肪酸、氨基酸、有机酸、促生长因子等可供动物机体提供营养[14-15]，还可促进小肠的蠕动，改善肠道消化功能，为动物的生长发育提供有利条件[16]。凝结芽孢杆菌在不同形态饲料中都比较稳定，在饲料工业中应用价值较高。目前，凝结芽孢杆菌对肉鸡肠道微生物影响的研究较少。因此，本试验旨在研究饲粮中添加凝结芽孢杆菌对肉鸡生长性能、免疫器官指数、血清生化指标及肠道菌群的影响，为凝结芽孢杆菌在肉鸡生产中的科学应用提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料凝结芽孢杆菌制剂：有效活菌数量为1.0×109 CFU/g，由湖北绿天地生物科技有限公司提供。
试验动物为健康的1日龄AV500肉鸡10 000只，试验在襄阳盛锋农牧有限公司养殖场进行。
1.2 试验设计及分组将健康的1日龄10 000只AV500肉鸡随机分成2组，每组5个重复，每个重复1 000只鸡。对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂基础饲粮+300 mg/kg凝结芽孢杆菌制剂。基础饲粮参照NRC (1994)肉鸡饲养标准并结合实际生产情况进行配制，基础饲粮组成及营养水平见表 1。试验分为1~21日龄和22~42日龄2个阶段进行。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
鸡舍采用红外灯加温，第1~2天室温为34 ℃，第3~7天室温为32 ℃，第8~14天室温为30 ℃，第15~20天室温为27 ℃，此后调节鸡舍室温为22 ℃；相对湿度第1~7天保持为70%，第8~20天保持为60%，此后保持为55%左右。光照强度30 lx。试验期间动物采用网上平养，自由饮水、自由采食，每天除粪1次。按照常规程序进行消毒、免疫。
1.4 样品采集与检测 1.4.1 样品采集试验进行到第21天和第42天，鸡只禁食12 h后，每个重复分别随机抽取试验鸡20只称重，颈静脉放血处死后脱毛；剥离脾脏、胸腺、法氏囊、肠道等器官并称重。将接有颈静脉血的离心管静止10 min后3 000 r/min离心，取血清放于4 ℃冰箱待测血清生化指标。在无菌状态下取盲肠、回肠内容物迅速放于灭菌冻存管中，液氮罐中保存用于检测肠道菌群数量。
1.4.2 试验仪器AUY220型电子分析天平、日本岛津UV2550型紫外-可见分光光度计、德国福斯FOSS2300型全自动凯氏定氮仪、罗氏MODULP800全自动生化分析仪、EDC-810 PCR扩增仪、JY300水平电泳仪、JY02S紫外分析仪。
1.4.3 生长性能及免疫器官指数的测定试验当天及试验结束时以重复为单位称量仔鸡始重、末重(称重前12 h禁食，自由饮水)，每天记录喂料量、淘汰及病死鸡只情况，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。
免疫器官指数：由器官重量与体重相除所得即为免疫器官指数，包括脾脏指数、胸腺指数、法氏囊指数、肠道指数。
1.4.4 血清生化指标的测定血清生化指标采用罗氏MODULP800全自动生化分析仪测定。
1.4.5 肠道微生物数量的测定采用实时荧光定量PCR方法检测肠道内容物中的凝结芽孢杆菌和大肠杆菌数量。引物序列及参数见表 2，引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照北京天根基因组DNA提取试剂盒说明书提取肠内容物DNA，通过将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶进行回收，纯化分别获得肠球菌和大肠杆菌的标准品，然后将细菌的标准品进行实时荧光定量PCR反应，以不同标准品的拷贝数的对数值为横坐标，以实时荧光定量PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数(Ct)为纵坐标，绘制标准曲线。同时，将待测样品进行实时荧光定量PCR反应得到样品的Ct值，并将其和标准曲线进行比较，获得各个样品中细菌数量。
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表 2 引物序列及参数 Table 2 Primer sequences and parameters |
运用SPSS 16.0软件对数据进行处理，并进行t检验。数据结果以“平均值±标准误”表示。
2 结果 2.1 凝结芽孢杆菌对肉鸡生长性能的影响凝结芽孢杆菌对肉鸡生长性能的影响见表 3。1~21日龄、22~42日龄试验组肉鸡的死淘率均显著低于对照组(P < 0.05)，分别下降了61.7%和52.42%；1~21日龄对照组和试验组之间肉鸡的平均日增重、平均日采食量差异不显著(P>0.05)。22~42日龄，试验组肉鸡的平均日增重、平均日采食量均显著高于对照组(P < 0.05)。但是整个试验期间，试验组和对照组之间肉鸡的料重比差异不显著(P>0.05)。
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表 3 凝结芽孢杆菌对肉鸡生长性能的影响 Table 3 Effects of Bacillus coagulans on growth performance of broilers |
凝结芽孢杆菌对肉鸡免疫器官指数的影响见表 4。21日龄，试验组肉鸡的脾脏指数、胸腺指数、法氏囊指数均显著高于对照组(P < 0.05)，而肠道指数却显著低于对照组(P < 0.05)。42日龄，试验组肉鸡的脾脏指数、胸腺指数均显著高于对照组(P < 0.05)，但是法氏囊指数、肠道指数与对照组差异均不显著(P>0.05)。
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表 4 凝结芽孢杆菌对肉鸡免疫器官指数的影响 Table 4 Effects of Bacillus coagulans on immune organ indexes of broilers |
凝结芽孢杆菌对肉鸡血清生化指标的影响见表 5。21、42日龄，试验组肉鸡血清中的丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(P < 0.05)，试验组肉鸡血清中的总蛋白、球蛋白含量均显著高于对照组(P < 0.05)，但试验组和对照组之间肉鸡血清中的天门冬氨酸氨基转移酶活性及白蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量均差异不显著(P>0.05)。
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表 5 凝结芽孢杆菌对肉鸡血清生化指标的影响 Table 5 Effects of Bacillus coagulans on serum biochemical indexes of broilers |
凝结芽孢杆菌对肉鸡肠道微生物数量的影响见表 6。21、42日龄，试验组肉鸡盲肠、回肠食糜中凝结芽孢杆菌数量显著高于对照组(P < 0.05)，大肠杆菌数量显著低于对照组(P < 0.05)。随着食糜沿肠段推移，对照组和试验组42日龄盲肠中的大肠杆菌数量明显低于回肠。
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表 6 凝结芽孢杆菌对肉鸡肠道微生物数量的影响 Table 6 Effects of Bacillus coagulans on intestinal microflora numbers of broilers |
大量研究证明，饲粮添加益生菌可以提高动物的生长性能和饲料转化率[17-19]。研究表明，肉鸡饲粮中添加凝结芽孢杆菌可以提高肉鸡饲料转化率[20-22]。本研究也发现，22~42日龄期间，饲粮中添加凝结芽孢杆菌组肉鸡的平均日增重、平均日采食量均显著高于对照组。凝结芽孢杆菌能提高动物的增重和饲料转化率，可能是由于凝结芽孢杆菌在动物消化道内直接产生营养物质，如维生素、氨基酸、促生长因子等来增加小肠蠕动的速度，改善消化道消化功能，从而促进机体对饲料中各种营养成分的消化和吸收[14]。
3.2 凝结芽孢杆菌对肉鸡免疫器官指数的影响胸腺、法氏囊和脾脏是禽类最重要的免疫器官，参与全身的细胞免疫和体液免疫[23]，其重量可用来评价雏鸡的免疫状况[24]。本研究发现，21日龄试验组肉鸡的脾脏指数、胸腺指数、法氏囊指数均显著高于对照组，42日龄试验组肉鸡的脾脏指数、胸腺指数均显著高于对照组。胸腺、法氏囊、脾脏的相对重量增加，说明机体的免疫机能增强[25-26]。有报道表明，雏鸡法氏囊萎缩则雏鸡不能产生抗体，如果法氏囊发达，则有利于抗体水平的提高[27]。另外，本研究结果表明，21日龄试验组肉鸡肠道指数显著低于对照组，说明肉鸡将更多的能量用于肌肉组织而不是肠道生长，从而表现为肠道指数的差异；42日龄对照组和试验组间法氏囊指数、肠道指数差异均不显著，可能是由于鸡只体重增大，生长后期法氏囊萎缩，从而使器官指数差异显著性降低。
免疫器官的发育差异可能是因为有益菌在肠道内大量繁殖，并不断合成有益物质，作为抗原物质刺激并促进免疫器官的生长发育[28]。赵树平等[29]也认为凝结芽孢杆菌在消化道的识别抗原部位可发挥免疫佐剂的功能，可以活化免疫系统，调节免疫。罗毅等[30]认为凝结芽孢杆菌可增强动物腹腔单核-巨噬细胞吞噬和分泌功能以及活化淋巴细胞，强化动物体内体液和细胞免疫水平提高，增强整体免疫能力。
微生态制剂对机体的免疫器官的促进作用导致动物机体的健康状况差别，生产上直接表现为死淘率的不同，本研究中1~21日龄、22~42日龄饲粮中添加凝结芽孢杆菌后肉鸡死淘率均显著低于对照组。这说明凝结芽胞杆菌对肉鸡的生长特性及机体免疫功能具有比较显著的影响。
3.3 凝结芽孢杆菌对肉鸡血清生化指标的影响凝结芽胞杆菌对肉鸡血清生化指标的影响也不尽相同。一定范围内的血清丙氨酸氨基转移酶活性反映出肝细胞代谢的活跃程度，本研究中试验组肉鸡血清中的丙氨酸氨基转移酶活性显著高于对照组，说明凝结芽孢杆菌对肝脏的生理功能有促进作用。血清中的碱性磷酸酶主要来自肝脏和骨骼，可以反映肝脏和骨骼生理状况[31]。碱性磷酸酶是小肠消化吸收功能发生变化的标志酶[32]，能防御致病菌脂多糖对肠道黏膜的损害[33]。试验组肉鸡血清碱性磷酸酶活性显著高于对照组，林丽花等[34]曾报道凝结芽孢杆菌显著或极显著提高了28、70日龄黄羽肉鸡血清碱性磷酸酶活性；本研究中试验组肉鸡血清中的总蛋白、球蛋白含量均显著高于对照组，血清总蛋白主要由血清球蛋白和血清白蛋白构成，血清总蛋白含量高，说明动物营养状况良好[35]。血清中的高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量反映胆固醇的合成与饲粮中脂类的吸收情况。甘油三酯是动物机体用于贮存能量的主要形式，可以反映体内脂类代谢状况[36]。本研究发现，1~42日龄期间各组间血清甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量差异不显著。这与张维娜等[37]在异育银鲫中的试验结果一致，说明饲粮中添加凝结芽孢杆菌对动物机体脂肪代谢没有产生明显的影响。
3.4 凝结芽孢杆菌对肉鸡肠道微生物数量的影响凝结芽孢杆菌对动物肠道菌群的影响也得到广泛重视。在饲粮中添加凝结芽孢杆菌可降低有害菌的数量，通过改变肠道微生态体系来改善肠道消化吸收功能[20, 39]。本研究通过使用实时荧光定量PCR的方法，对试验鸡只盲肠和回肠食糜中的凝结芽孢杆菌、大肠杆菌数量进行定量分析。与对照组相比，试验组鸡只盲肠、回肠食糜中凝结芽孢杆菌数量增加，大肠杆菌数量下降。本研究说明凝结芽孢杆菌在肉鸡肠道内定植，通过竞争排斥作用而减少大肠杆菌在肠道中的数量成为优势菌群，稳定发挥益生作用。
凝结芽孢杆菌为兼性厌氧菌，以芽孢的形态被动物摄入体内数小时后进入肠道，然后菌体和芽孢复苏，快速地大量分裂增殖，消耗游离氧[40]，通过对营养物质和小肠黏膜上皮细胞结合位点的争夺作用，在一定程度上减少有害病菌在肠道上的定植；另外，凝结芽孢杆菌将环境中的碳水化合物特别是乳糖通过生物发酵作用转化为乳酸，从而在小肠上皮细胞表面形成一层生物屏障，阻止有害细菌的接近，同时降低肠道内环境pH，抑制如大肠杆菌、沙门氏菌和肠球菌等致病菌的生长[3, 41-44]；此外凝结芽孢杆菌在其代谢繁殖过程中所分泌的大量抑制有害菌的凝固素和L-乳酸等抑菌物质[45-47]，也影响了有害细菌的繁殖，这几方面共同作用调节肠道内微生态的菌群平衡，从而有效地发挥凝结芽孢杆菌的益生功效，减少动物病害的发生。
4 结论肉鸡饲粮中添加凝结芽孢杆菌可抑制肠道中大肠杆菌的生长，刺激动物免疫器官的发育，降低肉鸡死淘率。
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