2. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室, 湖南省畜禽健康养殖工程技术研究中心, 长沙 410125;
3. 长沙兴嘉生物工程股份有限公司, 长沙 410011
, WANG Qinhua1,2, FAN Zhiyong1
, WU Xin1,2, WANG Shangchu3, PENG Hongxing3, YAO Yajun3, YIN Yulong1,2
2. Hunan Provincial Engineering Research Center of Healthy Livestock, Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
3. Xingjia Bio-Engineering Co. Ltd. Changsha 410011, China
作为一种无特异性的小分子高生物活性物，环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是生长激素、肾上腺素等多种激素的第二信使，在生物体内广泛存在[1]。cAMP是由外界信号(如某些激素或其他分子信号)刺激，激活腺苷酸环化酶催化ATP环化形成，它对酶活性[2]、基因表达[3]、离子通道活性[4]、细胞生长[5]等有重要影响，发挥着广泛的营养代谢调节作用，是一种有良好应用前景的动物生长调节剂。二丁酰环磷腺苷钙(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate-calcium, dbcAMP-Ca)作为cAMP的衍生物，当被机体吸收后，使得钙离子(Ca2+)释放并与钙调蛋白的结合加快，cAMP含量升高，同时可保证cAMP含量的相对稳定，因此它与cAMP-具有相同的生理功能，可通过活化cAMP-蛋白激酶系统使糖原磷酸化进而调控糖代谢[6]；也可以通过提高脂肪酶活性，调节脂类、蛋白质的代谢，这与动物所处的阶段的相关：在生长阶段其主要促进蛋白质的代谢，在育肥阶段以促进脂类代谢为主[7]。此外，dbcAMP-Ca作为一种生长调节剂，具有极性小，有亲脂性的特点，它可通过细胞膜在细胞内发挥作用，可通过饲粮添加使用，并且该物质在体内发挥作用后，多余的可被磷酸二酯酶分解，不会在体内造成残留，使用安全性更高[8-9]，且在动物体内的化学形式更为稳定。不过，目前关于dbcAMP-Ca对肥育猪生长和氨基酸代谢调控的研究比较少，因此，本试验主要研究了dbcAMP-Ca对肥育猪生长性能和血清生化指标的影响。
1 材料与方法 1.1 试验设计选取日龄和体重相近[(83.18±1.62) kg]、生长状况良好的“长×白×杜”三元杂交育肥猪18头，随机分成2组，每组9个重复，每个重复1头猪。
对照组饲喂基础饲粮，参照NRC (2012)进行设计，其组成及营养水平见表 1；试验组在基础饲粮中添加40 mg/kg dbcAMP-Ca (按98%的纯度折算成纯品添加量)。每天08:00和14:00饲喂2次，每头猪投料量在3.3 kg/d左右，自由采食和饮水。试验在湖南长沙兴嘉生物工程股份有限公司试验基地进行，试验持续30 d，严格按照猪场防疫和饲养管理制度进行操作。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
dbcAMP-Ca纯度为98%，由杭州美亚药业股份有限公司提供。
1.3 样品采集及指标检测 1.3.1 生长性能指标试验猪在空腹12 h条件下，记录试验开始和结束时的体重，并用自动饲喂系统记录试验期每头猪的采食量，计算日增重、日采食量和料重比。
1.3.2 血清生化指标试验结束后从试验组和对照组各随机选6头猪，空腹12 h进行前腔静脉采血10 mL，所采血样置于真空采血管中，室温下静置15 min后，4 000 r/min离心10 min，收集血清，分装于EP管中，每管5 mL，-80 ℃保存备用。
采用全自动血液生化指标测试仪测定生化指标，使用仪器为深圳迈瑞全自动生化分析仪BS-190，使用试剂为深圳迈瑞全自动生化分析仪相配套试剂盒。
1.3.3 血清游离氨基酸含量取血清300 μL，以1 : 1比例加入8%磺基水杨酸，振荡混匀，于4 ℃中静置8 h左右，10 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm滤膜至氨基酸上样瓶内管中，用L-8800型全自动氨基酸分析仪(Beckman公司)检测谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)和脯氨酸(Pro)等含量。
1.4 数据处理与分析试验数据用Microsoft Excel 2007进行统计，数据均以平均值±标准误(mean±SE)表示，用SAS 6.0软件进行独立样本t检验，对比试验组和对照组结果是否差异显著，统计显著性水平为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 dbcAMP-Ca对肥育猪生长性能的影响由表 2可知，试验组肥育猪生长性能与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。试验组日采食量提高了2.6%，日增重提高了30.12 g，料重比降低了0.01。
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表 2 dbcAMP-Ca对肥育猪生长性能的影响 Table 2 Effects of dbcAMP-Ca on growth performance of finishing pigs |
由表 3可知，与对照组相比，饲粮添加dbcAMP-Ca显著降低血清中乳酸脱氢酶(LDH)活性(P＜0.05)，降低了6.82%；显著提高血清中尿素含量(P＜0.05)，提高了49.35%。其他血清生化指标2组之间差异均不显著(P>0.05)
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表 3 dbcAMP-Ca对肥育猪血清生化指标的影响 Table 3 Effects of dbcAMP-Ca on serum biochemical indices of finishing pigs |
由表 4可知，与对照组相比，试验组血清Ser、Gly、Asp含量显著降低(P＜0.05)，而Thr、Val、Ile、Phe和Trp含量显著升高(P＜0.05)；其他氨基酸含量2组之间差异不显著(P＞0.05)。
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表 4 dbcAMP-Ca对肥育猪血清游离氨基酸含量的影响 Table 4 Effects of dbcAMP-Ca on the content of free amino acids in serum of finishing pigs |
作为cAMP的衍生物，dbcAMP-Ca具有相似的生理功能[10]。但二丁酰环腺苷酸(dbcAMP)具有极性小、有亲脂性的特点，可通过细胞膜在细胞内发挥作用，这克服了cAMP在使用上的缺陷，使其能够直接在饲料中添加使用。研究发现cAMP及其衍生物能够激活蛋白激酶，使代谢酶的活性加强，底物蛋白磷酸化，磷酸化的结果是组蛋白加速复制转录，酸性蛋白加强转录，从而促进核酸和mRNA合成，最终加强蛋白质的合成，从而明显改善动物的生产性能[11-12]。张富梅等[13]在肉鸡的试验研究中发现注射cAMP也能显著促进肉鸡的增重，提高饲料转化率。Navegantes等[14]通过提高鼠细胞内cAMP水平，能显著降低鼠骨骼肌中蛋白质水解酶的活性从而增加蛋白质的净沉积，提高瘦肉率。田允波[15]选用20 kg左右的杜×长二元杂交猪进行90 d试验，发现饲粮添加dbcAMP能显著提高生长育肥猪的日增重和胴体瘦肉率，显著降低料重比。冯尚连等[16]通过注射的方式向10 kg仔猪皮下注射cAMP，发现cAMP促动物生长作用明显。杨在清等[17]通过给猪皮下注射cAMP 1个月，对提高猪的日增重有非常明显的效果。
本试验研究结果发现，试验组与对照组相比在一定程度上改善了生长育肥的生长性能，但差异不显著，这与前人的研究结果不一致。分析其主要原因可能是：高士争等[7]在猪试验中所选用的猪体重都低于30 kg，处于生长阶段，主要为蛋白质的合成代谢，促生长作用明显；而本试验所选猪体重为83 kg左右，处于育肥阶段，添加dbcAMP-Ca主要促进脂肪的代谢，脂肪在皮下和腹腔内大量沉积，进而影响胴体品质，促蛋白质代谢作用较小，所以生长性能改善没前人研究结果那么明显。此外，严达伟等[18]通过在不同阶段猪试验中添加dbcAMP，也得到了与本试验相同的结果：在生长阶段可显著提高生长肥育猪日增重，料重比明显降低，促进动物的生长；肥育阶段促生长作用不显著，以促进脂肪分解为主，使体内脂肪沉积减少。
3.2 dbcAMP-Ca对肥育猪血清生化指标和游离氨基酸含量的影响猪血清生化指标的改变反映了机体新陈代谢机能发生改变和组织细胞通透性发生改变[19]。血清中LDH活性和尿素含量均可反映畜禽对糖类和蛋白质的代谢效率。LDH是动物体内参与糖酵解的重要酶类，其主要功能是催化丙酮酸脱氢生成乳酸[20]。尿素含量可准确地反映动物机体内蛋白质代谢和氨基酸之间的平衡状况，较低的尿素含量表明机体蛋白质合成率较高[21]。本试验研究结果发现，试验组血清LDH活性显著低于对照组，说明dbcAMP-Ca在猪育肥阶段可能对动物机体的糖酵解有抑制作用。试验组血清尿素含量显著高于对照组，这可能是与dbcAMP-Ca的功能相关，在育肥阶段dbcAMP-Ca主要促进脂肪组织代谢，而蛋白质代谢相对较缓慢，当机体在摄入充足的营养物质的情况下，在维持正常生长代谢时，血清白蛋白作为营养储备含量增加，流入代谢途径含量减少，减少了蛋白质沉积，因而导致血清尿素含量升高。Hahn等[22]的研究也发现，低浓度的尿素与高浓度相比，更容易促进肌肉的生长，这与本试验中生长性能无显著效果的结论相一致。
血清游离氨基酸与机体氨基酸的代谢及蛋白质沉积息息相关，其水平反映着动物的营养状况[23]。本试验结果发现，添加dbcAMP-Ca能够促进机体进行氨基酸的代谢，其中非必须氨基酸Ser、Gly、Asp含量显著低于对照组。Asp在动物体内的代谢途径主要通过脱氨生成草酰乙酸而促进三羧酸循环，是三羧酸循环中的重要成分；也与鸟氨酸循环密切相关，Asp在转氨酶的作用下产生草酰乙酸和Glu，Glu和其他氨基酸之间进行相互转化参与尿素的合成，担负着使血液中的氨转变为尿素排泄出去的部分工作[24]。本试验中试验组血清尿素含量高，可能与Asp促进鸟氨酸循环、最终生成尿素有关。此外，试验组必须氨基酸Thr含量显著高于对照组。Ser、Gly、Thr作为核苷酸代谢中3个重要的氨基酸，它们之间在酶的作用下可以相互转化。Ser在甲基转移酶的催化下，可以合成Gly；苏氨酸脱氢酶是Thr的主要降解酶，80%左右的Thr在脱氢酶途径，合成Gly；在可逆酶--丝氨酸羟甲基转移酶的作用下，Gly分解为Ser[25]。而本试验结果发现，Ser、Gly的含量降低，而Thr含量升高，可以推断Thr含量的升高有一部分可能是由于Ser、Gly转化而来的。Thr作为猪的第二或第三限制性氨基酸，它是构成体蛋白质的重要组成部分，同时还参与蛋白质的合成[26]，Thr的适宜剂量可以补充Gly的不足，另外Thr对采食量有一定的调节作用。许多研究已经证明Thr对氨基酸代谢有明显的影响[27-28]。而本试验中除Thr含量之外，支链氨基酸Val、Ile含量都显著提高，支链氨基酸具有氧化供能、促进蛋白质合成和抑制蛋白质降解的作用[29]，这些结果说明dbcAMP-Ca可能在一定程度影响了机体氨基酸的代谢，但具体机制有待进一步研究。
4 结论dbcAMP-Ca在一定程度上能改善育肥猪的生长性能，这与dbcAMP-Ca能够促进育肥猪氨基酸的代谢，显著影响与核苷酸代谢相关的血清Ser、Gly、Thr等生理氨基酸，以及显著提高Val、Ile等支链氨基酸以及Phe和Trp的含量有关。
| [1] | 张光磊, 欧阳富龙, 王勤华, 等. 二丁酰环腺苷酸的作用及其在猪生产中的应用[J]. 猪业科学, 2016 , 33 (3) :118 –120. |
| [2] | COHEN P. Protein phosphorylation and the control of glycogen metabolism in skeletal muscle[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B:Biological Sciences, 1983 , 302 (1108) : 13 –25. DOI: 10.1098/rstb.1983.0034 |
| [3] | ROESLER W J, VANDENBARK G R, HANSON R W. Cyclic AMP and the induction of eukaryotic gene transcription[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1988 , 263 (19) : 9063 –9066. |
| [4] | SCHMIDT M, EVELLIN S, WEERNINK P A O, et al. A new phospholipase-C-calcium signalling pathway mediated by cyclic AMP and a rap GTPase[J]. Nature Cell Biology, 2001 , 3 : 1020 –1024. DOI: 10.1038/ncb1101-1020 |
| [5] | GAGELIN C D, TORU-DELBAUFFE D, GAVARET J M, et al. Effects of cyclic AMP on components of the cell cycle machinery regulating DNA synthesis in cultured astrocytes[J]. Journal of Neurochemistry, 1999 , 73 (5) : 1799 –1805. |
| [6] | 尹革芬, 任晓慧, 刘松财, 等. 二丁酰环腺苷酸(dbcAMP)对猪生长及糖代谢的调控[J]. 中国兽医学报, 2003 , 23 (2) :180 –182. |
| [7] | 高士争, 任晓慧, 刘松财, 等. 二丁酰环腺苷酸(dbcAMP)对猪脂肪和蛋白质代谢的调控[J]. 中国兽医学报, 2004 , 24 (1) :62 –65. |
| [8] | 高士争, 张曦, 程美玲. 环腺苷酸的生物学作用与动物营养代谢调控[J]. 中国畜牧兽医, 2003 , 30 (6) :21 –23. |
| [9] | 高士争, 张曦, 刘勇, 等. 二丁酰环腺苷酸的合成与性质研究[J]. 中国畜牧杂志, 2004 , 40 (2) :16 –18, 25. |
| [10] | ANTONI F A. Molecular diversity of cyclic AMP signalling[J]. Frontiers in Neuroendocrinology, 2000 , 21 (2) : 103 –132. DOI: 10.1006/frne.1999.0193 |
| [11] | PAHAN K, KHAN M, SINGH I. Therapy for X-adrenoleukodystrophy:normalization of very long chain fatty acids and inhibition of induction of cytokines by cAMP[J]. Journal of Lipid Research, 1998 , 39 : 1091 –1100. |
| [12] | SARTIN J L, COLEMAN E S, STEELE B. Interaction of cyclic AMP-and calcium-dependent mechanisms in the regulation of growth hormone-releasing hormone-stimulated growth hormone release from ovine pituitary cells[J]. Domestic Animal Endocrinology, 1996 , 13 (3) : 229 –238. DOI: 10.1016/0739-7240(95)00069-0 |
| [13] | 张富梅, 薛瑞辰, 尹秀玲, 等. 外源性环腺苷酸对肉鸡生产性能的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2001 , 37 (3) :25 –26. |
| [14] | NAVEGANTES L C C, RESANO N M Z, MIGLIORINI R H, et al. Role of adrenoceptors and cAMP on the catecholamine-induced inhibition of proteolysis in rat skeletal muscle[J]. American Journal of Physiology:Endocrinology and Metabolism, 2000 , 279 (3) : E663 –E668. |
| [15] | 田允波. 环腺苷酸制剂对生长育肥猪生长性能和肉脂品质的影响[J]. 广西科学, 2003 , 10 (4) :305 –308. |
| [16] | 冯尚连, 李星, 朱建津, 等. 核苷酸和低聚糖对仔猪生产性能的影响[J]. 中国饲料, 2000 (17) :14 . |
| [17] | 杨在清, 金公亮, 鲁安太. 外源和内源性cAMP对猪肥育期脂质和蛋白质沉积的影响[J]. 西北农业学报, 1992 , 1 (4) :19 –22. |
| [18] | 严达伟, 张曦, 程美玲, 等. 二丁酰环腺苷酸制剂对猪生长及胴体组成的调控[J]. 饲料工业, 2004 , 25 (2) :14 –18. |
| [19] | 黄红英, 贺建华, 范志勇, 等. 母猪日粮中支链氨基酸水平对仔猪血清生化和部分免疫指标的影响[J]. 饲料工业, 2007 , 28 (21) :24 –26. |
| [20] | SCHUHMACHER U, GRUN E. Lactate dehydrogenase (LDH) and isoenzymes in pig liver during postnatal development[J]. Acta Biologica et Medica Germanica, 1977 , 36 (10) : 1369 –1377. |
| [21] | 周玉刚, 宁康健, 刘树全, 等. 发酵床饲养对育肥猪血液生化指标的影响[J]. 安徽农业大学学报, 2011 , 38 (2) :263 –266. |
| [22] | HAHN J D, BIEHL R R, BAKER D H. Ideal digestible lysine level for early-and late-finishing swine[J]. Journal of Animal Science, 1995 , 73 (3) : 773 –784. DOI: 10.2527/1995.733773x |
| [23] | LONGENECKER J B, HAUSE N L. Relationship between plasma amino acids and composition of the ingested protein[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959 , 84 (1) : 46 –59. DOI: 10.1016/0003-9861(59)90552-1 |
| [24] | BROSNAN M E, BROSNAN J T. Hepatic glutamate metabolism:a tale of 2 hepatocytes[J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 2009 , 90 (3) : 857S –861S. DOI: 10.3945/ajcn.2009.27462Z |
| [25] | 王薇薇.甘氨酸对仔猪生长及肠道功能影响的研究[D].博士学位论文.北京:中国农业大学, 2014. |
| [26] | LE FLOC'H N, SÈVE B, HENRY Y. The addition of glutamic acid or protein to a threonine-deficient diet differentially affects growth performance and threonine dehydrogenase activity in fattening pigs[J]. The Journal of Nutrition, 1994 , 124 (10) : 1987 –1995. |
| [27] | WESTERMEIER C. Feed intake and body weights of suckling sows and piglets in dependence of dietary threonine supplementation contribution about the threonine requirement of suckling pigs[J]. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 1998 , 79 (1) : 33 –45. |
| [28] | 张思聪, 张艳蕾, 李福昌. 苏氨酸的代谢及其营养生理作用[J]. 饲料研究, 2012 (7) :14 –16. |
| [29] | HEGER, VAN PHUNG T, KŘÍ ŽOVÁ L, et al. Efficiency of amino acid utilization in the growing pig at suboptimal levels of intake:branched-chain amino acids, histidine and phenylalanine+tyrosine[J]. Animal Physiology and Animal Nutrition, 2003 , 87 (1/2) : 52 –65. |